Name: a high-throughput platform for culture and 3d imaging of organoids
Uploaded: 2022-10-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids at JoVE.com

המחקר נתמך על ידי פרויקט CALIPSO הנתמך על ידי קרן המחקר הלאומית, משרד ראש הממשלה, סינגפור, במסגרת תוכנית קמפוס למצוינות במחקר ויזמות טכנולוגית (CREATE). V.V. מודה על תמיכתם של חוקר NRF NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, מימון סיד MBI ו- ANR ADGastrulo. א.ב. וג.ג. מודים על התמיכה ממימון הליבה של MBI. א.ב. מודה לאנדור טכנולוגיות על השאלת המיקרוסקופ BC43.

הערה: החלק הראשון של פרוטוקול זה מפרט את המיקרו-פבריקציה של התקן תרבית התא. עובש ראשוני מקורי עם חללים פירמידליים יכול להיות מיוצר בבית - אם מתקני מיקרו ייצור זמינים - או במיקור חוץ לחברות חיצוניות. התבנית העיקרית המשמשת בעבודה זו מיוצרת בתוך הבית, עם שלבי תהליך הייצור המתוארים במקום אחר<sup c...

<ol>
	<li>Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Takebe, T., Wells James, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+by+design.">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li><li>Kratochvil, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+materials+for+organoid+systems.">Engineered materials for organoid systems.</a> Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).</li><li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+potential+in+organoid+research.">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li><li>O'Connell, L., Winter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+past+learning+and+future+directions.">Organoids: past learning and future directions.</a> Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).</li><li>Vives, J., Batlle-Morera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+developing+human+3D+organoids+into+medicines.">The challenge of developing human 3D organoids into medicines.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 72 (2020).</li><li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+challenges+of+patient-derived+organoids+in+guiding+the+multimodality+treatment+of+upper+gastrointestinal+malignancies.">The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies.</a> Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).</li><li>Lukonin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+landscape+of+intestinal+organoid+regeneration.">Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration.</a> Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).</li><li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+organoids:+a+bright+future+ahead.">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+high-+and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM.">3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li><li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+3D+imaging+method+for+quantitative+characterization+of+organoid+development+and+phenotype.">High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high-speed+3D+imaging+of+organoid+cultures+with+multi-scale+phenotypic+quantification.">Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification.</a> Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).</li></ol>

ההליך לייצור צלחת תרבית המיקרווול, המאפשרת תרבית אורגנואידים בצפיפות גבוהה והתמיינות, תואר במאמר זה. בשל הגיאומטריה והסידור של המיקרו-חללים, אלפי ספרואידים ניתנים לתרבית ולהכתמה בצלחת אחת לפרקי זמן ארוכים (מספר שבועות או יותר) כמעט ללא אובדן חומר. לשם השוואה, שטח של 4 מ"מ x 2 מ"מ על צלחת תרבית...

בתרביות תאים תלת-ממדיות אורגנוטיפיות, המכונות להלן אורגנואידים, תאי גזע מתמיינים ומתארגנים בעצמם למבנים מרחביים החולקים דמיון מורפולוגי ותפקודי חזק עם איברים אמיתיים. אורגנואידים מציעים מודלים יקרי ערך לחקר הביולוגיה האנושית והתפתחות מחוץ לגוף 1,2,3. מספר גדל והולך של מודלים מפותחים המחקים את הכבד, המוח, הכליות, הריאות ואיברים רבים אחרים 2,4,5. התמיינות באורגנואידים מכוונת על ידי תוספת של גורמי גדילה מסיסים ומטריצת חוץ תאיים ברצף זמן מדויק. עם זאת, בניגוד בולט לאיברים, התפתחות אורגנואידים היא הטרוגנית למדי.
מעבר לאתגרים ביולוגיים רבים6,7, תרביות אורגנואידים מציבות אתגרים טכנולוגיים גם מבחינת שיטות תרביות תאים, אפיון שעתוק והדמיה. התפתחות איברים In vivo מתרחשת בסביבה ביולוגית הגורמת לארגון עצמי סטריאוטיפי ביותר של סידורי תאים. כל שינוי פנוטיפי יכול לשמש כפרוקסי לאבחון מצב חולה. לעומת זאת, אורגנואידים מתפתחים במבחנה במיקרו-סביבות מבוקרות מינימליות התואמות לתנאי תרבית תאים, וכתוצאה מכך נוצרת שונות גדולה בנתיב ההתפתחות ובהיווצרות הצורה עבור כל אורגנואיד בודד.
מחקר8 שנערך לאחרונה הראה כי הדמיה כמותית של צורת אורגנואידים (מתארי פנוטיפ) בשילוב עם הערכה של כמה סמנים גנטיים מאפשרים הגדרה של נופי התפתחות פנוטיפיים. ניתן לטעון כי היכולת לקשר בין מגוון הביטוי הגנומי באורגנואידים לבין התנהגותם הפנוטיפית היא צעד חשוב לקראת שחרור מלוא הפוטנציאל של תרבויות אורגנוטיפיות. לפיכך, היא מבקשת לפתח גישות הדמיה ייעודיות בעלות תוכן גבוה המאפשרות אפיון תכונות אורגנואידים בקנה מידה תת-תאי, רב-תאי ואורגנואיד שלם בתלת-ממד 9,10.
פיתחנו פלטפורמה רב-תכליתית לסינון תוכן גבוה (HCS) המאפשרת תרבית אורגנואידים יעילה (החל מתאי גזע עובריים אנושיים מבודדים [hESCs], תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם [hIPSCs], או תאים ראשוניים ועד אורגנואידים תלת-ממדיים, רב-תאיים ומובחנים) והדמיה תלת-ממדית מהירה ולא פולשנית. הוא משלב מכשיר תרבית תאים תלת-ממדי ממוזער מהדור הבא, הנקרא שבב JeWells ( השבב להלן), המכיל אלפי מיקרו-בארות ערוכות היטב ומשני צדיהן מראות 45° המאפשרות הדמיה מהירה, תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ אור11 חד-אובייקטיבי. מערכת זו, התואמת לכל מיקרוסקופ הפוך מסחרי סטנדרטי, מאפשרת הדמיה של 300 אורגנואידים בתלת-ממד ברזולוציה תת-תאית תוך <1 שעות.
המיקרו-ייצור של התקן תרבית התאים מתחיל מתבנית מיקרו-מובנית קיימת, שמכילה מאות מיקרו-פירמידות (איור 1A) עם בסיס מרובע ודפנות צדדיות ב-45° ביחס לבסיס. איור 1C מראה תמונות של מבנים כאלה במיקרוסקופ אלקטרונים (EM). התבנית עצמה עשויה פולי(דימתילסילוקסן) (PDMS) וניתן ליצור אותה כהעתק של תבנית ראשונית (לא מוצגת כאן) עם תכונות מתאימות (כחללים) באמצעות הליכים ליתוגרפיים רכים סטנדרטיים. התבנית העיקרית יכולה להיות מיוצרת על ידי הליכים שונים. זה ששימש לפרוטוקול זה נעשה באמצעות תחריט רטוב סיליקון כפי שדווח Galland et al. 11; הליך ייצור התבנית הראשונית אינו קריטי לפרוטוקול זה. הפירמידות מסודרות במערך בריבוע, עם אותו גובה עבור כיווני X ו- Y (במקרה זה המגרש הוא 350 מיקרומטר).
לשם המחשה, פורסמו ניסויי הוכחת היתכנות12 כדי להדגים כי השבב מאפשר תרבית ארוכת טווח (חודשים) ופרוטוקולי התמיינות תוך הגדרה מדויקת של מספר התאים הראשוניים בבארות. פיתוח אישי של מספר רב של אורגנואידים יכול להיות מנוטר באופן אוטומטי בשידור חי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי של שדה בהיר וגיליון אור תלת-ממדי. יתר על כן, ניתן לאחזר אורגנואידים כדי לבצע חקירות ביולוגיות נוספות (למשל, אנליזה תעתיקית). מאמר זה מתאר פרוטוקולים מפורטים לייצור כיסויי תרבית תאים, הליך הזריעה והצביעה במיקרוסקופ פלואורסצנטי, כמו גם שליפת האורגנואידים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>AA19397K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>AA19392K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC43 Benchtop Confocal Microscope</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>spinning disk confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>37525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered oxide etching solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>901621-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEE Spin Coater</td>
			<td>Brewer Science</td>
			<td>200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer AZ400K</td>
			<td>Merck</td>
			<td>18441223164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI Milliq water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Marienfled</td>
			<td>117650</td>
			<td>1.5H, round 25 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>BitPlane</td>
			<td></td>
			<td>image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Transmission optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TSF100-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsonic M</td>
			<td>Sartorius Stedium Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidure</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>CM5206</td>
			<td>bio-mimetic copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA73</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>17-345</td>
			<td>UV curable adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Thermofisher scientific&#160;</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Alexa Fluor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo Resist AZ5214E</td>
			<td>Merck</td>
			<td>14744719710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico Plasma tool</td>
			<td>Diener Electronic GmbH + Co. KG</td>
			<td>Pico Plasma</td>
			<td>For O2 plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.52</td>
			<td>Sunjin lab</td>
			<td>RC 152001</td>
			<td>water-soluble clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCT Hot Plate/Stirrer</td>
			<td>IKA (MY)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive Ion Etching tool</td>
			<td>Samco Inc. (JPN)</td>
			<td>RIE-10NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11875093</td>
			<td>culture medium for HCT116 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td>Polydimethylsiloxane or in short, PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td>CPX2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-KUB 2</td>
			<td>KLOE</td>
			<td></td>
			<td>UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV mask aligner</td>
			<td>SUSS Microtec Semiconductor (DE)</td>
			<td>MJB4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput platform for culture and 3d imaging of organoids

אפיון מספר רב של תרביות אורגנוטיפיות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) בסקאלות רזולוציה שונות מוגבל כיום על ידי גישות הדמיה סטנדרטיות. פרוטוקול זה מתאר דרך להכין שבבי תרבית אורגנואידים מיקרו-מפוברקים, המאפשרים הדמיה חיה תלת-ממדית בקנה מידה רב-ממדי במכשיר ידידותי למשתמש הדורש מניפולציות מינימליות ומסוגל לתפוקת הדמיה של עד 300 אורגנואידים/שעה. שבבי תרבית אלה תואמים הן למטרות אוויר והן למטרות טבילה (אוויר, מים, שמן וסיליקון) ולמגוון רחב של מיקרוסקופים נפוצים (למשל, דיסק מסתובב, סורק נקודתי קונפוקלי, שדה רחב ושדה בהיר). יתר על כן, ניתן להשתמש בהם עם שיטות גיליון אור כגון טכנולוגיית מיקרוסקופ הארה חד-אובייקטיבי וחד-מישורי (SPIM) (soSPIM). 
הפרוטוקול המתואר כאן נותן צעדים מפורטים להכנת שבבי התרבית המיקרו-מפוברקים ולתרבית והצביעה של אורגנואידים. רק פרק זמן קצר נדרש כדי להכיר, וניתן למצוא בקלות חומרים מתכלים וציוד במעבדות ביולוגיות רגילות. כאן, יכולות ההדמיה התלת-ממדית יודגמו רק באמצעות מיקרוסקופים סטנדרטיים מסחריים (למשל, דיסק מסתובב לשחזור תלת-ממדי ומיקרוסקופ שדה רחב לניטור שגרתי).

איור 8F מראה את ההיבט הטיפוסי של כיסוי תרבית תאים לאחר ייצור מוצלח. שכבת הדבק הניתנת לריפוי UV נראית שטוחה ונדבקת היטב לכיסוי. העברת שכבת הדבק על תלוש הכיסוי עלולה להיכשל אם השכבה שעל הכיסוי מרומרת יתר על המידה, או אם הסרת מצע ה-PDMS השטוח נעשית באופן שגוי (כפי שמוצג ב...

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids at JoVE.com

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

מאמר זה מציג פרוטוקול ייצור לסוג חדש של מצע תרבית עם מאות מיקרו-מיכלים למ"מ2, שבו ניתן לגדל אורגנואידים בתרבית ולצפות בהם באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. פרוטוקולי זריעת התאים ומערכת החיסון מפורטים גם הם.

פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה לתרבית והדמיה תלת-ממדית של אורגנואידים

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

פרוטוקול זה מדגים צלחת תרבית תאים מיקרומרקמית שתוכננה לגידול של מאות אורגנואידים בעלי ידע בחומר והתאמה מלאה למיקרוסקופיה. הטכניקה שלנו מאפשרת ביעילות לייצר אלפי אורגנואידים, בהתאמה מלאה לדימות ארוך טווח ולתרבית תאים לטווח ארוך. פרוטוקול זה הוא בעל עניין רב עבור יישומים ביו-רפואיים כגון צנרת סינון תרופות ותחומי מחקר הסרטן.קל לשלוט בטכניקה המוצגת בפרוטוקול זה לאחר מספר ניסיונות של כל מי שיש לו ניסיון עם הליכי מעבדה ומיקרוסקופ אופטי. כדי להתחיל, לחתוך חלקים קטנים של תבנית PDMS לממד הדרוש עבור המכשיר הסופי. חותכים אותם במקביל לכיווני XY של המערך.הניחו את אחת הקוביות המוכנות של תבנית PDMS עם הפנים כלפי מטה על החלק השטוח של PDMS. לאחר מכן באמצעות פיפטה, להוסיף כ 0.1 עד 0.2 מיליליטר של דבק UV לריפוי בצד אחד של התבנית. עקבו אחר התקדמות הנוזל בתוך החלל באמצעות מיקרוסקופ אופטי הפוך בהגדלה של פי 10.חשוף את הדבק לאור UV כדי לרפא אותו. התאם את זמן החשיפה בהתאם לצפיפות ההספק של מקור UV כמתואר בכתב היד של הטקסט. בעזרת הכמות העודפת של הדבק בקצה אחד, החזיקו את הדבק שנרפא על מצע PDMS השטוח על ידי לחיצה עדינה עליו עם אצבע.בינתיים, בעזרת פינצטה, צבטו פינה אחת של התבנית ליד אותו קצה המוחזק כלפי מטה וקילפו לאט את התבנית, תוך הקפדה על כך שהסרט בעל המרקם לא מורם. חתכו את עודפי הדבק ואת מצע ה-PDMS באמצעות סכין גילוח כדי להשאיר את שכבת הדבק, המרקם והדבק שטוחה על ה-PDMS עם המצע העודף בקצה אחד בלבד. טפל בכיסוי נקי עם תהליך פלזמה חמצן קצר כדי לשפר את ההידרופיליות שלו.לאחר הפעלת הפלזמה, יש לצפות את השכבה הדקה של דבק UV הניתן לריפוי על ידי הנחת הכיסוי על צ'אק הוואקום של מעיל ספין סטנדרטי ולשפוך טיפה קטנה של דבק במרכז הכיסוי. הפעל את תהליך ציפוי הספין כמתואר בכתב היד של הטקסט. אם ציפוי הסחרור אינו זמין, יש לטפטף כ-0.1 מיליליטר של דבק UV הניתן לריפוי על כיסוי נקי באמצעות פיפטה.קחו את הכיסוי השני והניחו אותו על גבי הראשון כדי שהדבק הנוזלי יתפזר באופן שווה בין שני הכיסויים. לאחר שהדבק הגיע לקצה הכיסויים, הפרידו ביניהם בעדינות על ידי החלקה אחד על השני. לאחר ההפרדה, שתי הכיסויים יהיו מצופות במלואן בשכבה דקה של דבק נוזלי.לאחר ציפוי סחרור, לרפא מראש את הדבק על ידי חשיפה UV. התאם את זמן החשיפה בהתאם לצפיפות ההספק של מקור ה- UV בו נעשה שימוש. קחו את אחד הסרטים בעלי המרקם והניחו אותו במגע עם הכיסוי המצופה בדבק. יש לוודא שהמגע בין הדבק שנרפא חלקית לבין הסרט בעל המרקם אחיד ככל האפשר.בשלב זה, הדבק על הכיסוי צריך להיות מוצק מספיק כדי למנוע זרימה חוזרת וניתן לייעל את המגע על ידי לחיצה עדינה על הכיסוי. יש לחשוף את הכיסויים לאור UV עד לריפוי מלא של שכבת הדבק המצופה עד לריפוי מלא. פעולה זו תאטום את היריעה בעלת המרקם על הכיסוי ותספק בידוד חסין נזילות בין החללים ההיקפיים.לאחר מכן בעזרת פינצטה, צבטו את ה-PDMS בקצה שבו נותר החומר העודף לאחר החיתוך וקילפו את המצע השטוח PDMS. שלב זה מאפשר לשכבת סרט הצילום בעלת המרקם להיצמד למכסה עם גישה פתוחה בחלק העליון לזריעת תאים. לפני זריעת תאים, במכשיר פסיבי עם קופולימר ביומטרי כמתואר בכתב היד, יש לפזר מיליליטר אחד של PBS סטרילי לתוך צלחות פטרי תרבית תאים 35 מילימטר.דגה את המנה עם PBS סטרילי באמצעות תא ואקום במשך 10 דקות, ולאחר מכן כמה סבבים של pipetting כדי להסיר את כל הבועות. החליפו את PBS במדיום תרבית סטרילית ועיקרו את הצלחת באור UV למשך 30 דקות מתחת למכסה מנוע של תרבית תאים. הכן תרחיף תאים על ידי ביצוע המלצות להכנת טריפסיניזציה או תרחיף תאים עבור התאים המעניינים כמתואר בכתב היד של הטקסט.לספור ולהתאים את ריכוז התא ל 500, 000 תאים למיליליטר בתווך תרבית התא המומלץ. הסר את מאגר PBS מצלחת תרבית התאים בקוטר 35 מ"מ ולאחר מכן הוצא מיליליטר אחד של מתלה התאים המותאם. מחזירים את צלחת תרבית התאים לאינקובטור התא למשך 10 דקות.כ-80 עד 100 תאים ייכנסו לכל חלל היקפי. לאחר כ-10 דקות של דגירה, משחזרים את צלחת תרבית התאים מהאינקובטור ושאפו בעדינות את התרחיף התאי כדי להסיר תאים לא לכודים. מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום תרבית לצלחת התרבית ומחזירים אותו לאינקובטור התא.לחלופין, כדי לשלוף את האורגנואידים לאחר שגדלו בבארות, צבטו את שכבת הדבק בעלת המרקם בקצה החתוך באמצעות פינצטה וקילפו אותה בעדינות מכיסוי הזכוכית, אך השאירו אותה שקועה בתווך. הגדלת ריכוז הקופולימר הביומטרי הגדילה את עובי הציפוי. פירוק מלא של צלחות תרבית התאים היה חיוני כדי להסיר בועות אוויר הכלואות בחללים ההיקפיים.אורגנואידים נוצרו לאחר ימים שניים ו -15 של תרבית. המיקרוסקופ הקונפוקלי של הדיסק המסתובב הראה תמונות מייצגות של האורגנואידים ושחזור תלת ממדי. בעת הכנת צלחת התרבית, חשוב לשים לב להרכבת התבנית או ערימת המצע ולהבטיח מגע טוב בין הסרט בעל המרקם לבין הכיסוי.ההכלה המסופקת על ידי חללי המיקרו שלנו והיעדר אובדן חומרים משכו את תשומת ליבם של חוקרי ביולוגיה של החלל המעוניינים לחקור את השפעת המיקרו-כבידה על הומאוסטזיס אורגנואידים.

Research

JoVE Journal

Biology

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

תא Multi-CNS-Neuron גליה שותף תרבות Microfluidic רציף

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical Diagnostics

הדמיה עצמים ללא עדשה על שבב של תאים מספק כלי חדש לביולוגיה-Cell תפוקה גבוהה ואבחון רפואי

Conventional optical microscopes image cells by use of objective lenses that work together with other lenses and optical components. While quite ...

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

מסך התפוקה גבוהה עבור Biomining פעילות cellulase מספריות Metagenomic

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

ניתוח תפוקה גבוהה תמונה של spheroids גידול: יישום תוכנה ידידותי למשתמש כדי למדוד את גודל של spheroids באופן אוטומטי ומדויק

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...