Name: a high-throughput platform for culture and 3d imaging of organoids
Uploaded: 2022-10-14T14:00:00
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この研究は、シンガポールの首相官邸にある国立研究財団が支援するCALIPSOプロジェクトによって、研究卓越性と技術企業のためのキャンパス(CREATE)プログラムの下でサポートされています。V.V.は、NRFの調査員NRF-NRFI2018-07、MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005、MBIシード資金、およびANR ADGasttruloの支援を認めています。A.B.とG.G.は、MBIコア資金からの支援を認めています。A.B.は、BC43顕微鏡の貸与についてAndor Technologiesを認めています。

注:このプロトコルの最初の部分では、細胞培養デバイスの微細加工について詳しく説明しています。ピラミッド型の空洞を持つオリジナルの一次金型は、微細加工設備があれば社内で製作することも、外部企業に外注することもできます。この作業で使用される一次金型は社内で製造され、製造プロセスのステップは他の場所に記載されています11、13...

<ol>
	<li>Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Takebe, T., Wells James, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+by+design.">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li><li>Kratochvil, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+materials+for+organoid+systems.">Engineered materials for organoid systems.</a> Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).</li><li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+potential+in+organoid+research.">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li><li>O'Connell, L., Winter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+past+learning+and+future+directions.">Organoids: past learning and future directions.</a> Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).</li><li>Vives, J., Batlle-Morera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+developing+human+3D+organoids+into+medicines.">The challenge of developing human 3D organoids into medicines.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 72 (2020).</li><li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+challenges+of+patient-derived+organoids+in+guiding+the+multimodality+treatment+of+upper+gastrointestinal+malignancies.">The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies.</a> Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).</li><li>Lukonin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+landscape+of+intestinal+organoid+regeneration.">Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration.</a> Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).</li><li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+organoids:+a+bright+future+ahead.">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+high-+and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM.">3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li><li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+3D+imaging+method+for+quantitative+characterization+of+organoid+development+and+phenotype.">High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high-speed+3D+imaging+of+organoid+cultures+with+multi-scale+phenotypic+quantification.">Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification.</a> Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).</li></ol>

高密度オルガノイド培養と分化を可能にするマイクロウェル培養皿の作製手順は、この論文に記載されています。微小空洞の形状と配置により、数千のスフェロイドを1枚のプレートで長期間(数週間以上)培養および染色することができ、材料の損失はほとんどありません。比較として、細胞培養プレート上の4 mm x 2 mmの領域には、12 cm x 8 cmの面積を持つ単一の384ウェルプレートと同じ数のス?...

オルガノイドと呼ばれるオルガノタイプ3D細胞培養では、幹細胞は分化し、実際の臓器と強い形態学的および機能的類似性を共有する空間構造に自己組織化します。オルガノイドは、ヒトの生物学と体外での発生を研究するための貴重なモデルを提供します1,2,3。肝臓、脳、腎臓、肺、および他の多くの臓器を模倣するモデルが増えています2,4,5。オルガノイドの分化は、可溶性成長因子と細胞外マトリックスを正確な時系列で添加することによって指示されます。しかしながら、臓器とは著しく対照的に、オルガノイドの発達は非常に不均一である。
多くの生物学的課題6,7に加えて、オルガノイド培養は、細胞培養方法、トランスクリプトミクスの特性評価、およびイメージングの面でも技術的な課題をもたらします。in vivo器官の発達は生物学的環境で起こり、その結果、細胞配置の非常にステレオタイプの自己組織化がもたらされます。任意の表現型の変化は、罹患状態を診断するための代理として使用することができる。対照的に、オルガノイドは、細胞培養条件に適合する最小限の制御された微小環境でin vitroで発達するため、個々のオルガノイドの発生経路と形状形成に大きなばらつきが生じます。
最近の研究8では、いくつかの遺伝子マーカーの評価と組み合わせたオルガノイド形状(表現型記述子)の定量的イメージングにより、表現型発生ランドスケープの定義が可能になることが実証されました。おそらく、オルガノイドのゲノム発現の多様性を表現型挙動と関連付ける能力は、オルガノイド培養の可能性を最大限に引き出すための大きな一歩です。したがって、細胞下、多細胞、および全オルガノイドスケールでのオルガノイドの特徴を3D 9,10で特徴付けることを可能にする、専用のハイコンテントイメージングアプローチの開発が求められています。
当社は、合理化されたオルガノイド培養(単離されたヒト胚性幹細胞[hESC]、ヒト人工多能性幹細胞[hIPSC]、または初代細胞から3D、多細胞、分化型オルガノイドまで)と高速で非侵襲的な3Dイメージングを可能にする汎用性の高いハイコンテントスクリーニング(HCS)プラットフォームを開発しました。これは、JeWellsチップ(以下、 チップ )と呼ばれる次世代の小型3D細胞培養装置を統合しており、45°ミラーに隣接する何千ものウェルアレイマイクロウェルを含み、単一対物レンズライトシート顕微鏡による高速3D高解像度イメージングを可能にします11。標準的な市販の倒立顕微鏡と互換性のあるこのシステムは、300種類のオルガノイドを3Dでイメージングし、細胞内分解能を<1時間で行うことができます。
細胞培養デバイスの微細加工は、正方形のベースとベースに対して45°の側壁を持つ数百のマイクロピラミッド(図1A)を含む既存の微細構造モールドから始まります。 図1C は、このような構造の電子顕微鏡(EM)像を示す。モールド自体はポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)でできており、標準的なソフトリソグラフィー手順を使用して、対応する機能(キャビティとして)を備えた一次モールド(ここには示されていません)のレプリカキャストとして作成できます。一次金型は、さまざまな手順で製造できます。このプロトコルに使用されたものは、Gallandらで報告されているように、シリコンウェットエッチングを使用して作成されました。11;一次金型の製造手順は、このプロトコルにとって重要ではありません。ピラミッドは、X方向とY方向で同じピッチで正方形の配列に配置されます(この場合、ピッチは350μmです)。
実例として、チップがウェル内の初期細胞数を正確に定義しながら、長期培養(月)および分化プロトコルを可能にすることを実証するために、概念実証実験12 が公開された。多数のオルガノイドの個々の発達は、標準的な明視野および3Dライトシート蛍光顕微鏡を使用してライブで自動的に監視できます。さらに、オルガノイドを取り出して、さらなる生物学的調査(例えば、トランスクリプトミクス解析)を実行することができる。この論文では、細胞培養カバーガラスの作製、蛍光顕微鏡のシードおよび染色手順、およびオルガノイドの検索に関する詳細なプロトコルについて概説します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>AA19397K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>AA19392K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC43 Benchtop Confocal Microscope</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>spinning disk confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>37525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered oxide etching solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>901621-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEE Spin Coater</td>
			<td>Brewer Science</td>
			<td>200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer AZ400K</td>
			<td>Merck</td>
			<td>18441223164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI Milliq water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Marienfled</td>
			<td>117650</td>
			<td>1.5H, round 25 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>BitPlane</td>
			<td></td>
			<td>image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Transmission optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TSF100-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsonic M</td>
			<td>Sartorius Stedium Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidure</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>CM5206</td>
			<td>bio-mimetic copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA73</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>17-345</td>
			<td>UV curable adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Thermofisher scientific&#160;</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Alexa Fluor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo Resist AZ5214E</td>
			<td>Merck</td>
			<td>14744719710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico Plasma tool</td>
			<td>Diener Electronic GmbH + Co. KG</td>
			<td>Pico Plasma</td>
			<td>For O2 plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.52</td>
			<td>Sunjin lab</td>
			<td>RC 152001</td>
			<td>water-soluble clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCT Hot Plate/Stirrer</td>
			<td>IKA (MY)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive Ion Etching tool</td>
			<td>Samco Inc. (JPN)</td>
			<td>RIE-10NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11875093</td>
			<td>culture medium for HCT116 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td>Polydimethylsiloxane or in short, PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td>CPX2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-KUB 2</td>
			<td>KLOE</td>
			<td></td>
			<td>UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV mask aligner</td>
			<td>SUSS Microtec Semiconductor (DE)</td>
			<td>MJB4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput platform for culture and 3d imaging of organoids

さまざまな解像度スケールでの多数の3次元(3D)器官型培養物(オルガノイド)の特性評価は、現在、標準的なイメージングアプローチによって制限されています。このプロトコルは、微細加工されたオルガノイド培養チップを調製する方法を説明しており、最小限の操作を必要とし、最大300オルガノイド/hのイメージングスループットが可能なユーザーフレンドリーな装置でマルチスケールの3Dライブイメージングを可能にします。これらの培養チップは、空気対物レンズと液浸対物レンズ(空気、水、油、シリコーン)の両方、および幅広い一般的な顕微鏡(スピニングディスク、ポイントスキャナー共焦点、広視野、明視野など)と互換性があります。さらに、単一対物レンズ、単一平面照明顕微鏡(SPIM)技術(soSPIM)などのライトシートモダリティで使用できます。 
ここで説明するプロトコルは、微細加工された培養チップの調製、およびオルガノイドの培養と染色のための詳細な手順を示しています。慣れるのに必要な時間は短く、消耗品や機器は通常のバイオラボで簡単に見つけることができます。ここでは、3Dイメージング機能は、市販の標準顕微鏡(3D再構成用のスピニングディスクやルーチンモニタリング用の広視野顕微鏡など)でのみ実証されます。

図8F は、作製が成功した後の細胞培養カバーガラスの典型的な側面を示す。UV硬化型接着剤層は平らに見え、カバーガラスによく接着します。カバーガラス上の層が過剰に硬化している場合、または平らなPDMS基板の除去が正しく行われていない場合( 図8G、Hに示すように)、カバーガラス上の接着剤層の転写が失敗する可能性がありま?...

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A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

この論文は、オルガノイドを培養し、高解像度顕微鏡を使用して観察できる、mm2あたり数百のマイクロコンテナを備えた新しいタイプの培養基質の製造プロトコルを提示します。細胞播種および免疫染色プロトコルも詳述されています。

オルガノイドの培養および3Dイメージングのためのハイスループットプラットフォーム

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

このプロトコルは、材料の知識を持ち、顕微鏡と完全に互換性のある数百のオルガノイドの成長用に設計されたマイクロテクスチャ細胞培養皿を実証します。当社の技術は、数千のオルガノイドを効率的に生成することができ、長期イメージングおよび長期細胞培養と完全に互換性があります。このプロトコルは、薬物スクリーニングパイプラインや癌研究ドメインなどの生物医学的アプリケーションにとって非常に興味深いものです。このプロトコルで提示されている技術は、実験室の手順と光学顕微鏡検査の経験がある人なら誰でも数回試みた後、簡単に習得できます。まず、PDMSモールドのごく一部を最終デバイスに必要な寸法にカットします。配列のXY方向に平行にカットします。準備したPDMSモールドダイスの1つを下向きにして、平らなPDMSセクションに置きます。次に、ピペットを使用して、金型の片面に約0.1〜0.2ミリリットルのUV硬化型接着剤を追加します。10倍の倍率で倒立光学顕微鏡を使用して、キャビティ内の液体の進行を追跡します。接着剤をUV光にさらして硬化させます。テキスト原稿に記載されているように、UV光源のパワー密度に応じて露光時間を調整します。一方の端に過剰量の接着剤を使用して、硬化した接着剤を指で軽く押して平らなPDMS基板上に保持します。その間、ピンセットを使用して、押さえている同じエッジの隣に金型の片隅をつまみ、テクスチャフィルムが浮き渡らないようにしながら、ゆっくりと金型を剥がします。かみそりの刃を使用して余分な接着剤とPDMS基板をトリミングし、硬化、テクスチャ、および接着剤層をPDMS上に平らにし、余分な基板を片方の端だけにします。きれいなカバーガラスを短い酸素プラズマプロセスで処理して、親水性を向上させます。プラズマ活性化後、標準的なスピンコーターの真空チャックにカバーガラスを置き、カバーガラスの中央に接着剤を少量注ぐことにより、UV硬化型接着剤の薄層をスピンコートします。テキスト原稿に記載されているようにスピンコーティングプロセスを実行します。スピンコーティングが利用できない場合は、ピペットを使用して、約0.1ミリリットルのUV硬化型接着剤を清潔なカバーガラスに落とします。2番目のカバーガラスを取り、最初のカバーガラスの上に置き、液体接着剤を2つのカバーガラスの間に均等に広げます。接着剤がカバーガラスの端に達したら、カバーガラスをスライドさせてゆっくりと分離します。分離されると、両方のカバーガラスは液体接着剤の薄層で完全にコーティングされます。スピンコーティング後、UVにさらして接着剤を予備硬化させます。使用するUV光源のパワー密度に応じて露光時間を調整します。テクスチャフィルムの1つを取り、接着剤でコーティングされたカバーガラスに接触させます。部分的に硬化した接着剤とテクスチャフィルムとの接触ができるだけ均一であることを確認してください。この段階では、カバーガラスの接着剤は再流を防ぐのに十分なほど固くなければならず、カバーガラスを軽く押すことで接触を最適化できます。コーティングされた接着剤層が完全に硬化するまで、カバーガラスをUV光にさらします。これにより、カバーガラスのテクスチャフィルムがシールされ、周囲の空洞間の漏れ防止の分離が提供されます。次にピンセットを使用して、トリミング後に余分な材料が残った端でPDMSをつまみ、PDMSフラット基板を剥がします。このステップにより、テクスチャードフィルム層をカバーガラスに接着し、細胞播種のために上部にオープンアクセスすることができます。細胞播種の前に、原稿に記載されているように生体認証コポリマーで不動態化したデバイス上で、1ミリリットルの滅菌PBSを35ミリメートルの細胞培養ペトリ皿に分注します。真空チャンバーを使用して滅菌PBSで皿を10分間脱気し、続いて数回のピペッティングを行ってすべての気泡を除去します。PBSを滅菌培地と交換し、細胞培養フードの下でプレートをUV光で30分間滅菌します。テキスト原稿に記載されているように、目的の細胞に対するトリプシン処理または細胞懸濁液調製の推奨事項に従って、細胞懸濁液を調製します。推奨細胞培養培地中の細胞濃度を1ミリリットルあたり500, 000細胞にカウントして調整します。35ミリメートルの細胞培養皿からPBSバッファーを取り出し、調整した細胞懸濁液を1ミリリットル分注します。細胞培養皿を細胞インキュベーターに10分間戻します。約80〜100個のセルが各周囲空洞に入ります。約10分間のインキュベーション後、インキュベーターから細胞培養皿を回収し、細胞懸濁液を穏やかに吸引して、閉じ込められていない細胞を除去します。1ミリリットルの培地を培養皿に加え、セルインキュベーターに戻します。必要に応じて、ウェルで成長した後にオルガノイドを回収するには、ピンセットを使用して切断端のテクスチャード接着剤層をつまみ、ガラスカバーガラスからそっと剥がしますが、培地に浸したままにします。生体コポリマーの濃度を上げると、コーティングの厚さが増加しました。細胞培養皿の完全な脱気は、周囲の空洞に閉じ込められた気泡を除去するために不可欠でした。オルガノイドは、培養の2日目と15日目の後に形成されました。スピニングディスク共焦点顕微鏡は、オルガノイドの代表的な画像と3D再構成を示しました。培養皿を準備するときは、型または基板スタックの組み立てに注意を払い、テクスチャフィルムとカバーガラスの間の良好な接触を確保することが重要です。私たちの微小空洞によって提供される封じ込めと物質損失の欠如は、オルガノイドの恒常性に対する微小重力の影響を研究することに関心のある宇宙生物学研究者の注目を集めています。

Research

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Biology

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