Name: a high-throughput platform for culture and 3d imaging of organoids
Uploaded: 2022-10-14T14:00:00
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이 연구는 싱가포르 총리실의 국립 연구 재단이 지원하는 CALIPSO 프로젝트의 지원을 받아 연구 우수성 및 기술 기업을 위한 캠퍼스(CREATE) 프로그램에 따라 지원됩니다. V.V.는 NRF 조사자 NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI 시드 펀딩 및 ANR ADGastrulo의 지원을 인정합니다. AB와 G.G.는 MBI 핵심 자금의 지원을 인정합니다. A.B.는 BC43 현미경의 대여에 대해 Andor Technologies를 인정합니다.

참고: 이 프로토콜의 첫 번째 부분은 세포 배양 장치의 미세 가공에 대해 자세히 설명합니다. 피라미드 캐비티가 있는 원래의 1차 금형은 미세 가공 시설을 사용할 수 있는 경우 사내에서 생산하거나 외부 회사에 아웃소싱할 수 있습니다. 이 작업에 사용 된 기본 금형은 사내에서 생산되며 제조 공정 단계는 다른 곳에서 설명합니다11,13. 금형의 미세 가?...

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	<li>Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Takebe, T., Wells James, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+by+design.">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li><li>Kratochvil, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+materials+for+organoid+systems.">Engineered materials for organoid systems.</a> Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).</li><li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+potential+in+organoid+research.">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li><li>O'Connell, L., Winter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+past+learning+and+future+directions.">Organoids: past learning and future directions.</a> Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).</li><li>Vives, J., Batlle-Morera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+developing+human+3D+organoids+into+medicines.">The challenge of developing human 3D organoids into medicines.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 72 (2020).</li><li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+challenges+of+patient-derived+organoids+in+guiding+the+multimodality+treatment+of+upper+gastrointestinal+malignancies.">The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies.</a> Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).</li><li>Lukonin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+landscape+of+intestinal+organoid+regeneration.">Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration.</a> Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).</li><li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+organoids:+a+bright+future+ahead.">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+high-+and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM.">3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li><li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+3D+imaging+method+for+quantitative+characterization+of+organoid+development+and+phenotype.">High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high-speed+3D+imaging+of+organoid+cultures+with+multi-scale+phenotypic+quantification.">Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification.</a> Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).</li></ol>

고밀도 오가노이드 배양 및 분화를 허용하는 마이크로웰 배양 접시의 제조 절차가 이 백서에 설명되어 있습니다. 미세 공동의 형상과 배열로 인해 수천 개의 스페로이드를 재료 손실 없이 장기간(몇 주 이상) 동안 단일 플레이트에서 배양하고 염색할 수 있습니다. 비교를 위해 세포 배양 플레이트의 4mm x 2mm 영역에는 면적이 12cm x 8cm인 단일 384웰 플레이트만큼 많은 스페로이드가 포함될 수 있습니?...

오가노이드라고 하는 유기형 3D 세포 배양에서 줄기세포는 실제 장기와 강력한 형태학적 및 기능적 유사성을 공유하는 공간 구조로 분화하고 자가 조직화됩니다. 오가노이드는 인체 생물학과 신체 외부의 발달을 연구하는 데 유용한 모델을 제공합니다 1,2,3. 간, 뇌, 신장, 폐 및 기타 여러 기관을 모방하는 모델이 점점 더 많이 개발되고 있습니다 2,4,5. 유기체의 분화는 가용성 성장 인자와 세포 외 기질을 정확한 시간 순서로 첨가함으로써 결정됩니다. 그러나, 기관과 현저한 대조적으로, 유기체의 발달은 상당히 이질적이다.
수많은 생물학적 과제6,7 외에도 오가노이드 배양은 세포 배양 방법, 전사체학의 특성화 및 이미징 측면에서 기술적 과제를 제기합니다. 생체내 기관 발달은 세포 배열의 매우 진부한 자기조직을 초래하는 생물학적 환경에서 일어난다. 모든 표현형 변화는 병든 상태를 진단하기위한 대용으로 사용될 수 있습니다. 대조적으로, 오가노이드는 세포 배양 조건과 호환되는 최소한으로 제어되는 미세 환경에서 시험관 내에서 발달하여 각 개별 오가노이드의 발달 경로 및 모양 형성에 큰 변동성을 초래합니다.
최근 연구8는 몇 가지 유전자 마커의 평가와 결합된 오가노이드 모양(표현형 설명자)의 정량적 이미징이 표현형 발달 환경의 정의를 허용한다는 것을 보여주었습니다. 틀림없이, 오가노이드에서 게놈 발현의 다양성을 표현형 행동과 연관시키는 능력은 유기체형 배양의 잠재력을 최대한 발휘하기 위한 주요 단계입니다. 따라서 3D 9,10에서 세포 하, 다세포 및 전체 오가노이드 규모에서 오가노이드 특징을 특성화할 수 있는 전용 고콘텐츠 이미징 접근 방식의 개발이 필요합니다.
당사는 간소화된 오가노이드 배양(분리된 인간 배아 줄기 세포[hESC], 인간 유도 만능 줄기 세포[hIPSC] 또는 일차 세포에서 3D, 다세포, 분화된 오가노이드까지) 및 빠른 비침습적 3D 이미징을 가능하게 하는 다목적 고함량 스크리닝(HCS) 플랫폼을 개발했습니다. JeWells 칩(이하 칩 )이라고 하는 차세대 소형 3D 세포 배양 장치를 통합하고 있으며, 여기에는 단일 대물 라이트 시트 현미경으로 빠른 3D 고해상도 이미징이 가능한 45° 미러 옆에 수천 개의 잘 배열된 마이크로웰이 포함되어있습니다11. 모든 표준 상용 도립 현미경과 호환되는 이 시스템은 300개의 오가노이드를 3D로 이미징할 수 있으며 <1시간 내에 세포하 분해능을 제공합니다.
세포 배양 장치의 미세 가공은 정사각형 베이스와 베이스에 대해 45°의 측벽을 가진 수백 개의 마이크로 피라미드(그림 1A)를 포함하는 기존의 미세 구조화된 몰드에서 시작됩니다. 도 1C는 이러한 구조의 전자 현미경(EM) 이미지를 나타낸다. 금형 자체는 폴리 (디메틸 실록산) (PDMS)로 만들어지며 표준 소프트 리소그래피 절차를 사용하여 해당 기능 (공동)이있는 1 차 금형 (여기에 표시되지 않음)의 복제 주조로 만들 수 있습니다. 기본 금형은 다른 절차로 생산할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용 된 것은 Galland 등에보고 된 바와 같이 실리콘 습식 에칭을 사용하여 만들어졌습니다. 11; 1 차 금형 제작 절차는이 프로토콜에 중요하지 않습니다. 피라미드는 X 및 Y 방향에 대해 동일한 피치를 가진 제곱 배열로 배열됩니다 (이 경우 피치는 350μm입니다).
예시로서, 개념 증명 실험(12 )은 칩이 웰의 초기 세포 수를 정확하게 정의하면서 장기 배양(개월) 및 분화 프로토콜을 허용한다는 것을 입증하기 위해 출판되었다. 다수의 오가노이드의 개별 개발은 표준 명시야 및 3D 광시트 형광 현미경을 사용하여 실시간으로 자동 모니터링할 수 있습니다. 또한, 오가노이드를 검색하여 추가 생물학적 조사(예: 전사체 분석)를 수행할 수 있습니다. 이 백서는 세포 배양 커버슬립 제작, 형광 현미경을 위한 파종 및 염색 절차, 오가노이드 검색에 대한 자세한 프로토콜을 간략하게 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>AA19397K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>AA19392K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC43 Benchtop Confocal Microscope</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>spinning disk confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>37525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered oxide etching solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>901621-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEE Spin Coater</td>
			<td>Brewer Science</td>
			<td>200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer AZ400K</td>
			<td>Merck</td>
			<td>18441223164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI Milliq water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Marienfled</td>
			<td>117650</td>
			<td>1.5H, round 25 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>BitPlane</td>
			<td></td>
			<td>image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Transmission optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TSF100-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsonic M</td>
			<td>Sartorius Stedium Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidure</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>CM5206</td>
			<td>bio-mimetic copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA73</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>17-345</td>
			<td>UV curable adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Thermofisher scientific&#160;</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Alexa Fluor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo Resist AZ5214E</td>
			<td>Merck</td>
			<td>14744719710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico Plasma tool</td>
			<td>Diener Electronic GmbH + Co. KG</td>
			<td>Pico Plasma</td>
			<td>For O2 plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.52</td>
			<td>Sunjin lab</td>
			<td>RC 152001</td>
			<td>water-soluble clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCT Hot Plate/Stirrer</td>
			<td>IKA (MY)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive Ion Etching tool</td>
			<td>Samco Inc. (JPN)</td>
			<td>RIE-10NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11875093</td>
			<td>culture medium for HCT116 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td>Polydimethylsiloxane or in short, PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td>CPX2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-KUB 2</td>
			<td>KLOE</td>
			<td></td>
			<td>UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV mask aligner</td>
			<td>SUSS Microtec Semiconductor (DE)</td>
			<td>MJB4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput platform for culture and 3d imaging of organoids

다양한 해상도 스케일에서 다수의 3차원(3D) 유기형 배양(오가노이드)의 특성 분석은 현재 표준 이미징 접근 방식에 의해 제한됩니다. 이 프로토콜은 최소한의 조작으로 최대 300개의 오가노이드/h 이미징 처리량을 지원하는 사용자 친화적인 기기에서 멀티스케일 3D 라이브 이미징을 가능하게 하는 미세 제작된 오가노이드 배양 칩을 준비하는 방법을 설명합니다. 이러한 배양 칩은 공기 및 침지 대물렌즈(공기, 물, 오일 및 실리콘) 및 광범위한 일반 현미경(예: 스피닝 디스크, 포인트 스캐너 공초점, 광시야 및 명시야)과 호환됩니다. 또한 단일 대물렌즈, 단일 평면 조명 현미경(SPIM) 기술(soSPIM)과 같은 라이트 시트 양식과 함께 사용할 수 있습니다. 
여기에 설명된 프로토콜은 미세가공 배양 칩의 제조와 오가노이드의 배양 및 염색을 위한 자세한 단계를 제공합니다. 익숙해지는 데 짧은 시간 만 필요하며 소모품과 장비는 일반 바이오 실험실에서 쉽게 찾을 수 있습니다. 여기서 3D 이미징 기능은 상용 표준 현미경(예: 3D 재구성을 위한 스피닝 디스크 및 일상적인 모니터링을 위한 광시야 현미경)으로만 시연됩니다.

도 8F는 성공적인 제조 후의 세포 배양 커버슬립의 전형적인 양상을 나타낸다. UV 경화형 접착제 층은 평평하게 보이고 커버 슬립에 잘 부착됩니다. 커버슬립의 층이 과경화되거나 평평한 PDMS 기판의 제거가 잘못 수행된 경우 커버슬립의 접착층 전사가 실패할 수 있습니다(그림 8G,H 참조). 두 경우 모두 질감이 있는 필름이 커버슬립으로 전?...

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A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

이 논문은mm2당 수백 개의 마이크로컨테이너를 사용하는 새로운 유형의 배양 기질에 대한 제조 프로토콜을 제시하며, 이 배양에서 오가노이드는 고해상도 현미경을 사용하여 배양 및 관찰할 수 있습니다. 세포 파종 및 면역 염색 프로토콜도 자세히 설명되어 있습니다.

오가노이드의 배양 및 3D 이미징을 위한 고처리량 플랫폼

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

이 프로토콜은 재료에 대한 지식이 있고 현미경과 완벽하게 호환되는 수백 개의 오가노이드의 성장을 위해 설계된 미세 질감 세포 배양 접시를 보여줍니다. 당사의 기술은 장기 이미징 및 장기 세포 배양과 완벽하게 호환되는 수천 개의 유기체를 효율적으로 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 약물 스크리닝 파이프라인 및 암 연구 영역과 같은 생물 의학 응용 분야에 큰 관심을 받고 있습니다.이 프로토콜에 제시된 기술은 실험실 절차 및 광학 현미경 검사에 경험이있는 사람이라면 누구나 몇 번 시도하면 쉽게 마스터 할 수 있습니다. 시작하려면 PDMS 금형의 작은 부분을 최종 장치에 필요한 치수로 절단하십시오. 배열의 XY 방향과 평행하게 자릅니다.준비된 PDMS 몰드 주사위 중 하나를 평평한 PDMS 섹션에 뒤집어 놓습니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 약 0.1 내지 0.2 밀리리터의 UV 경화성 접착제를 몰드의 한쪽면에 첨가한다. 10X 배율의 도립 광학 현미경을 사용하여 캐비티 내부의 액체 진행을 따르십시오.접착제를 UV 광선에 노출시켜 경화시킵니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 UV 소스의 전력 밀도에 따라 노출 시간을 조정합니다. 한쪽 가장자리에 과도한 양의 접착제를 사용하여 경화된 접착제를 손가락으로 부드럽게 눌러 평평한 PDMS 기판에 고정합니다.한편, 핀셋을 사용하여 누르고 있는 동일한 가장자리 옆에 몰드의 한쪽 모서리를 집고 질감이 있는 필름이 들리지 않도록 하면서 몰드를 천천히 떼어냅니다. 면도날을 사용하여 과도한 접착제와 PDMS 기판을 트리밍하여 경화, 질감 및 접착층을 PDMS에 평평하게 놓고 여분의 기판은 한쪽 가장자리에만 둡니다. 짧은 산소 플라즈마 공정으로 깨끗한 커버슬립을 처리하여 친수성을 개선하십시오.플라즈마 활성화 후, 표준 스핀 코터의 진공 척에 커버슬립을 놓고 커버슬립 중앙에 작은 접착제 방울을 부어 UV 경화 접착제의 얇은 층을 스핀 코팅합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 스핀 코팅 프로세스를 실행합니다. 스핀 코팅을 사용할 수 없는 경우 피펫을 사용하여 깨끗한 커버슬립에 약 0.1ml의 UV 경화 접착제를 떨어뜨립니다.두 번째 커버슬립을 가져다가 첫 번째 커버슬립 위에 올려 액체 접착제가 두 커버슬립 사이에 고르게 퍼지도록 합니다. 접착제가 커버슬립의 가장자리에 도달하면 하나를 다른 위로 밀어 부드럽게 분리합니다. 분리되면 두 커버슬립은 얇은 액체 접착제 층으로 완전히 코팅됩니다.스핀 코팅 후, UV에 노출시켜 접착제를 예비경화시킨다. 사용된 UV 소스의 출력 밀도에 따라 노출 시간을 조정합니다. 질감이있는 필름 중 하나를 가져 와서 접착제로 코팅 된 커버 슬립과 접촉시킵니다. 부분적으로 경화된 접착제와 질감이 있는 필름 사이의 접촉이 가능한 한 균일한지 확인하십시오.이 단계에서 커버슬립의 접착제는 재유입을 방지할 수 있을 만큼 충분히 단단해야 하며 커버슬립을 부드럽게 눌러 접촉을 최적화할 수 있습니다. 코팅된 접착제층이 완전히 경화될 때까지 커버슬립을 자외선에 노출시킵니다. 이렇게 하면 커버슬립에 질감이 있는 필름이 밀봉되고 주변 구멍 사이에 누출 방지 격리가 제공됩니다.그런 다음 핀셋을 사용하여 트리밍 후 여분의 재료가 남은 가장자리에 PDMS를 집어 PDMS 플랫 기판을 벗겨냅니다. 이 단계를 통해 질감이 있는 필름 층이 셀 파종을 위해 상단에 열린 접근이 있는 커버슬립에 부착될 수 있습니다. 세포 파종 전에, 원고에 기재된 바와 같이 생체 인식 공중합체로 부동태화된 장치 상에서, 멸균 PBS 1밀리리터를 35밀리미터 세포 배양 페트리 접시에 분배한다.진공 챔버를 사용하여 멸균 PBS로 접시를 10분 동안 탈기한 다음, 모든 기포를 제거하기 위해 여러 차례의 피펫팅을 하였다. PBS를 멸균 배양 배지로 교체하고 세포 배양 후드 하에서 30분 동안 UV 광으로 플레이트를 멸균합니다. 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 관심 세포에 대한 트립신화 또는 세포 현탁액 제제 권장 사항에 따라 세포 현탁액을 준비한다.권장 세포 배양 배지에서 밀리리터당 500, 000 세포로 세포 농도를 계산하고 조정합니다. 35mm 세포 배양 접시에서 PBS 완충액을 제거한 다음 조정된 세포 현탁액 1밀리리터를 분주합니다. 세포 배양 접시를 세포 배양기에 다시 10분 동안 넣습니다.대략 80-100 개의 세포가 각 주변 공동으로 들어갑니다. 약 10분의 배양 후, 인큐베이터에서 세포 배양 접시를 회수하고 세포 현탁액을 부드럽게 흡인하여 포획되지 않은 세포를 제거합니다. 배양 접시에 1 밀리리터의 배양 배지를 넣고 세포 배양기에 다시 넣습니다.선택적으로 오가노이드가 웰에서 성장한 후 오가노이드를 회수하려면 핀셋을 사용하여 절단 가장자리의 질감 접착제 층을 꼬집고 유리 커버슬립에서 부드럽게 벗겨내되 매체에 담그십시오. 생체 공중합체의 농도를 증가시키면 코팅 두께가 증가하였다. 세포 배양 접시의 완전한 탈기는 주변 공동에 갇힌 기포를 제거하는 데 필수적이었습니다.오가노이드는 배양 2일 및 15일 후에 형성되었다. 회전 디스크 컨포칼 현미경은 오가노이드의 대표 이미지와 3D 재구성을 보여주었습니다. 배양 접시를 준비할 때 금형 또는 기판 스택의 조립에 주의를 기울이고 질감이 있는 필름과 커버슬립 사이의 양호한 접촉을 보장하는 것이 중요합니다.우리의 미세 공동이 제공하는 봉쇄와 물질 손실의 부재는 미세 중력이 유기체 항상성에 미치는 영향을 연구하는 데 관심이있는 우주 생물학 연구자들의 관심을 끌었습니다.

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High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag 분석 - 높은 처리량, Sc2.0 유전형에 대한 실시간 PCR 분석

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...