Name: a high-throughput platform for culture and 3d imaging of organoids
Uploaded: 2022-10-14T14:00:00
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A pesquisa é apoiada pelo projeto CALIPSO apoiado pela Fundação Nacional de Pesquisa, Gabinete do Primeiro-Ministro, Cingapura, no âmbito de seu programa Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE). V.V. reconhece o apoio do investigador NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, financiamento inicial MBI e ANR ADGastrulo. A.B. e G.G. reconhecem o apoio do financiamento principal do MBI. A A.B. reconhece a Andor Technologies pelo empréstimo do microscópio BC43.

NOTA: A primeira parte deste protocolo detalha a microfabricação do dispositivo de cultura de células. Um molde primário original com cavidades piramidais pode ser produzido internamente - se as instalações de microfabricação estiverem disponíveis - ou terceirizado para empresas externas. O molde primário utilizado neste trabalho é produzido internamente, com etapas do processo de fabricação descritas em outroslugares 11,13. Um protocolo básico para...

<ol>
	<li>Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Takebe, T., Wells James, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+by+design.">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li><li>Kratochvil, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+materials+for+organoid+systems.">Engineered materials for organoid systems.</a> Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).</li><li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+potential+in+organoid+research.">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li><li>O'Connell, L., Winter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+past+learning+and+future+directions.">Organoids: past learning and future directions.</a> Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).</li><li>Vives, J., Batlle-Morera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+developing+human+3D+organoids+into+medicines.">The challenge of developing human 3D organoids into medicines.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 72 (2020).</li><li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+challenges+of+patient-derived+organoids+in+guiding+the+multimodality+treatment+of+upper+gastrointestinal+malignancies.">The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies.</a> Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).</li><li>Lukonin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+landscape+of+intestinal+organoid+regeneration.">Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration.</a> Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).</li><li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+organoids:+a+bright+future+ahead.">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+high-+and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM.">3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li><li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+3D+imaging+method+for+quantitative+characterization+of+organoid+development+and+phenotype.">High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high-speed+3D+imaging+of+organoid+cultures+with+multi-scale+phenotypic+quantification.">Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification.</a> Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).</li></ol>

O procedimento para a fabricação do prato de cultura de micropoços, que permite o cultivo e diferenciação de organoides de alta densidade, foi descrito neste trabalho. Devido à geometria e disposição das microcavidades, milhares de esferoides podem ser cultivados e corados em uma única placa por longos períodos de tempo (várias semanas ou mais) com quase nenhuma perda de material. Como comparação, uma área de 4 mm x 2 mm na placa de cultura celular pode conter tantos esferoides quanto uma única placa de 38...

Em culturas organotípicas de células 3D, doravante referidas como organoides, as células-tronco se diferenciam e se auto-organizam em estruturas espaciais que compartilham fortes semelhanças morfológicas e funcionais com órgãos reais. Os organoides oferecem modelos valiosos para estudar a biologia e o desenvolvimento humano fora do corpo 1,2,3. Um número crescente de modelos está sendo desenvolvido que imitam o fígado, cérebro, rim, pulmão e muitos outros órgãos 2,4,5. A diferenciação em organoides é direcionada pela adição de fatores de crescimento solúveis e uma matriz extracelular em uma sequência de tempo precisa. No entanto, em contraste marcante com os órgãos, o desenvolvimento de organoides é bastante heterogêneo.
Além dos inúmeros desafios biológicos6,7, as culturas organoides também apresentam desafios tecnológicos em termos de métodos de cultura celular, caracterização da transcriptômica e imagem. O desenvolvimento de órgãos in vivo ocorre em um ambiente biológico que resulta em uma auto-organização altamente estereotipada dos arranjos celulares. Qualquer alteração fenotípica pode ser usada como proxy para diagnosticar um estado doente. Em contraste, os organoides se desenvolvem in vitro em microambientes minimamente controlados, compatíveis com as condições de cultura celular, resultando em grande variabilidade no caminho de desenvolvimento e na formação de formas para cada organoide individual.
Um estudo recente8 demonstrou que imagens quantitativas da forma organoide (descritores fenotípicos) acopladas à avaliação de alguns marcadores genéticos permitem a definição de paisagens de desenvolvimento fenotípico. Indiscutivelmente, a capacidade de relacionar a diversidade da expressão genômica em organoides com seu comportamento fenotípico é um passo importante para liberar todo o potencial das culturas organotípicas. Assim, implora pelo desenvolvimento de abordagens de imagem dedicadas e de alto conteúdo que permitam a caracterização das características organoides em escalas subcelulares, multicelulares e organoides inteiras em 3D 9,10.
Desenvolvemos uma plataforma versátil de triagem de alto conteúdo (HCS) que permite a cultura organoide simplificada (de células-tronco embrionárias humanas isoladas [hESCs], células-tronco pluripotentes induzidas por humanos [hIPSCs] ou células primárias a organoides 3D, multicelulares e diferenciados) e imagens 3D rápidas e não invasivas. Ele integra um dispositivo de cultura de células 3D miniaturizado de última geração, chamado chip JeWells (o chip doravante), que contém milhares de micropoços bem arranjados ladeados por espelhos de 45° que permitem imagens rápidas, 3D e de alta resolução por microscopia de folha de luz de objetivo único11. Compatível com qualquer microscópio padrão, comercial e invertido, este sistema permite a imagem de 300 organoides em 3D com resolução subcelular em <1 h.
A microfabricação do dispositivo de cultura celular parte de um molde microestruturado existente, que contém centenas de micropirâmides (Figura 1A) com uma base quadrada e paredes laterais a 45° em relação à base. A Figura 1C mostra imagens de microscópio eletrônico (EM) de tais estruturas. O molde em si é feito de poli(dimetilsiloxano) (PDMS) e pode ser feito como uma réplica de um molde primário (não mostrado aqui) com características correspondentes (como cavidades) usando procedimentos litográficos suaves padrão. O molde primário pode ser produzido por diferentes procedimentos. O utilizado para este protocolo foi feito utilizando gravura úmida de silício, conforme relatado em Galland et al. 11; o procedimento para a fabricação do molde primário não é crítico para este protocolo. As pirâmides estão dispostas em uma matriz quadrada, com o mesmo passo para as direções X e Y (neste caso, o passo é de 350 μm).
Como ilustração, experimentos de prova de conceito12 foram publicados para demonstrar que o chip permite a cultura a longo prazo (meses) e protocolos de diferenciação, definindo com precisão o número de células iniciais nos poços. O desenvolvimento individual de um grande número de organoides pode ser monitorado automaticamente ao vivo usando microscópios padrão de fluorescência de campo brilhante e folha de luz 3D. Além disso, os organoides podem ser recuperados para realizar investigações biológicas adicionais (por exemplo, análise transcriptômica). Este artigo descreve protocolos detalhados para a fabricação das coberturas de cultura celular, o procedimento de semeadura e coloração para microscopia de fluorescência, bem como a recuperação dos organoides.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>AA19397K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>AA19392K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC43 Benchtop Confocal Microscope</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td>spinning disk confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>37525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered oxide etching solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>901621-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEE Spin Coater</td>
			<td>Brewer Science</td>
			<td>200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer AZ400K</td>
			<td>Merck</td>
			<td>18441223164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI Milliq water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Marienfled</td>
			<td>117650</td>
			<td>1.5H, round 25 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>BitPlane</td>
			<td></td>
			<td>image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Transmission optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TSF100-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsonic M</td>
			<td>Sartorius Stedium Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidure</td>
			<td>NOF America</td>
			<td>CM5206</td>
			<td>bio-mimetic copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA73</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>17-345</td>
			<td>UV curable adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Thermofisher scientific&#160;</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Alexa Fluor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo Resist AZ5214E</td>
			<td>Merck</td>
			<td>14744719710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico Plasma tool</td>
			<td>Diener Electronic GmbH + Co. KG</td>
			<td>Pico Plasma</td>
			<td>For O2 plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.52</td>
			<td>Sunjin lab</td>
			<td>RC 152001</td>
			<td>water-soluble clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCT Hot Plate/Stirrer</td>
			<td>IKA (MY)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive Ion Etching tool</td>
			<td>Samco Inc. (JPN)</td>
			<td>RIE-10NR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11875093</td>
			<td>culture medium for HCT116 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>4019862</td>
			<td>Polydimethylsiloxane or in short, PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td>CPX2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-KUB 2</td>
			<td>KLOE</td>
			<td></td>
			<td>UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV mask aligner</td>
			<td>SUSS Microtec Semiconductor (DE)</td>
			<td>MJB4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput platform for culture and 3d imaging of organoids

A caracterização de um grande número de culturas organotípicas tridimensionais (3D) (organoides) em diferentes escalas de resolução é atualmente limitada por abordagens de imagem padrão. Este protocolo descreve uma maneira de preparar chips de cultura de organoides microfabricados, que permitem imagens ao vivo 3D em multiescala em um instrumento fácil de usar que requer manipulações mínimas e capaz de obter até 300 organoides / h de rendimento de imagem. Esses chips de cultura são compatíveis com os objetivos de ar e imersão (ar, água, óleo e silicone) e uma ampla gama de microscópios comuns (por exemplo, disco giratório, scanner de ponto confocal, campo amplo e campo brilhante). Além disso, eles podem ser usados com modalidades de folha de luz, como a tecnologia de microscopia de iluminação de plano único e objetivo único (SPIM) (soSPIM). 
O protocolo aqui descrito fornece etapas detalhadas para a preparação dos cavacos de cultura microfabricados e a cultura e coloração de organoides. Apenas um curto período de tempo é necessário para se familiarizar, e consumíveis e equipamentos podem ser facilmente encontrados em biolaboratórios normais. Aqui, os recursos de imagem 3D serão demonstrados apenas com microscópios padrão comerciais (por exemplo, disco giratório para reconstrução 3D e microscopia de campo amplo para monitoramento de rotina).

A Figura 8F mostra o aspecto típico de uma cobertura de cultura de células após a fabricação bem-sucedida. A camada adesiva curável por UV parece plana e adere bem à tampa. A transferência da camada adesiva na folha de cobertura pode falhar se a camada na folha de cobertura estiver sobrecurada, ou se a remoção do substrato PDMS plano for feita incorretamente (como mostrado na Figura 8G,H). Em ambos os casos, a falha é evidente, pois n...

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A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Este trabalho apresenta um protocolo de fabricação para um novo tipo de substrato de cultura com centenas de microrecipientes por mm2, no qual organoides podem ser cultivados e observados por microscopia de alta resolução. Os protocolos de semeadura celular e imunocoloração também são detalhados.

Uma plataforma de alto rendimento para cultura e imagem 3D de organoides

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Este protocolo demonstra uma placa de cultura de células de microtextura projetada para o crescimento de centenas de organoides com conhecimento de material e totalmente compatível com microscopia. Nossa técnica permite gerar eficientemente milhares de organoides, totalmente compatíveis com imagens de longo prazo e cultura celular de longo prazo. Este protocolo é de forte interesse para aplicações biomédicas, como pipeline de triagem de medicamentos e domínios de pesquisa de câncer.A técnica apresentada neste protocolo é fácil de dominar após algumas tentativas por qualquer pessoa que tenha experiência com procedimentos laboratoriais e microscopia óptica. Para começar, corte pequenas porções do molde PDMS na dimensão necessária para o dispositivo final. Cortá-los paralelos às direções XY da matriz.Coloque um dos dados de molde PDMS preparados virado para baixo na seção plana do PDMS. Em seguida, usando uma pipeta, adicione aproximadamente 0,1 a 0,2 mililitros de adesivo curável UV a um lado do molde. Siga a progressão do líquido dentro da cavidade usando um microscópio óptico invertido com ampliação de 10X.Exponha o adesivo à luz UV para curá-lo. Ajuste o tempo de exposição dependendo da densidade de potência da fonte UV, conforme descrito no manuscrito do texto. Usando a quantidade excessiva de adesivo em uma borda, segure o adesivo curado no substrato PDMS plano, pressionando-o suavemente com um dedo.Enquanto isso, usando uma pinça, aperte um canto do molde ao lado da mesma borda que está sendo pressionada e retire lentamente o molde, garantindo que o filme texturizado não seja levantado. Apare o excesso de adesivo e substrato PDMS usando uma lâmina de barbear para deixar a camada curada, texturizada e adesiva plana no PDMS com o excesso de substrato em apenas uma borda. Trate uma tampa limpa com um processo curto de plasma de oxigênio para melhorar sua hidrofilicidade.Após a ativação do plasma, revesti-la por rotação a fina camada de adesivo curável por UV colocando a tampa no mandril a vácuo de um revestidor de spin padrão e despejando uma pequena gota de adesivo no centro da tampa. Execute o processo de revestimento de rotação conforme descrito no manuscrito do texto. Se o revestimento por rotação não estiver disponível, solte aproximadamente 0,1 mililitros de adesivo curável por UV em uma tampa limpa usando uma pipeta.Pegue uma segunda tampa e coloque-a em cima da primeira para fazer com que o adesivo líquido se espalhe uniformemente entre as duas tampas. Uma vez que o adesivo tenha atingido a borda das tampas, separe-as suavemente deslizando uma sobre a outra. Uma vez separadas, ambas as coberturas serão totalmente revestidas com uma fina camada de adesivo líquido.Após o revestimento por centrifugação, pré-cure o adesivo por exposição aos raios UV. Ajuste o tempo de exposição dependendo da densidade de potência da fonte UV utilizada. Pegue um dos filmes texturizados e coloque-o em contato com a tampa revestida com adesivo. Certifique-se de que o contato entre o adesivo parcialmente curado e o filme texturizado seja o mais uniforme possível.Nesta fase, o adesivo na tampa deve ser sólido o suficiente para evitar o refluxo e o contato pode ser otimizado pressionando suavemente a tampa. Exponha as tampas à luz UV até que a camada adesiva revestida esteja totalmente curada. Isso selará o filme texturizado na tampa e fornecerá isolamento à prova de vazamento entre as cavidades do perímetro.Em seguida, usando uma pinça, aperte o PDMS na borda onde o excesso de material foi deixado após o corte e retire o substrato plano do PDMS. Esta etapa permite que a camada de filme texturizado adira à tampa com acesso aberto na parte superior para a semeadura de células. Antes da semeadura celular, em um dispositivo passivado com copolímero biométrico, conforme descrito no manuscrito, dispense um mililitro de PBS estéril nas placas de Petri de cultura celular de 35 milímetros.Degas do prato com PBS estéril usando a câmara de vácuo por 10 minutos, seguido por várias rodadas de pipetagem para remover todas as bolhas. Substitua o PBS por meio de cultura estéril e esterilize a placa com luz UV por 30 minutos sob um exaustor de cultura celular. Prepare uma suspensão celular seguindo as recomendações de tripsinização ou preparação de suspensão celular para as células de interesse, conforme descrito no manuscrito do texto.Conte e ajuste a concentração celular para 500.000 células por mililitro no meio de cultura celular recomendado. Remova o tampão PBS da placa de cultura de células de 35 milímetros e, em seguida, dispense um mililitro da suspensão celular ajustada. Coloque o prato de cultura celular de volta na incubadora de células por 10 minutos.Aproximadamente 80 a 100 células entrarão em cada cavidade do perímetro. Após aproximadamente 10 minutos de incubação, recupere a placa de cultura celular da incubadora e aspirar suavemente a suspensão celular para remover as células não aprisionadas. Adicione um mililitro de meio de cultura ao prato de cultura e coloque-o de volta na incubadora de células.Opcionalmente, para recuperar os organoides depois que eles crescerem nos poços, aperte a camada adesiva texturizada na borda cortada usando pinças e descasque-a suavemente da tampa de vidro, mas mantenha-a imersa no meio. O aumento da concentração de copolímero biométrico aumentou a espessura do revestimento. A desgaseificação completa das placas de cultura celular foi essencial para remover as bolhas de ar presas nas cavidades do perímetro.Os organoides foram formados após os dois e 15 dias de cultivo. A microscopia confocal do disco giratório mostrou imagens representativas dos organoides e reconstrução 3D. Ao preparar o prato de cultura, é importante prestar atenção à montagem da pilha de molde ou substrato e garantir um bom contato entre o filme texturizado e o coverslip.A contenção proporcionada por nossas microcavidades e a ausência de perda de material atraíram a atenção de pesquisadores de biologia espacial interessados em estudar o efeito da microgravidade na homeostase organoide.

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