Name: a high-throughput platform for culture and 3d imaging of organoids
Uploaded: 2022-10-14T14:00:00
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Die Forschung wird durch das CALIPSO-Projekt unterstützt, das von der National Research Foundation, Büro des Premierministers, Singapur, im Rahmen ihres Programms Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE) unterstützt wird. V.V. bedankt sich für die Unterstützung des NRF-Ermittlers NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI-Seed-Finanzierung und ANR ADGastrulo. A.B. und G.G. bedanken sich für die Unterstützung durch die MBI-Grundfinanzierung. A.B. bedankt sich bei Andor Technologies für die Leihgabe des BC43-Mikroskops.

HINWEIS: Der erste Teil dieses Protokolls beschreibt die Mikrofabrikation des Zellkulturgeräts. Eine originale Primärform mit pyramidenförmigen Hohlräumen kann im eigenen Haus hergestellt werden - wenn Mikrofertigungsanlagen verfügbar sind - oder an externe Unternehmen ausgelagert werden. Die Primärform, die in dieser Arbeit verwendet wird, wird im eigenen Haus hergestellt, wobei die Herstellungsprozessschritte an anderer Stelle11,13 beschrieben sind. Ein g...

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	<li>Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Takebe, T., Wells James, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+by+design.">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li><li>Kratochvil, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+materials+for+organoid+systems.">Engineered materials for organoid systems.</a> Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).</li><li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+potential+in+organoid+research.">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li><li>O'Connell, L., Winter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+past+learning+and+future+directions.">Organoids: past learning and future directions.</a> Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).</li><li>Vives, J., Batlle-Morera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+developing+human+3D+organoids+into+medicines.">The challenge of developing human 3D organoids into medicines.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 72 (2020).</li><li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+challenges+of+patient-derived+organoids+in+guiding+the+multimodality+treatment+of+upper+gastrointestinal+malignancies.">The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies.</a> Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).</li><li>Lukonin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+landscape+of+intestinal+organoid+regeneration.">Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration.</a> Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).</li><li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+organoids:+a+bright+future+ahead.">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+high-+and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM.">3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li><li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+3D+imaging+method+for+quantitative+characterization+of+organoid+development+and+phenotype.">High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high-speed+3D+imaging+of+organoid+cultures+with+multi-scale+phenotypic+quantification.">Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification.</a> Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).</li></ol>

Das Verfahren zur Herstellung der Mikrotiterkulturschale, die eine hochdichte Organoidkultur und -differenzierung ermöglicht, wurde in dieser Arbeit beschrieben. Aufgrund der Geometrie und Anordnung der Mikrokavitäten können Tausende von Sphäroiden über lange Zeiträume (mehrere Wochen oder länger) nahezu ohne Materialverlust in einer einzigen Platte kultiviert und gefärbt werden. Zum Vergleich: Eine Fläche von 4 mm x 2 mm auf der Zellkulturplatte kann so viele Sphäroide enthalten wie eine einzelne 384-Well-Plat...

In organotypischen 3D-Zellkulturen, im Folgenden als Organoide bezeichnet, differenzieren sich Stammzellen und organisieren sich selbst zu räumlichen Strukturen, die starke morphologische und funktionelle Ähnlichkeiten mit realen Organen aufweisen. Organoide bieten wertvolle Modelle, um die menschliche Biologie und Entwicklung außerhalb des Körpers zu untersuchen 1,2,3. Es werden immer mehr Modelle entwickelt, die Leber, Gehirn, Niere, Lunge und viele andere Organe nachahmen 2,4,5. Die Differenzierung in Organoiden erfolgt durch die Zugabe von löslichen Wachstumsfaktoren und einer extrazellulären Matrix in einer präzisen zeitlichen Abfolge. Im Gegensatz zu Organen ist die Entwicklung von Organoiden jedoch recht heterogen.
Neben zahlreichen biologischen Herausforderungen 6,7 stellen Organoidkulturen auch technologische Herausforderungen in Bezug auf Zellkulturmethoden, Charakterisierung der Transkriptomik und Bildgebung dar. Die In-vivo-Organentwicklung findet in einer biologischen Umgebung statt, die zu einer hochgradig stereotypen Selbstorganisation von Zellanordnungen führt. Jede phänotypische Veränderung kann als Proxy verwendet werden, um einen erkrankten Zustand zu diagnostizieren. Im Gegensatz dazu entwickeln sich Organoide in vitro in minimal kontrollierten Mikroumgebungen, die mit Zellkulturbedingungen kompatibel sind, was zu einer großen Variabilität im Entwicklungspfad und in der Formbildung für jedes einzelne Organoid führt.
Eine aktuelle Studie8 zeigte, dass die quantitative Abbildung der Organoidform (Phänotyp-Deskriptoren) in Verbindung mit der Bewertung einiger genetischer Marker die Definition phänotypischer Entwicklungslandschaften ermöglicht. Die Fähigkeit, die Vielfalt der genomischen Expression in Organoiden mit ihrem phänotypischen Verhalten in Beziehung zu setzen, ist wohl ein wichtiger Schritt, um das volle Potenzial organotypischer Kulturen freizusetzen. Daher bittet es um die Entwicklung von dedizierten, hochinhaltlichen Bildgebungsansätzen, die die Charakterisierung von organoiden Merkmalen auf subzellulären, multizellulären und ganzorganoiden Skalen in 3D 9,10 ermöglichen.
Wir haben eine vielseitige High-Content-Screening-Plattform (HCS) entwickelt, die eine optimierte Organoidkultur (von isolierten humanen embryonalen Stammzellen [hESCs], humaninduzierten pluripotenten Stammzellen [hIPSCs] oder Primärzellen bis hin zu mehrzelligen, differenzierten 3D-Organoiden) und eine schnelle, nicht-invasive 3D-Bildgebung ermöglicht. Es integriert ein miniaturisiertes 3D-Zellkulturgerät der nächsten Generation, den sogenannten JeWells-Chip (im Folgenden der Chip ), der Tausende von gut angeordneten Mikrotiterplatten enthält, die von 45°-Spiegeln flankiert werden, die eine schnelle, hochauflösende 3D-Bildgebung durch Einzelobjektiv-Lichtblattmikroskopie ermöglichen11. Dieses System ist kompatibel mit jedem handelsüblichen, inversen Mikroskop und ermöglicht die Abbildung von 300 Organoiden in 3D mit subzellulärer Auflösung in <1 h.
Die Mikrofabrikation der Zellkulturvorrichtung geht von einer vorhandenen mikrostrukturierten Form aus, die Hunderte von Mikropyramiden (Abbildung 1A) mit einer quadratischen Basis und Seitenwänden in einem Winkel von 45° zur Basis enthält. Abbildung 1C zeigt elektronenmikroskopische (EM) Aufnahmen solcher Strukturen. Die Form selbst besteht aus Poly(dimethylsiloxan) (PDMS) und kann als Nachbildung einer Primärform (hier nicht gezeigt) mit entsprechenden Merkmalen (als Hohlräume) unter Verwendung von Standard-Soft-Lithographie-Verfahren hergestellt werden. Die Primärform kann durch verschiedene Verfahren hergestellt werden. Dasjenige, das für dieses Protokoll verwendet wurde, wurde unter Verwendung von Silizium-Nassätzen hergestellt, wie in Galland et al. berichtet. 11; Das Verfahren zur Herstellung der Primärform ist für dieses Protokoll nicht kritisch. Die Pyramiden sind in einem quadratischen Array angeordnet, mit dem gleichen Abstand für die X- und Y-Richtung (in diesem Fall beträgt der Abstand 350 μm).
Zur Veranschaulichung wurden Proof-of-Concept-Experimente12 veröffentlicht, um zu zeigen, dass der Chip Langzeitkultur- (Monate) und Differenzierungsprotokolle ermöglicht und gleichzeitig die Anzahl der Anfangszellen in den Vertiefungen genau definiert. Die individuelle Entwicklung einer großen Anzahl von Organoiden kann mit Standard-Hellfeld- und 3D-Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopen automatisch live überwacht werden. Darüber hinaus können Organoide für weitere biologische Untersuchungen (z.B. Transkriptomanalysen) gewonnen werden. In diesem Artikel werden detaillierte Protokolle für die Herstellung der Zellkultur-Deckgläser, das Seeding- und Färbeverfahren für die Fluoreszenzmikroskopie sowie die Gewinnung der Organoide beschrieben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>AA19397K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>AA19392K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC43 Benchtop Confocal Microscope</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>spinning disk confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>37525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered oxide etching solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>901621-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEE Spin Coater</td>
			<td>Brewer Science</td>
			<td>200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer AZ400K</td>
			<td>Merck</td>
			<td>18441223164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI Milliq water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Marienfled</td>
			<td>117650</td>
			<td>1.5H, round 25 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>BitPlane</td>
			<td></td>
			<td>image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Transmission optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TSF100-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsonic M</td>
			<td>Sartorius Stedium Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidure</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>CM5206</td>
			<td>bio-mimetic copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA73</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>17-345</td>
			<td>UV curable adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Thermofisher scientific&#160;</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Alexa Fluor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo Resist AZ5214E</td>
			<td>Merck</td>
			<td>14744719710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico Plasma tool</td>
			<td>Diener Electronic GmbH + Co. KG</td>
			<td>Pico Plasma</td>
			<td>For O2 plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.52</td>
			<td>Sunjin lab</td>
			<td>RC 152001</td>
			<td>water-soluble clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCT Hot Plate/Stirrer</td>
			<td>IKA (MY)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive Ion Etching tool</td>
			<td>Samco Inc. (JPN)</td>
			<td>RIE-10NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11875093</td>
			<td>culture medium for HCT116 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td>Polydimethylsiloxane or in short, PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td>CPX2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-KUB 2</td>
			<td>KLOE</td>
			<td></td>
			<td>UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV mask aligner</td>
			<td>SUSS Microtec Semiconductor (DE)</td>
			<td>MJB4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput platform for culture and 3d imaging of organoids

Die Charakterisierung einer großen Anzahl von dreidimensionalen (3D) organotypischen Kulturen (Organoiden) auf unterschiedlichen Auflösungsskalen ist derzeit durch Standard-Bildgebungsansätze begrenzt. Dieses Protokoll beschreibt eine Möglichkeit zur Herstellung von mikrofabrizierten Organoid-Kulturchips, die eine Multiskalen-3D-Live-Bildgebung auf einem benutzerfreundlichen Instrument ermöglichen, das minimale Manipulationen erfordert und einen Bilddurchsatz von bis zu 300 Organoiden pro Stunde ermöglicht. Diese Kulturchips sind sowohl mit Luft- als auch mit Immersionsobjektiven (Luft, Wasser, Öl und Silikon) und einer Vielzahl gängiger Mikroskope (z. B. rotierende Scheibe, Punktscanner konfokal, Weitfeld und Hellfeld) kompatibel. Darüber hinaus können sie mit Light-Sheet-Modalitäten wie der Single-Objective, Single-Plane-Illumination-Mikroskopie-Technologie (SPIM) (soSPIM) verwendet werden. 
Das hier beschriebene Protokoll enthält detaillierte Schritte für die Herstellung der mikrofabrizierten Kulturchips und die Kultur und Färbung von Organoiden. Es ist nur eine kurze Zeit erforderlich, um sich daran zu gewöhnen, und Verbrauchsmaterialien und Geräte können in normalen Biolaboren leicht gefunden werden. Hier werden die 3D-Bildgebungsmöglichkeiten nur mit kommerziellen Standardmikroskopen demonstriert (z. B. Spinning Disk für die 3D-Rekonstruktion und Weitfeldmikroskopie für die Routineüberwachung).

Abbildung 8F zeigt das typische Aussehen eines Zellkulturdeckglases nach erfolgreicher Herstellung. Die UV-härtende Klebeschicht wirkt flach und haftet gut auf dem Deckglas. Die Übertragung der Klebeschicht auf dem Deckglas kann fehlschlagen, wenn die Schicht auf dem Deckglas übermäßig ausgehärtet ist oder wenn das Entfernen des flachen PDMS-Substrats nicht korrekt erfolgt (wie in Abbildung 8G,H dargestellt). In beiden Fällen ist der Fehl...

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A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

In dieser Arbeit wird ein Herstellungsprotokoll für eine neue Art von Kultursubstrat mit Hunderten von Mikrobehältern promm2 vorgestellt, in dem Organoide kultiviert und mittels hochauflösender Mikroskopie beobachtet werden können. Die Zellimpf- und Immunfärbungsprotokolle sind ebenfalls detailliert.

Eine Hochdurchsatzplattform für Kultur und 3D-Bildgebung von Organoiden

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Dieses Protokoll zeigt eine Mikrotextur-Zellkulturschale, die für das Wachstum von Hunderten von Organoiden mit Materialkenntnissen entwickelt wurde und vollständig mit der Mikroskopie kompatibel ist. Unsere Technik ermöglicht es, Tausende von Organoiden effizient zu erzeugen, die vollständig mit Langzeitbildgebung und Langzeitzellkultur kompatibel sind. Dieses Protokoll ist von großem Interesse für biomedizinische Anwendungen wie die Screening-Pipeline von Medikamenten und die Krebsforschung.Die Technik, die in diesem Protokoll vorgestellt wird, ist nach einigen Versuchen von jedem, der Erfahrung mit Laborverfahren und optischer Mikroskopie hat, leicht zu beherrschen. Schneiden Sie zunächst kleine Teile der PDMS-Form auf die für das endgültige Gerät erforderliche Größe zu. Schneiden Sie sie parallel zu den XY-Richtungen des Arrays.Legen Sie einen der vorbereiteten PDMS-Formwürfel mit der Vorderseite nach unten auf den flachen PDMS-Abschnitt. Fügen Sie dann mit einer Pipette etwa 0,1 bis 0,2 Milliliter UV-härtenden Klebstoff auf eine Seite der Form auf. Verfolgen Sie den Verlauf der Flüssigkeit im Inneren des Hohlraums mit einem inversen Lichtmikroskop bei 10-facher Vergrößerung.Setzen Sie den Klebstoff UV-Licht aus, um ihn auszuhärten. Passen Sie die Belichtungszeit in Abhängigkeit von der Leistungsdichte der UV-Quelle an, wie im Textmanuskript beschrieben. Halten Sie den ausgehärteten Klebstoff mit der überschüssigen Klebstoffmenge an einer Kante auf dem flachen PDMS-Substrat, indem Sie ihn vorsichtig mit einem Finger drücken.In der Zwischenzeit drücken Sie mit einer Pinzette eine Ecke der Form neben der gleichen Kante, die gedrückt wird, und ziehen Sie die Form langsam ab, während Sie sicherstellen, dass der strukturierte Film nicht angehoben wird. Schneiden Sie den überschüssigen Klebstoff und das PDMS-Substrat mit einer Rasierklinge ab, um die ausgehärtete, strukturierte und adhäsive Schicht flach auf dem PDMS zu belassen, wobei sich das überschüssige Substrat nur auf einer Kante befindet. Behandeln Sie ein sauberes Deckglas mit einem kurzen Sauerstoffplasmaprozess, um seine Hydrophilie zu verbessern.Nach der Plasmaaktivierung beschichten Sie die dünne Schicht des UV-härtenden Klebstoffs, indem Sie das Deckglas auf das Vakuumspannfutter eines Standard-Spin-Coaters legen und einen kleinen Tropfen Klebstoff in die Mitte des Deckglases gießen. Führen Sie den Schleuderbeschichtungsprozess wie im Textmanuskript beschrieben durch. Wenn keine Schleuderbeschichtung verfügbar ist, geben Sie mit einer Pipette etwa 0,1 Milliliter UV-härtenden Klebstoff auf ein sauberes Deckglas.Nehmen Sie ein zweites Deckglas und legen Sie es auf das erste, damit sich der flüssige Klebstoff gleichmäßig zwischen den beiden Deckgläsern verteilt. Sobald der Klebstoff den Rand der Deckgläser erreicht hat, trennen Sie sie vorsichtig, indem Sie sie übereinander schieben. Nach dem Trennen werden beide Deckgläser vollständig mit einer dünnen Schicht Flüssigkleber überzogen.Nach dem Schleudern härten Sie den Klebstoff unter UV-Einwirkung vor. Passen Sie die Belichtungszeit in Abhängigkeit von der Leistungsdichte der verwendeten UV-Quelle an. Nehmen Sie eine der strukturierten Folien und bringen Sie sie in Kontakt mit dem selbstklebenden, beschichteten Deckglas. Achten Sie darauf, dass der Kontakt zwischen dem teilausgehärteten Klebstoff und der strukturierten Folie so gleichmäßig wie möglich ist.In diesem Stadium sollte der Klebstoff auf dem Deckglas fest genug sein, um ein Wiederfließen zu vermeiden, und der Kontakt kann durch vorsichtiges Drücken auf das Deckglas optimiert werden. Setzen Sie die Deckgläser UV-Licht aus, bis die beschichtete Klebeschicht vollständig ausgehärtet ist. Dadurch wird die strukturierte Folie auf dem Deckglas versiegelt und eine auslaufsichere Isolierung zwischen den Perimeterhohlräumen gewährleistet.Drücken Sie dann mit einer Pinzette das PDMS an der Kante zusammen, an der das überschüssige Material nach dem Trimmen zurückgeblieben ist, und ziehen Sie das flache PDMS-Substrat ab. Dieser Schritt ermöglicht es, dass die texturierte Filmschicht auf dem Deckglas haftet, mit offenem Zugang an der Oberseite für die Zellaussaat. Vor der Zellaussaat wird auf einem mit biometrischem Copolymer passivierten Gerät, wie im Manuskript beschrieben, ein Milliliter steriles PBS in die 35-Millimeter-Zellkultur-Petrischalen gegeben.Entgasen Sie die Schale mit sterilem PBS in der Vakuumkammer für 10 Minuten, gefolgt von mehreren Pipettierrunden, um alle Blasen zu entfernen. Ersetzen Sie das PBS durch steriles Kulturmedium und sterilisieren Sie die Platte mit UV-Licht für 30 Minuten unter einer Zellkulturhaube. Bereiten Sie eine Zellsuspension vor, indem Sie die Empfehlungen zur Trypsinisierung oder Zellsuspensionsvorbereitung für die interessierenden Zellen befolgen, wie im Textmanuskript beschrieben.Zählen und stellen Sie die Zellkonzentration auf 500.000 Zellen pro Milliliter im empfohlenen Zellkulturmedium ein. Entfernen Sie den PBS-Puffer aus der 35-Millimeter-Zellkulturschale und geben Sie anschließend einen Milliliter der eingestellten Zellsuspension ab. Legen Sie die Zellkulturschale für 10 Minuten zurück in den Zellinkubator.Ungefähr 80 bis 100 Zellen treten in jeden Perimeterhohlraum ein. Nach ca. 10 Minuten Inkubation die Zellkulturschale aus dem Inkubator entnehmen und die Zellsuspension vorsichtig absaugen, um nicht eingeschlossene Zellen zu entfernen. Geben Sie einen Milliliter Kulturmedium in die Kulturschale und legen Sie sie zurück in den Zellinkubator.Um die Organoide zu gewinnen, nachdem sie in den Vertiefungen gewachsen sind, klemmen Sie die strukturierte Klebeschicht mit einer Pinzette auf die Schnittkante und ziehen Sie sie vorsichtig vom Glasdeckglas ab, lassen Sie sie jedoch in das Medium eingetaucht. Die Erhöhung der Konzentration von biometrischem Copolymer erhöhte die Schichtdicke. Eine vollständige Entgasung der Zellkulturschalen war unerlässlich, um die in den Umfassungshohlräumen eingeschlossenen Luftblasen zu entfernen.Organoide wurden nach dem zweiten und 15. Tag der Kultivierung gebildet. Die konfokale Spinning-Disc-Mikroskopie zeigte repräsentative Bilder der Organoide und eine 3D-Rekonstruktion. Bei der Zubereitung der Kulturschale ist es wichtig, auf die Montage der Form oder des Substratstapels zu achten und auf einen guten Kontakt zwischen der strukturierten Folie und dem Deckglas zu achten.Die Eindämmung durch unsere Mikrohohlräume und das Fehlen von Materialverlust hat die Aufmerksamkeit von Weltraumbiologieforschern auf sich gezogen, die daran interessiert sind, die Wirkung der Schwerelosigkeit auf die homöostase von Organoiden zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biology

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

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We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Forschung

Biologie

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Ohne Linsen auskommt, On-Chip-Bildgebung von Zellen hat ein neues Instrument für High-Throughput-Zell-Biologie und der medizinischen Diagnostik

Conventional optical microscopes image cells by use of objective lenses that work together with other lenses and optical components. While quite ...

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Ein High-Throughput-Screen für Biomining Cellulase Aktivität von Metagenombanken

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

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The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

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Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

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Hochdurchsatz-Analyse von Bild Tumorsphäroide: Eine benutzerfreundliche Software-Anwendung, um die Größe der Sphäroide automatisch und präzise messen

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Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

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High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

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qPCRTag Analyse - ein hoher Durchsatz, Echtzeit-PCR-Assay für Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...