Name: a high-throughput platform for culture and 3d imaging of organoids
Uploaded: 2022-10-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids at JoVE.com

Het onderzoek wordt ondersteund door het CALIPSO-project dat wordt ondersteund door de National Research Foundation, Prime Minister's Office, Singapore, in het kader van het Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE) -programma. V.V. erkent de steun van NRF-onderzoeker NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI seed funding en ANR ADGastrulo. A.B. en G.G. erkennen de steun van de MBI-kernfinanciering. A.B. erkent Andor Technologies voor de bruikleen van de BC43 microscoop.

OPMERKING: Het eerste deel van dit protocol beschrijft de microfabricage van het celkweekapparaat. Een originele primaire mal met piramidale holtes kan in eigen huis worden geproduceerd - als microfabricagefaciliteiten beschikbaar zijn - of worden uitbesteed aan externe bedrijven. De primaire mal die in dit werk wordt gebruikt, wordt in eigen huis geproduceerd, met elders beschreven fabricageprocesstappen11,13. Een basisprotocol voor de microfabricage van de matr...

<ol>
	<li>Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Takebe, T., Wells James, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+by+design.">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li><li>Kratochvil, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+materials+for+organoid+systems.">Engineered materials for organoid systems.</a> Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).</li><li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+potential+in+organoid+research.">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li><li>O'Connell, L., Winter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+past+learning+and+future+directions.">Organoids: past learning and future directions.</a> Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).</li><li>Vives, J., Batlle-Morera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+developing+human+3D+organoids+into+medicines.">The challenge of developing human 3D organoids into medicines.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 72 (2020).</li><li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+challenges+of+patient-derived+organoids+in+guiding+the+multimodality+treatment+of+upper+gastrointestinal+malignancies.">The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies.</a> Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).</li><li>Lukonin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+landscape+of+intestinal+organoid+regeneration.">Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration.</a> Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).</li><li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+organoids:+a+bright+future+ahead.">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+high-+and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM.">3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li><li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+3D+imaging+method+for+quantitative+characterization+of+organoid+development+and+phenotype.">High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high-speed+3D+imaging+of+organoid+cultures+with+multi-scale+phenotypic+quantification.">Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification.</a> Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).</li></ol>

De procedure voor de fabricage van de microwellcultuurschaal, die organoïde cultuur en differentiatie met hoge dichtheid mogelijk maakt, is in dit artikel beschreven. Dankzij de geometrie en rangschikking van de microcaviteiten kunnen duizenden sferoïden gedurende lange tijd (enkele weken of langer) in een enkele plaat worden gekweekt en gekleurd met bijna geen verlies van materiaal. Ter vergelijking: een gebied van 4 mm x 2 mm op de celkweekplaat kan evenveel sferoïden bevatten als een enkele 384-well plaat met een o...

In organotypische 3D-celculturen, hierna organoïden genoemd, differentiëren stamcellen en organiseren ze zichzelf in ruimtelijke structuren die sterke morfologische en functionele overeenkomsten delen met echte organen. Organoïden bieden waardevolle modellen om de menselijke biologie en ontwikkeling buiten het lichaam te bestuderen 1,2,3. Er wordt een groeiend aantal modellen ontwikkeld die de lever, hersenen, nieren, longen en vele andere organen nabootsen 2,4,5. Differentiatie in organoïden wordt gestuurd door de toevoeging van oplosbare groeifactoren en een extracellulaire matrix in een precieze tijdsvolgorde. In schril contrast met organen is de ontwikkeling van organoïden echter vrij heterogeen.
Naast tal van biologische uitdagingen 6,7, vormen organoïde culturen ook technologische uitdagingen op het gebied van celkweekmethoden, karakterisering van transcriptomica en beeldvorming. In vivo orgaanontwikkeling vindt plaats in een biologische omgeving die resulteert in een zeer stereotiepe zelforganisatie van celarrangementen. Elke fenotypische verandering kan worden gebruikt als een proxy om een zieke toestand te diagnosticeren. Daarentegen ontwikkelen organoïden zich in vitro in minimaal gecontroleerde micro-omgevingen die compatibel zijn met celkweekomstandigheden, wat resulteert in grote variabiliteit in het ontwikkelingspad en de vormvorming voor elke individuele organoïde.
Een recente studie8 toonde aan dat kwantitatieve beeldvorming van organoïde vorm (fenotype descriptoren) gekoppeld aan de beoordeling van een paar genetische markers de definitie van fenotypische ontwikkelingslandschappen mogelijk maakt. Ongetwijfeld is het vermogen om de diversiteit van genomische expressie in organoïden te relateren aan hun fenotypische gedrag een belangrijke stap in de richting van het ontketenen van het volledige potentieel van organotypische culturen. Het smeekt dus om de ontwikkeling van speciale, high-content beeldvormingsbenaderingen die de karakterisering van organoïde kenmerken op subcellulaire, meercellige en geheel-organoïde schalen in 3D 9,10 mogelijk maken.
We ontwikkelden een veelzijdig high-content screening (HCS) platform dat gestroomlijnde organoïde cultuur mogelijk maakt (van geïsoleerde menselijke embryonale stamcellen [hESCs], door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen [hIPSC's], of primaire cellen naar 3D, meercellige, gedifferentieerde organoïden) en snelle, niet-invasieve 3D-beeldvorming. Het integreert een next-generation, geminiaturiseerd, 3D-celcultuurapparaat, de JeWells-chip (de chip hierna), dat duizenden goed gerangschikte microwells bevat, geflankeerd door 45 ° -spiegels die snelle, 3D-beeldvorming met hoge resolutie mogelijk maken door single-objective light-sheet microscopie11. Dit systeem is compatibel met elke standaard, commerciële, omgekeerde microscoop en maakt de beeldvorming van 300 organoïden in 3D mogelijk met subcellulaire resolutie in <1 uur.
De microfabricage van het celkweekapparaat vertrekt vanuit een bestaande microgestructureerde mal, die honderden micropyramiden bevat (figuur 1A) met een vierkante basis en zijwanden op 45° ten opzichte van de basis. Figuur 1C toont elektronenmicroscoop (EM) beelden van dergelijke structuren. De mal zelf is gemaakt van poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) en kan worden gemaakt als een replica gegoten van een primaire mal (hier niet weergegeven) met overeenkomstige kenmerken (als holtes) met behulp van standaard soft-lithografische procedures. De primaire mal kan door verschillende procedures worden geproduceerd. Degene die voor dit protocol werd gebruikt, werd gemaakt met behulp van silicium nat etsen zoals gerapporteerd in Galland et al. 11; de procedure voor de fabricage van de primaire mal is niet van cruciaal belang voor dit protocol. De piramides zijn gerangschikt in een vierkante array, met dezelfde toonhoogte voor de X- en Y-richting (in dit geval is de toonhoogte 350 μm).
Ter illustratie werden proof-of-concept experimenten12 gepubliceerd om aan te tonen dat de chip langdurige kweek (maanden) en differentiatieprotocollen mogelijk maakt, terwijl het aantal initiële cellen in de putten nauwkeurig wordt gedefinieerd. De individuele ontwikkeling van een groot aantal organoïden kan automatisch live worden gevolgd met behulp van standaard brightfield- en 3D-lichtplaatfluorescentiemicroscopen. Bovendien kunnen organoïden worden opgehaald om verder biologisch onderzoek uit te voeren (bijv. transcriptomische analyse). Dit artikel schetst gedetailleerde protocollen voor de fabricage van de celkweek coverslips, de zaai- en kleuringsprocedure voor fluorescentiemicroscopie, evenals het ophalen van de organoïden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>AA19397K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>AA19392K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC43 Benchtop Confocal Microscope</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>spinning disk confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>37525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered oxide etching solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>901621-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEE Spin Coater</td>
			<td>Brewer Science</td>
			<td>200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer AZ400K</td>
			<td>Merck</td>
			<td>18441223164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI Milliq water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Marienfled</td>
			<td>117650</td>
			<td>1.5H, round 25 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>BitPlane</td>
			<td></td>
			<td>image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Transmission optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TSF100-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsonic M</td>
			<td>Sartorius Stedium Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidure</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>CM5206</td>
			<td>bio-mimetic copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA73</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>17-345</td>
			<td>UV curable adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Thermofisher scientific&#160;</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Alexa Fluor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo Resist AZ5214E</td>
			<td>Merck</td>
			<td>14744719710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico Plasma tool</td>
			<td>Diener Electronic GmbH + Co. KG</td>
			<td>Pico Plasma</td>
			<td>For O2 plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.52</td>
			<td>Sunjin lab</td>
			<td>RC 152001</td>
			<td>water-soluble clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCT Hot Plate/Stirrer</td>
			<td>IKA (MY)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive Ion Etching tool</td>
			<td>Samco Inc. (JPN)</td>
			<td>RIE-10NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11875093</td>
			<td>culture medium for HCT116 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td>Polydimethylsiloxane or in short, PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td>CPX2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-KUB 2</td>
			<td>KLOE</td>
			<td></td>
			<td>UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV mask aligner</td>
			<td>SUSS Microtec Semiconductor (DE)</td>
			<td>MJB4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput platform for culture and 3d imaging of organoids

De karakterisering van een groot aantal driedimensionale (3D) organotypische culturen (organoïden) op verschillende resolutieschalen wordt momenteel beperkt door standaard beeldvormingsbenaderingen. Dit protocol beschrijft een manier om microgefabriceerde organoïde kweekchips te bereiden, die multiscale, 3D live imaging mogelijk maken op een gebruiksvriendelijk instrument dat minimale manipulaties vereist en in staat is tot 300 organoïden / h imaging-doorvoer. Deze kweekchips zijn compatibel met zowel lucht- als onderdompelingsdoelen (lucht, water, olie en siliconen) en een breed scala aan gangbare microscopen (bijv. Draaiende schijf, puntscanner confocal, breed veld en brightfield). Bovendien kunnen ze worden gebruikt met light-sheet modaliteiten zoals de single-objective, single-plane illumination microscopy (SPIM) technologie (soSPIM). 
Het hier beschreven protocol geeft gedetailleerde stappen voor de bereiding van de microgefabriceerde kweekchips en de kweek en kleuring van organoïden. Er is slechts een korte tijd nodig om vertrouwd te raken en verbruiksartikelen en apparatuur zijn gemakkelijk te vinden in normale biolabs. Hier zullen de 3D-beeldvormingsmogelijkheden alleen worden gedemonstreerd met commerciële standaardmicroscopen (bijv. Draaiende schijf voor 3D-reconstructie en wide field microscopie voor routinematige monitoring).

Figuur 8F toont het typische aspect van een celkweekdeksel na succesvolle fabricage. De UV-uithardende lijmlaag ziet er plat uit en hecht goed aan de coverslip. De overdracht van de kleeflaag op de coverslip kan mislukken als de laag op de coverslip overstroomt of als de verwijdering van het platte PDMS-substraat verkeerd gebeurt (zoals weergegeven in figuur 8G, H). In beide gevallen is de storing duidelijk omdat er geen getextureerde film wordt...

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids at JoVE.com

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Dit artikel presenteert een fabricageprotocol voor een nieuw type kweeksubstraat met honderden microcontainers per mm2, waarin organoïden kunnen worden gekweekt en waargenomen met behulp van microscopie met hoge resolutie. De protocollen voor het zaaien en immunostainen van cellen zijn ook gedetailleerd.

Een high-throughput platform voor cultuur en 3D-beeldvorming van organoïden

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Dit protocol demonstreert een microtextuur celkweekschaal ontworpen voor de groei van honderden organoïden met kennis van materiaal en volledig compatibel met microscopie. Onze techniek maakt het efficiënt mogelijk om duizenden organoïden te genereren, volledig compatibel met langetermijnbeeldvorming en celkweek op lange termijn. Dit protocol is van groot belang voor biomedische toepassingen zoals de pijplijn voor geneesmiddelenscreening en kankeronderzoeksdomeinen.De techniek die in dit protocol wordt gepresenteerd, is gemakkelijk onder de knie te krijgen na een paar pogingen van iedereen die ervaring heeft met laboratoriumprocedures en optische microscopie. Snijd om te beginnen kleine delen van de PDMS-mal tot de dimensie die nodig is voor het uiteindelijke apparaat. Knip ze parallel aan de XY-richtingen van de array.Plaats een van de voorbereide PDMS-maldobbelstenen met de voorkant naar beneden op het platte PDMS-gedeelte. Voeg vervolgens met een pipet ongeveer 0,1 tot 0,2 milliliter UV-uithardende lijm toe aan één kant van de mal. Volg de progressie van de vloeistof in de holte met behulp van een omgekeerde optische microscoop bij 10X vergroting.Stel de lijm bloot aan UV-licht om het uit te harden. Pas de belichtingstijd aan afhankelijk van de vermogensdichtheid van de UV-bron zoals beschreven in het tekstmanuscript. Gebruik de overtollige hoeveelheid lijm aan één rand en houd de uitgeharde lijm op het platte PDMS-substraat door er voorzichtig met een vinger op te drukken.Ondertussen knijp je met een pincet een hoek van de mal naast dezelfde rand die naar beneden wordt gehouden en pel je de mal langzaam af, terwijl je ervoor zorgt dat de getextureerde film niet wordt opgetild. Snijd de overtollige lijm en het PDMS-substraat bij met een scheermesje om de uitgeharde, getextureerde en kleeflaag plat op het PDMS te laten met het overtollige substraat slechts aan één rand. Behandel een schone coverslip met een kort zuurstofplasmaproces om de hydrofielheid te verbeteren.Na de plasmaactivering, spin coat de dunne laag UV-uithardende lijm door de coverslip op de vacuümhouder van een standaard spin coater te plaatsen en een kleine druppel lijm in het midden van de coverslip te gieten. Voer het spincoatingproces uit zoals beschreven in het tekstmanuscript. Als de spincoating niet beschikbaar is, laat u ongeveer 0,1 milliliter UV-uithardende lijm op een schone afdekplaat vallen met behulp van een pipet.Neem een tweede coverslip en plaats deze bovenop de eerste om de vloeibare lijm gelijkmatig tussen de twee coverslips te verspreiden. Zodra de lijm de rand van de coverslips heeft bereikt, scheidt u ze voorzichtig door ze over elkaar te schuiven. Eenmaal gescheiden, worden beide coverslips volledig gecoat met een dunne laag vloeibare lijm.Na het spincoaten, de lijm voorharden door blootstelling aan UV. Pas de blootstellingstijd aan, afhankelijk van de vermogensdichtheid van de gebruikte UV-bron. Neem een van de getextureerde films en plaats deze in contact met de zelfklevende gecoate coverslip. Zorg ervoor dat het contact tussen de gedeeltelijk uitgeharde lijm en de getextureerde film zo uniform mogelijk is.In dit stadium moet de lijm op de coverslip stevig genoeg zijn om opnieuw te laten stromen en kan het contact worden geoptimaliseerd door zachtjes op de coverslip te drukken. Stel de coverslips bloot aan UV-licht totdat de gecoate lijmlaag volledig is uitgehard. Dit zal de getextureerde film op de coverslip afdichten en lekvrije isolatie tussen de omtrekholtes bieden.Knijp vervolgens met een pincet het PDMS aan de rand waar het overtollige materiaal achterbleef na het trimmen en pel het PDMS platte substraat af. Met deze stap kan de getextureerde filmlaag zich hechten aan de coverslip met open toegang aan de bovenkant voor celzaaien. Voor het zaaien van cellen, op een apparaat dat is gepassiveerd met biometrisch copolymeer zoals beschreven in het manuscript, doseert u één milliliter steriel PBS in de petrischalen van de celcultuur van 35 millimeter.Ontgas de schaal met steriele PBS met behulp van de vacuümkamer gedurende 10 minuten, gevolgd door verschillende pipetteerrondes om alle bubbels te verwijderen. Vervang de PBS door steriel kweekmedium en steriliseer de plaat met UV-licht gedurende 30 minuten onder een celkweekkap. Bereid een celsuspensie voor door de aanbevelingen voor trypsinisatie of celsuspensievoorbereiding voor de cellen van belang te volgen, zoals beschreven in het tekstmanuscript.Tel en pas de celconcentratie aan tot 500.000 cellen per milliliter in het aanbevolen celkweekmedium. Verwijder de PBS-buffer uit de celkweekschaal van 35 millimeter en doseer vervolgens één milliliter van de aangepaste celsuspensie. Plaats de celkweekschaal gedurende 10 minuten terug in de celincubator.Ongeveer 80 tot 100 cellen zullen elke omtrekholte binnendringen. Na ongeveer 10 minuten incubatie, herstel de celkweekschaal uit de incubator en aspirateer voorzichtig de cellulaire suspensie om niet-gevangen cellen te verwijderen. Voeg een milliliter kweekmedium toe aan de kweekschaal en plaats deze terug in de celincubator.Optioneel, om de organoïden op te halen nadat ze in de putten zijn gegroeid, knijp de getextureerde kleeflaag op de snijrand met een pincet en pel deze voorzichtig af van de glazen afdekplaat, maar houd deze ondergedompeld in het medium. Het verhogen van de concentratie biometrisch copolymeer verhoogde de laagdikte. Volledige ontgassing van de celkweekschotels was essentieel om luchtbellen te verwijderen die vastzaten in de omtrekholtes.Organoïden werden gevormd na dag twee en 15 van kweken. De spinschijf confocale microscopie toonde representatieve beelden van de organoïden en een 3D-reconstructie. Bij het bereiden van de kweekschaal is het belangrijk om aandacht te besteden aan de montage van de mal of substraatstapel en om te zorgen voor een goed contact tussen de getextureerde film en de coverslip.De insluiting door onze microholten en de afwezigheid van materiaalverlies heeft de aandacht getrokken van onderzoekers in de ruimtebiologie die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van het effect van microzwaartekracht op organoïde homeostase.

Research

JoVE Journal

Biology

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

Een Multi-compartimenten CNS Neuron-glia Co-cultuur Microfluïdische Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical Diagnostics

Lensless On-chip Beeldvorming van cellen verschaft een nieuw instrument voor High-throughput Cell-Biologie en Medische Diagnostiek

Conventional optical microscopes image cells by use of objective lenses that work together with other lenses and optical components. While quite ...

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Een High Throughput Scherm voor Biomining cellulase activiteit van Metagenomic Bibliotheken

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemische en High Throughput microscopische beoordeling van Fat Mass in<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

High Throughput micro-injecties van Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

High-throughput beeldanalyse van bolvormige tumoren: Een gebruiksvriendelijke software Toepassing op de Grootte van Sferoïden Meet automatisch en nauwkeurig

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Herstel van de Adult zebravis Harten voor High-throughput Toepassingen

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analyse - Een High Throughput, Real Time PCR test voor Sc2.0 genotypering

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...