Name: a high-throughput platform for culture and 3d imaging of organoids
Uploaded: 2022-10-14T14:00:00
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La ricerca è supportata dal progetto CALIPSO sostenuto dalla National Research Foundation, Ufficio del Primo Ministro, Singapore, nell'ambito del suo programma Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE). V.V. riconosce il supporto dello sperimentatore NRF NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI seed funding e ANR ADGastrulo. A.B. e G.G. riconoscono il sostegno del finanziamento di base dell'MBI. A.B. riconosce Andor Technologies per il prestito del microscopio BC43.

NOTA: La prima parte di questo protocollo descrive in dettaglio la microfabbricazione del dispositivo di coltura cellulare. Uno stampo primario originale con cavità piramidali può essere prodotto internamente - se sono disponibili strutture di micro-fabbricazione - o esternalizzato a società esterne. Lo stampo primario utilizzato in questo lavoro è prodotto internamente, con fasi del processo di fabbricazione descritte altrove11,13. Un protocollo di base per ...

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	<li>Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Takebe, T., Wells James, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+by+design.">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li><li>Kratochvil, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+materials+for+organoid+systems.">Engineered materials for organoid systems.</a> Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).</li><li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+potential+in+organoid+research.">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li><li>O'Connell, L., Winter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+past+learning+and+future+directions.">Organoids: past learning and future directions.</a> Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).</li><li>Vives, J., Batlle-Morera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+developing+human+3D+organoids+into+medicines.">The challenge of developing human 3D organoids into medicines.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 72 (2020).</li><li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+challenges+of+patient-derived+organoids+in+guiding+the+multimodality+treatment+of+upper+gastrointestinal+malignancies.">The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies.</a> Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).</li><li>Lukonin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+landscape+of+intestinal+organoid+regeneration.">Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration.</a> Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).</li><li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+organoids:+a+bright+future+ahead.">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+high-+and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM.">3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li><li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+3D+imaging+method+for+quantitative+characterization+of+organoid+development+and+phenotype.">High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high-speed+3D+imaging+of+organoid+cultures+with+multi-scale+phenotypic+quantification.">Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification.</a> Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).</li></ol>

La procedura per la fabbricazione del piatto di coltura a micropozzetto, che consente la coltura e la differenziazione di organoidi ad alta densità, è stata descritta in questo articolo. A causa della geometria e della disposizione delle microcavità, migliaia di sferoidi possono essere coltivati e colorati in una singola piastra per lunghi periodi di tempo (diverse settimane o più) con quasi nessuna perdita di materiale. A titolo di confronto, un'area di 4 mm x 2 mm sulla piastra di coltura cellulare può contenere t...

Nelle colture cellulari 3D organotipiche, di seguito denominate organoidi, le cellule staminali si differenziano e si auto-organizzano in strutture spaziali che condividono forti somiglianze morfologiche e funzionali con organi reali. Gli organoidi offrono modelli preziosi per studiare la biologia umana e lo sviluppo al di fuori del corpo 1,2,3. Un numero crescente di modelli sono in fase di sviluppo che imitano il fegato, il cervello, i reni, i polmoni e molti altri organi 2,4,5. La differenziazione negli organoidi è diretta dall'aggiunta di fattori di crescita solubili e di una matrice extracellulare in una precisa sequenza temporale. Tuttavia, in netto contrasto con gli organi, lo sviluppo degli organoidi è piuttosto eterogeneo.
Oltre alle numerose sfide biologiche6,7, le colture organoidi pongono anche sfide tecnologiche in termini di metodi di coltura cellulare, caratterizzazione della trascrittomica e imaging. Lo sviluppo degli organi in vivo avviene in un ambiente biologico che si traduce in un'auto-organizzazione altamente stereotipata delle disposizioni cellulari. Qualsiasi alterazione fenotipica può essere utilizzata come proxy per diagnosticare uno stato patologico. Al contrario, gli organoidi si sviluppano in vitro in microambienti minimamente controllati compatibili con le condizioni di coltura cellulare, con conseguente grande variabilità nel percorso di sviluppo e nella formazione della forma per ogni singolo organoide.
Un recente studio8 ha dimostrato che l'imaging quantitativo della forma organoide (descrittori fenotipici) accoppiato alla valutazione di alcuni marcatori genetici consente la definizione di paesaggi di sviluppo fenotipici. Probabilmente, la capacità di mettere in relazione la diversità dell'espressione genomica negli organoidi con il loro comportamento fenotipico è un passo importante verso lo sfruttamento del pieno potenziale delle colture organotipiche. Pertanto, richiede lo sviluppo di approcci di imaging dedicati e ad alto contenuto che consentano la caratterizzazione delle caratteristiche organoidi su scale subcellulari, multicellulari e organoidi intere in 3D 9,10.
Abbiamo sviluppato una versatile piattaforma di screening ad alto contenuto (HCS) che consente una coltura organoide semplificata (da cellule staminali embrionali umane isolate [hESC], cellule staminali pluripotenti indotte umane [hIPSC] o cellule primarie a organoidi differenziati 3D, multicellulari) e imaging 3D rapido e non invasivo. Integra un dispositivo di coltura cellulare 3D miniaturizzato di nuova generazione, chiamato chip JeWells (il chip di seguito), che contiene migliaia di micropozzetti ben disposti affiancati da specchi a 45 ° che consentono immagini rapide, 3D e ad alta risoluzione mediante microscopia a foglio di luce a singolo obiettivo11. Compatibile con qualsiasi microscopio invertito standard, commerciale, questo sistema consente l'imaging di 300 organoidi in 3D con risoluzione subcellulare in <1 h.
La microfabbricazione del dispositivo di coltura cellulare parte da uno stampo micro strutturato esistente, che contiene centinaia di micropiramidi (Figura 1A) con base quadrata e pareti laterali a 45° rispetto alla base. La figura 1C mostra le immagini al microscopio elettronico (EM) di tali strutture. Lo stampo stesso è realizzato in poli(dimetilsilossano) (PDMS) e può essere realizzato come un calco replica di uno stampo primario (non mostrato qui) con caratteristiche corrispondenti (come cavità) utilizzando procedure litografiche molli standard. Lo stampo primario può essere prodotto con diverse procedure. Quello utilizzato per questo protocollo è stato realizzato utilizzando l'incisione a umido al silicio come riportato in Galland et al. 11; La procedura per la fabbricazione dello stampo primario non è critica per questo protocollo. Le piramidi sono disposte in una matrice quadrata, con lo stesso passo per le direzioni X e Y (in questo caso il passo è di 350 μm).
A titolo illustrativo, sono stati pubblicati12 esperimenti proof-of-concept per dimostrare che il chip consente una coltura a lungo termine (mesi) e protocolli di differenziazione, definendo con precisione il numero di cellule iniziali nei pozzi. Lo sviluppo individuale di un gran numero di organoidi può essere monitorato automaticamente in tempo reale utilizzando microscopi a fluorescenza standard a campo chiaro e 3D a foglio di luce. Inoltre, gli organoidi possono essere recuperati per eseguire ulteriori indagini biologiche (ad esempio, analisi trascrittomica). Questo documento delinea i protocolli dettagliati per la fabbricazione dei vetrini di copertura della coltura cellulare, la procedura di semina e colorazione per la microscopia a fluorescenza, nonché il recupero degli organoidi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>AA19397K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>AA19392K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC43 Benchtop Confocal Microscope</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>spinning disk confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>37525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered oxide etching solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>901621-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEE Spin Coater</td>
			<td>Brewer Science</td>
			<td>200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer AZ400K</td>
			<td>Merck</td>
			<td>18441223164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI Milliq water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Marienfled</td>
			<td>117650</td>
			<td>1.5H, round 25 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>BitPlane</td>
			<td></td>
			<td>image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Transmission optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TSF100-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsonic M</td>
			<td>Sartorius Stedium Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidure</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>CM5206</td>
			<td>bio-mimetic copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA73</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>17-345</td>
			<td>UV curable adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Thermofisher scientific&#160;</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Alexa Fluor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo Resist AZ5214E</td>
			<td>Merck</td>
			<td>14744719710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico Plasma tool</td>
			<td>Diener Electronic GmbH + Co. KG</td>
			<td>Pico Plasma</td>
			<td>For O2 plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.52</td>
			<td>Sunjin lab</td>
			<td>RC 152001</td>
			<td>water-soluble clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCT Hot Plate/Stirrer</td>
			<td>IKA (MY)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive Ion Etching tool</td>
			<td>Samco Inc. (JPN)</td>
			<td>RIE-10NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11875093</td>
			<td>culture medium for HCT116 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td>Polydimethylsiloxane or in short, PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td>CPX2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-KUB 2</td>
			<td>KLOE</td>
			<td></td>
			<td>UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV mask aligner</td>
			<td>SUSS Microtec Semiconductor (DE)</td>
			<td>MJB4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput platform for culture and 3d imaging of organoids

La caratterizzazione di un gran numero di colture organotipiche tridimensionali (3D) (organoidi) a diverse scale di risoluzione è attualmente limitata da approcci di imaging standard. Questo protocollo descrive un modo per preparare chip di coltura organoidi microfabbricati, che consentono l'imaging live 3D multiscala su uno strumento intuitivo che richiede manipolazioni minime e in grado di produrre fino a 300 organoidi / h. Questi chip di coltura sono compatibili con obiettivi sia ad aria che ad immersione (aria, acqua, olio e silicone) e con una vasta gamma di microscopi comuni (ad esempio, disco rotante, scanner puntiforme confocale, campo largo e campo chiaro). Inoltre, possono essere utilizzati con modalità light-sheet come la tecnologia di microscopia a luce singola (SPIM) a obiettivo singolo (soSPIM). 
Il protocollo qui descritto fornisce passaggi dettagliati per la preparazione dei trucioli di coltura microfabbricati e la coltura e la colorazione degli organoidi. È necessario solo un breve periodo di tempo per familiarizzare e materiali di consumo e attrezzature possono essere facilmente trovati nei normali laboratori biologici. Qui, le capacità di imaging 3D saranno dimostrate solo con microscopi standard commerciali (ad esempio, disco rotante per la ricostruzione 3D e microscopia a campo largo per il monitoraggio di routine).

La figura 8F mostra l'aspetto tipico di un copricostume per coltura cellulare dopo una fabbricazione riuscita. Lo strato adesivo polimerizzabile ai raggi UV appare piatto e aderisce bene al vetrino. Il trasferimento dello strato adesivo sul vetrino potrebbe non riuscire se lo strato sul vetrino è sovrapolimerizzato o se la rimozione del substrato PDMS piatto viene eseguita in modo errato (come mostrato nella Figura 8G,H). In entrambi i casi, il...

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A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Questo documento presenta un protocollo di fabbricazione per un nuovo tipo di substrato di coltura con centinaia di microcontenitori per mm2, in cui gli organoidi possono essere coltivati e osservati utilizzando la microscopia ad alta risoluzione. Anche i protocolli di semina cellulare e immunocolorazione sono dettagliati.

Una piattaforma ad alto rendimento per la coltura e l'imaging 3D di organoidi

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Questo protocollo dimostra un piatto di coltura cellulare microtexture progettato per la crescita di centinaia di organoidi con conoscenza del materiale e pienamente compatibile con la microscopia. La nostra tecnica consente in modo efficiente di generare migliaia di organoidi, pienamente compatibili con l'imaging a lungo termine e la coltura cellulare a lungo termine. Questo protocollo è di forte interesse per applicazioni biomediche come la pipeline di screening dei farmaci e i domini di ricerca sul cancro.La tecnica presentata in questo protocollo è facile da padroneggiare dopo alcuni tentativi da parte di chiunque abbia esperienza con le procedure di laboratorio e la microscopia ottica. Per iniziare, tagliare piccole porzioni dello stampo PDMS fino alla dimensione richiesta per il dispositivo finale. Tagliarli parallelamente alle direzioni XY dell'array.Posizionate uno dei dadi dello stampo PDMS preparati a faccia in giù sulla sezione PDMS piatta. Quindi, utilizzando una pipetta, aggiungere circa 0,1-0,2 millilitri di adesivo polimerizzabile UV su un lato dello stampo. Seguire la progressione del liquido all'interno della cavità utilizzando un microscopio ottico invertito con ingrandimento 10X.Esporre l'adesivo alla luce UV per polimerizzarlo. Regolare il tempo di esposizione in base alla densità di potenza della sorgente UV come descritto nel manoscritto di testo. Utilizzando la quantità eccessiva di adesivo su un bordo, tenere l'adesivo polimerizzato sul substrato PDMS piatto premendolo delicatamente con un dito.Nel frattempo, usando una pinzetta, pizzicare un angolo dello stampo vicino allo stesso bordo che viene tenuto premuto e staccare lentamente lo stampo, assicurandosi che il film strutturato non venga sollevato. Tagliare l'adesivo in eccesso e il substrato PDMS utilizzando una lametta per lasciare lo strato polimerizzato, strutturato e adesivo piatto sul PDMS con il substrato in eccesso su un solo bordo. Trattare un coprislip pulito con un breve processo al plasma di ossigeno per migliorarne l'idrofilia.Dopo l'attivazione del plasma, rivestire il sottile strato di adesivo polimerizzabile UV posizionando il coprislip sul mandrino sottovuoto di un rivestimento a centrifuga standard e versando una piccola goccia di adesivo al centro del vetrino. Eseguite il processo di rivestimento di rotazione come descritto nel testo manuscritto. Se il rivestimento di rotazione non è disponibile, far cadere circa 0,1 millilitri di adesivo polimerizzabile UV su un coprivetrino pulito utilizzando una pipetta.Prendi un secondo coprivetrino e posizionalo sopra il primo per far sì che l'adesivo liquido si diffonda uniformemente tra i due vetrini. Una volta che l'adesivo ha raggiunto il bordo dei vetrini, separarli delicatamente facendo scorrere uno sull'altro. Una volta separati, entrambi i coprivetrini saranno completamente rivestiti con un sottile strato di adesivo liquido.Dopo il rivestimento di rotazione, pre-polimerizzare l'adesivo mediante esposizione ai raggi UV. Regolare il tempo di esposizione in base alla densità di potenza della sorgente UV utilizzata. Prendere una delle pellicole testurizzate, metterla a contatto con il coprislip rivestito adesivo. Assicurarsi che il contatto tra l'adesivo parzialmente polimerizzato e il film testurizzato sia il più uniforme possibile.In questa fase, l'adesivo sul coprivetrino deve essere abbastanza solido da evitare il riflusso e il contatto può essere ottimizzato premendo delicatamente sul vetrino. Esporre i vetrini alla luce UV fino a quando lo strato adesivo rivestito non è completamente polimerizzato. Ciò sigilla il film testurizzato sul coprivetrino e fornisce un isolamento a prova di perdite tra le cavità perimetrali.Quindi, utilizzando una pinzetta, pizzicare il PDMS sul bordo in cui è stato lasciato il materiale in eccesso dopo il taglio e staccare il substrato piatto PDMS. Questo passaggio consente allo strato di pellicola testurizzata di aderire al coprivetrino con accesso aperto nella parte superiore per la semina delle celle. Prima della semina cellulare, su un dispositivo passivato con copolimero biometrico come descritto nel manoscritto, erogare un millilitro di PBS sterile nelle piastre di Petri di coltura cellulare da 35 millimetri.Degasare il piatto con PBS sterile utilizzando la camera a vuoto per 10 minuti, seguito da diversi cicli di pipettaggio per rimuovere tutte le bolle. Sostituire il PBS con terreno di coltura sterile e sterilizzare la piastra con luce UV per 30 minuti sotto un cappuccio di coltura cellulare. Preparare una sospensione cellulare seguendo le raccomandazioni di tripsinizzazione o preparazione della sospensione cellulare per le cellule di interesse come descritto nel manoscritto testuale.Contare e regolare la concentrazione cellulare a 500.000 cellule per millilitro nel terreno di coltura cellulare raccomandato. Rimuovere il tampone PBS dal piatto di coltura cellulare da 35 millimetri e quindi erogare un millilitro della sospensione cellulare regolata. Rimettere il piatto di coltura cellulare nell'incubatore cellulare per 10 minuti.Circa 80-100 cellule entreranno in ogni cavità perimetrale. Dopo circa 10 minuti di incubazione, recuperare il piatto di coltura cellulare dall'incubatore e aspirare delicatamente la sospensione cellulare per rimuovere le cellule non intrappolate. Aggiungere un millilitro di terreno di coltura al piatto di coltura e rimetterlo nell'incubatore cellulare.Facoltativamente, per recuperare gli organoidi dopo che sono cresciuti nei pozzetti, pizzicare lo strato adesivo testurizzato sul bordo tagliato usando una pinzetta e staccarlo delicatamente dal vetrino, ma tenerlo immerso nel mezzo. L'aumento della concentrazione di copolimero biometrico ha aumentato lo spessore del rivestimento. Il degasaggio completo delle piastre di coltura cellulare era essenziale per rimuovere le bolle d'aria intrappolate nelle cavità perimetrali.Gli organoidi si sono formati dopo i due giorni e 15 di coltivazione. La microscopia confocale a disco rotante ha mostrato immagini rappresentative degli organoidi e una ricostruzione 3D. Quando si prepara il piatto di coltura, è importante prestare attenzione all'assemblaggio dello stampo o della pila di substrati e garantire un buon contatto tra il film strutturato e il coprifoglio.Il contenimento fornito dalle nostre micro cavità e l'assenza di perdita di materiale ha attirato l'attenzione dei ricercatori di biologia spaziale interessati a studiare l'effetto della microgravità sull'omeostasi organoide.

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