Name: cellular affinity of particle-stabilized emulsion to boost antigen internalization
Uploaded: 2022-09-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cellular Affinity of Particle-Stabilized Emulsion to Boost Antigen Internalization at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af projekt støttet af Kinas nationale nøgleforsknings- og udviklingsprogram (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), Fra 0 til 1 originalt innovationsprojekt af grundlæggende frontier videnskabeligt forskningsprogram for kinesisk videnskabsakademi (ZDBS-LY-SLH040), Stiftelsen for innovative forskningsgrupper fra National Natural Science Foundation of China (tilskud nr. 21821005).

Alle metoder beskrevet i denne protokol er godkendt af Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences. Alle dyreforsøg blev udført i nøje overensstemmelse med reglerne for pleje og brug af forsøgsdyr og retningslinjer for etisk gennemgang af dyr (Kina, GB / T35892-2018).
1. Forberedelse og karakterisering af PLGA nanopartikler
<ol><li>Fremstilling af PLGA nanopartikler (PNP'er)<ol><li>Der tilsættes 0,5 g polyvinylalkohol (PVA) til 120 ml deioniseret vand ...

<ol>
	<li>Ma, G., Gu, Z., Wei, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+vaccine+delivery.">Advanced vaccine delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 183, 114170 (2022).</li><li>Sharma, J., Carson, C. S., Douglas, T., Wilson, J. T., Joyce, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-particulate+platforms+for+vaccine+delivery+to+enhance+antigen-specific+cd8(+)+t-cell+response.">Nano-particulate platforms for vaccine delivery to enhance antigen-specific cd8(+) t-cell response.</a> Methods in Molecular Biology. 2412, 367-398 (2022).</li><li>Nguyen, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+nanocovax,+a+sars-cov-2+recombinant+spike+protein+vaccine:+interim+results+of+a+double-blind,+randomised+controlled+phase+1+and+2+trial.">Safety and immunogenicity of nanocovax, a sars-cov-2 recombinant spike protein vaccine: interim results of a double-blind, randomised controlled phase 1 and 2 trial.</a> The Lancet Regional Health. Western Pacific. 24, 100474 (2022).</li><li>Coates, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+a+trivalent+virus-like+particle+vaccine+against+western,+eastern,+and+venezuelan+equine+encephalitis+viruses:+a+phase+1,+open-label,+dose-escalation,+randomised+clinical+trial.">Safety and immunogenicity of a trivalent virus-like particle vaccine against western, eastern, and venezuelan equine encephalitis viruses: a phase 1, open-label, dose-escalation, randomised clinical trial.</a> The Lancet Infectious Diseases. 22 (8), 1210-1220 (2022).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+a+nanoparticle+therapeutic+vaccine+in+patients+with+chronic+hepatitis+b:+a+randomized+clinical+trial.">Efficacy and safety of a nanoparticle therapeutic vaccine in patients with chronic hepatitis b: a randomized clinical trial.</a> Hepatology. 75 (1), 182-195 (2022).</li><li>Krishnan, R., Kim, J. O., Qadiri, S. S. N., Kim, J. O., Oh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+viral+uptake+and+host-associated+immune+response+in+the+tissues+of+seven-band+grouper+following+a+bath+challenge+with+nervous+necrosis+virus.">Early viral uptake and host-associated immune response in the tissues of seven-band grouper following a bath challenge with nervous necrosis virus.</a> Fish &amp; Shellfish Immunology. 103, 454-463 (2020).</li><li>Mishra, D., Mishra, P. K., Dubey, V., Dabadghao, S., Jain, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+uptake+and+generation+of+immune+response+by+murine+dendritic+cells+pulsed+with+hepatitis+b+surface+antigen-loaded+elastic+liposomes.">Evaluation of uptake and generation of immune response by murine dendritic cells pulsed with hepatitis b surface antigen-loaded elastic liposomes.</a> Vaccine. 25 (39-40), 6939-6944 (2007).</li><li>Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., Mccullough, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+internalization+of+foot-and-mouth+disease+virus:+influence+of+heparan+sulfate+binding+on+virus+uptake+and+induction+of+the+immune+response.">Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response.</a> Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).</li><li>Jing, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+artificial+antigens+revealed+extended+membrane+networks+utilized+by+live+dendritic+cells+for+antigen+uptake.">Fluorescent artificial antigens revealed extended membrane networks utilized by live dendritic cells for antigen uptake.</a> Nano Letters. 22 (10), 4020-4027 (2022).</li><li>Meena, J., Goswami, D. G., Anish, C., Panda, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+of+polylactide+particles+induces+size+dependent+cytoskeletal+remodeling+in+antigen+presenting+cells.">Cellular uptake of polylactide particles induces size dependent cytoskeletal remodeling in antigen presenting cells.</a> Biomaterials Science. 9 (23), 7962-7976 (2021).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+delivery+via+cell+membrane+fusion+using+lipopeptide+modified+liposomes.">Drug delivery via cell membrane fusion using lipopeptide modified liposomes.</a> ACS Central Science. 2 (9), 621-630 (2016).</li><li>Rawle, R., Kasson, P., Boxer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+viral+membrane+fusion+from+receptor+binding+by+using+synthetic+dna-lipid+conjugates+totether+influenza+virus+to+model+lipid+membranes.">Disentangling viral membrane fusion from receptor binding by using synthetic dna-lipid conjugates totether influenza virus to model lipid membranes.</a> Biophysical Journal. 111 (1), 123-131 (2016).</li><li>Ha, H. K., Kim, J. W., Lee, M. R., Jun, W., Lee, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+cytotoxicity+of+&#946;-lactoglobulin+nanoparticles:+the+effects+of+particle+size+and+surface+charge.">Cellular uptake and cytotoxicity of &#946;-lactoglobulin nanoparticles: the effects of particle size and surface charge.</a> Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 28 (3), 420-427 (2015).</li><li>Malara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+structure+and+nano-mechanics+determine+megakaryocyte+function.">Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function.</a> Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).</li><li>Dankovich, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+through+endocytosis+and+resurfacing+of+tenascin-r.">Extracellular matrix remodeling through endocytosis and resurfacing of tenascin-r.</a> Nature Communications. 12 (1), 7129 (2021).</li><li>Evans, E., Buxbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+of+red-blood-cell+membrane+for+particle+surfaces+measured+by+the+extent+of+particle+encapsulation.">Affinity of red-blood-cell membrane for particle surfaces measured by the extent of particle encapsulation.</a> Biophysical Journal. 34 (1), 1-12 (1981).</li><li>Rohner, N. A., Purdue, L. N., Von Recum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+polymers+provide+long-term+immunotherapeutic+drug+delivery+across+particle+size+ranges+optimal+for+macrophage+targeting.">Affinity-based polymers provide long-term immunotherapeutic drug delivery across particle size ranges optimal for macrophage targeting.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (4), 1693-1700 (2021).</li><li>Zhou, X., Liu, Y., Wang, X. F., Li, X. M., Xiao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+particle+size+on+the+cellular+uptake+and+anti-inflammatory+activity+of+oral+nanotherapeutics.">Effect of particle size on the cellular uptake and anti-inflammatory activity of oral nanotherapeutics.</a> Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 187, 110880 (2020).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+surface+charge-dependent+cellular+uptake+efficiency+of+upconversion+nanostructures+revealed+by+single-particle+optical+microscopy.">The morphology and surface charge-dependent cellular uptake efficiency of upconversion nanostructures revealed by single-particle optical microscopy.</a> Chemical Science. 13 (12), 3610 (2022).</li><li>Xi, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co2-responsive+pickering+emulsions+stabilized+by+soft+protein+particles+for+interfacial+biocatalysis.">Co2-responsive pickering emulsions stabilized by soft protein particles for interfacial biocatalysis.</a> Chemical Science. 13 (10), 2884-2890 (2022).</li><li>Trivedi, R. P., Klevets, I. I., Senyuk, B., Lee, T., Smalyukh, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconfigurable+interactions+and+three-dimensional+patterning+of+colloidal+particles+and+defects+in+lamellar+soft+media.">Reconfigurable interactions and three-dimensional patterning of colloidal particles and defects in lamellar soft media.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 109 (13), 4744-4749 (2012).</li><li>De Araujo, A. D., Hoang, H. N., Lim, J., Mak, J. Y. W., Fairlie, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+electrostatic+and+hydrophobic+surfaces+of+aromatic+rings+to+enhance+membrane+association+and+cell+uptake+of+peptides.">Tuning electrostatic and hydrophobic surfaces of aromatic rings to enhance membrane association and cell uptake of peptides.</a> Angewandte Chemie. 61 (29), 03995 (2022).</li><li>Waku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+hydrophilic-hydrophobic+balance+of+antigen-loaded+peptide+nanofibers+on+their+cellular+uptake,+cellular+toxicity,+and+immune+stimulatory+properties.">Effect of the hydrophilic-hydrophobic balance of antigen-loaded peptide nanofibers on their cellular uptake, cellular toxicity, and immune stimulatory properties.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3781 (2019).</li><li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+soft+pickering+emulsifier+made+from+chitosan+and+peptides+endows+stimuli-responsiveness,+bioactivity+and+biocompatibility+to+emulsion.">A soft pickering emulsifier made from chitosan and peptides endows stimuli-responsiveness, bioactivity and biocompatibility to emulsion.</a> Carbohydrate Polymers. 277, 118768 (2022).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+in+vitro/vivo+evaluation+of+drug+nanocrystals+self-stabilized+pickering+emulsion+for+oral+delivery+of+quercetin.">Fabrication and in vitro/vivo evaluation of drug nanocrystals self-stabilized pickering emulsion for oral delivery of quercetin.</a> Pharmaceutics. 14 (5), 897 (2022).</li><li>Ji, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell-structured+silica/polyacrylate+particles+prepared+by+pickering+emulsion:+influence+of+the+nucleation+model+on+particle+interfacial+organization+and+emulsion+stability.">Core-shell-structured silica/polyacrylate particles prepared by pickering emulsion: influence of the nucleation model on particle interfacial organization and emulsion stability.</a> Nanoscale Research Letters. 9 (1), 534 (2014).</li><li>Chen, l., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+proteins+with+bicinchoninic+acid+(bca):+resonance+raman+and+surface-enhanced+resonance+raman+scattering-based+methods.">Quantitative evaluation of proteins with bicinchoninic acid (bca): resonance raman and surface-enhanced resonance raman scattering-based methods.</a> Analyst. 137 (24), 5834-5838 (2012).</li><li>Colino, J., Shen, Y., Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+pulsed+with+intact+streptococcus+pneumoniae+elicit+both+protein-+and+polysaccharide-specific+immunoglobulin+isotype+responses+in+vivo+through+distinct+mechanisms.">Dendritic cells pulsed with intact streptococcus pneumoniae elicit both protein- and polysaccharide-specific immunoglobulin isotype responses in vivo through distinct mechanisms.</a> The Journal of Experimental Medicine. 195 (1), 1-13 (2002).</li><li>Zhang, Y., Wu, J., Zhang, H., Wei, J., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles-mimetic+encapsulation+improves+oncolytic+viro-immunotherapy+in+tumors+with+low+coxsackie+and+adenovirus+receptor.">Extracellular vesicles-mimetic encapsulation improves oncolytic viro-immunotherapy in tumors with low coxsackie and adenovirus receptor.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 574007 (2020).</li><li>Cappellano, G., Abreu, H., Casale, C., Dianzani, U., Chiocchetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-microparticle+platforms+in+developing+next-generation+vaccines.">Nano-microparticle platforms in developing next-generation vaccines.</a> Vaccines. 9 (6), 606 (2021).</li><li>McClelland, R. D., Culp, T. N., Marchant, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+and+confocal+immunofluorescence+microscopy+of+virus-host+cell+interactions.">Imaging flow cytometry and confocal immunofluorescence microscopy of virus-host cell interactions.</a> Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 11, 749039 (2021).</li><li>Konry, T., Sarkar, S., Sabhachandani, P., Cohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+tools+and+technology+for+analysis+of+single+cells+and+cell-cell+interaction.">Innovative tools and technology for analysis of single cells and cell-cell interaction.</a> Annual Reviews of Biomedical Engineering. 18 (1), 259-284 (2016).</li><li>D'Aurelio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+EIS+and+QCM+nanoMIP-based+sensors+for+morphine.">A comparison of EIS and QCM nanoMIP-based sensors for morphine.</a> Nanomaterials. 11 (12), 3360 (2021).</li><li>Li, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+exosomes+for+translational+nanomedicine.">Artificial exosomes for translational nanomedicine.</a> Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).</li><li>Rydell, G. E., Dahlin, A. B., Hook, F., Larson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QCM-D+studies+of+human+norovirus+VLPs+binding+to+glycosphingolipids+in+supported+lipid+bilayers+reveal+strain-specific+characteristics.">QCM-D studies of human norovirus VLPs binding to glycosphingolipids in supported lipid bilayers reveal strain-specific characteristics.</a> Glycobiology. 19 (11), 1176-1184 (2009).</li></ol>

Vi udviklede PLGA nanopartikelstabiliseret olie/vandemulsion som et leveringssystem til forbedret antigeninternalisering. Den forberedte PNPE havde en tæt pakket overflade til at understøtte landingsstedet og unik blødhed og fluiditet for potent cellulær kontakt med immuncellemembranen. Desuden tilbød olie/vand-grænsefladen antigenbelastning med højt indhold, og amfifil PLGA gav PNPE høj stabilitet til transport af antigener til immunceller. PNPE kunne hurtigt klæbe til overfladen af cellerne, hvilket indikerer,...

For at bekæmpe epidemiske, kroniske og smitsomme sygdomme er det bydende nødvendigt at udvikle effektive adjuvanser til profylaktiske og terapeutiske vaccinationer 1,2. Ideelt set bør adjuvanserne have fremragende sikkerhed og immunaktivering 3,4,5. Effektiv optagelse og proces af antigener af antigenpræsenterende celler (APC'er) menes at være et væsentligt stadium i nedstrøms signalkaskader og initiering af immunresponset 6,7,8. Derfor er det effektive strategier til at forbedre effektiviteten af vacciner at få en klar forståelse af mekanismen for interaktion mellem immunceller og antigener og designe adjuvanser til at forbedre internaliseringen.
Mikro-/nanopartikler med unikke egenskaber er tidligere blevet undersøgt som antigenafgivelsessystemer til at formidle den cellulære optagelse af antigener og den cellulære interaktion med patogenassocierede molekylære mønstre 9,10. Ved kontakt med celler begynder leveringssystemer at interagere med den ekstracellulære matrix og cellemembran, hvilket førte til internalisering og efterfølgende cellulære reaktioner11,12. Tidligere undersøgelser har vist, at internalisering af partikler finder sted gennem cellemembran-partikeladhæsion13, efterfulgt af fleksibel deformation af cellemembranen og diffusion af receptoren til overflademembranen14,15. Under disse omstændigheder afhænger leveringssystemets egenskaber af tilhørsforholdet til APC, som efterfølgende påvirker optagelsesmængden16,17.
For at få indsigt i designet af leveringssystemet til forbedret immunrespons har omfattende bestræbelser været fokuseret på undersøgelsen af forholdet mellem partiklernes egenskaber og cellulær optagelse. Den foreliggende undersøgelse stammer fra den observation, at faste mikro-/nanopartikler med forskellige ladninger, størrelser og former ofte studeres i dette lys, mens fluiditetens rolle i antigeninternalisering sjældent undersøges18,19. Faktisk viste de bløde partikler under vedhæftning dynamiske krumningsændringer og laterale diffusioner for at øge kontaktområdet for multivalente interaktioner, som næppe kan replikeres af de faste partikler20,21. Derudover er cellemembraner phospholipid dobbeltlag (sphingolipider eller kolesterol) på optagelsesstedet, og hydrofobe stoffer kan ændre den konformationelle entropi af lipider, hvilket reducerer mængden af energi, der kræves til cellulær optagelse22,23. Således kan forstærkning af mobilitet og fremme af hydrofobicitet af leveringssystemet være en effektiv strategi til styrkelse af antigeninternalisering for at forbedre immunresponset.
Pickeringemulsion, stabiliseret af faste partikler samlet ved grænsefladen mellem to ublandbare væsker, er blevet anvendt i vid udstrækning i det biologiske felt24,25. Faktisk bestemmer de aggregerende partikler på olie/ vand-grænsefladen formuleringen af strukturer på flere niveauer, som fremmer multi-level leveringssystem-cellulære interaktioner og yderligere inducerer multifunktionelle fysiokemiske egenskaber i lægemiddelafgivelse. På grund af deres deformerbarhed og laterale mobilitet forventedes pickeringemulsioner at komme ind i multivalent cellulær interaktion med immunocytterne og blive genkendt af membranproteinerne26. Da olieholdige micellekerner i Pickering-emulsioner ikke er helt dækket af faste partikler, har Pickering-emulsioner desuden huller af forskellig størrelse mellem partikler på olie/vand-grænsefladen, hvilket forårsager højere hydrofobicitet. Det er således afgørende at undersøge affiniteten af Pickering-emulsioner til APC'er og uddybe den efterfølgende internalisering for at udvikle effektive adjuvanser.
Baseret på disse overvejelser konstruerede vi en PLGA nanopartikelstabiliseret Pickering-emulsion (PNPE) som et fluiditetsvaccineleveringssystem, der også hjalp med at få værdifuld indsigt i PNPE's affinitet til BMDC'er og cellulær internalisering. Realtidsadhæsionen af bio-mimetiske ekstracellulære vesikler (bEV'er; en erstatning af BMDC'er) til PNPE blev overvåget via en etiketfri metode ved hjælp af en kvartskrystalmikrobalance med spredningsovervågning (QCM-D). Efter karakterisering af PNPE's affinitet til BMDC'er blev konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) brugt til at bestemme antigenoptagelsen. Resultatet indikerede den højere affinitet af PNPE til BMDC'er og den effektive internalisering af antigenet. Vi forventede, at PNPE ville udvise højere affinitet til APC'er, hvilket bedre kan stimulere internaliseringen af antigener for at forbedre immunresponserne.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AddVax</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Vac-adx-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-70-CS</td>
			<td>70 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 NHS Ester</td>
			<td>YEASEN</td>
			<td>40777ES03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Staining Solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Phalloidin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>CA1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Science</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane emulsification equipment</td>
			<td>Zhongke Senhui Microsphere Technology</td>
			<td></td>
			<td>FM0201/500M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANO ZS</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td>JSM-6700F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membranes</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26780-50-7</td>
			<td>Mw 7,000-17,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly (vinyl alcohol) (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-89-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QSense Silicon dioxide sensor</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td>QSX 303</td>
			<td>Surface roughness &#60; 1 nm RMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Crystal Microbalance</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td>Q-SENSE E4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 basic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C22400500BT</td>
			<td>L-Glutamine, 25 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy (SEM)</td>
			<td>JEOL</td>
			<td></td>
			<td>JSM-6700F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>111-02-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cellular affinity of particle-stabilized emulsion to boost antigen internalization

Den cellulære affinitet af mikro- / nanopartikler er forudsætningen for cellulær genkendelse, cellulær optagelse og aktivering, som er afgørende for lægemiddelafgivelse og immunrespons. Den nuværende undersøgelse stammer fra den observation, at virkningerne af ladning, størrelse og form af faste partikler på celleaffinitet normalt overvejes, men vi indser sjældent den væsentlige rolle, som blødhed, dynamisk omstruktureringsfænomen og kompleks grænsefladeinteraktion spiller i cellulær affinitet. Her udviklede vi poly-mælkesyre-co-glycolsyre (PLGA) nanopartikelstabiliseret Pickering-emulsion (PNPE), der overvandt manglerne ved stive former og simulerede patogenernes fleksibilitet og fluiditet. En metode blev oprettet for at teste affiniteten af PNPE til celleoverflader og uddybe den efterfølgende internalisering af immunceller. Finiteten af PNPE til bio-mimetiske ekstracellulære vesikler (bEV'er) - erstatningen for knoglemarvsdendritiske celler (BMDC'er) - blev bestemt ved hjælp af en kvartskrystalmikrobalance med spredningsovervågning (QCM-D), som muliggjorde realtidsovervågning af celleemulsionsadhæsion. Efterfølgende blev PNPE brugt til at levere antigenet (ovalbumin, OVA), og optagelsen af antigenerne af BMDC'er blev observeret ved anvendelse af konfokal laserscanningsmikroskop (CLSM). Repræsentative resultater viste, at PNPE straks reducerede frekvensen (ΔF), når den stødte på bEV'erne, hvilket indikerer hurtig vedhæftning og høj affinitet af PNPE til BMDC'erne. PNPE viste signifikant stærkere binding til cellemembranen end PLGA-mikropartikler (PMP'er) og AddaVax-adjuvans (betegnet som overfladeaktivt stabiliseret nanoemulsion [SSE]). På grund af den forbedrede cellulære affinitet til immunocytterne gennem dynamiske krumningsændringer og laterale diffusioner blev antigenoptagelsen efterfølgende øget sammenlignet med PMP'er og SSE. Denne protokol giver indsigt i design af nye formuleringer med høj celleaffinitet og effektiv antigeninternalisering, hvilket giver en platform for udvikling af effektive vacciner.

En simpel et-trins sonificering blev brugt til at opnå PNPE. Først forberedte vi ensartede PNP'er til brug som den faste stabilisator (figur 1A). Morfologien af PNP'er blev observeret gennem SEM, hvilket viser, at de for det meste er ensartede og sfæriske (figur 1B). Formuleringernes hydrodynamiske størrelse og zetapotentiale blev påvist via DLS. PNP'ernes diameter var 187,7 ± 3,5 nm, og zetapotentialet var -16,4 ± 0,4 mV (fi...

Watch this Scientific Journal Video about Cellular Affinity of Particle-Stabilized Emulsion to Boost Antigen Internalization at JoVE.com

Cellular Affinity of Particle-Stabilized Emulsion to Boost Antigen Internalization

For rationelt at designe effektive adjuvanser udviklede vi poly-mælkesyre-co-glykolsyre-nanopartikelstabiliseret Pickering-emulsion (PNPE). PNPE havde unik blødhed og en hydrofob grænseflade til potent cellulær kontakt og tilbød antigenbelastning med højt indhold, hvilket forbedrede leveringssystemets cellulære affinitet til antigenpræsenterende celler og inducerede effektiv internalisering af antigener.

Cellulær affinitet af partikelstabiliseret emulsion for at øge antigeninternalisering

The cellular affinity of micro-/nanoparticles is the precondition for cellular recognition, cellular uptake, and activation, which are essential for drug ...

Vi udviklede PLGA nanopartikler stabiliseret Pickering emulsion. Pickering-emulsionen forbedrede den cellulære affinitet til antigenproteinceller og inducerede effektiv internalisering af antigener. De nanopartikelstabiliserede Pickering-emulsioner var lette at forberede og levere antigen effektivt.Derudover blev en metode brugt til at overvåge emulsionens affinitet til celle og uddybe internaliseringen. Denne protokol giver indsigt i design af nye formuleringer med høj celleeffektivitet og effektiv antigeninternalisering, som giver en platform for udvikling af effektive vacciner. Til at begynde med tilsættes 100 milligram polymælkesyre-co-glycolsyre til 10 ml acetone og ethanolblanding i et forhold på fire til en for at tjene som oliefasen.Anbring 20 ml PVA vandig opløsning under røghætten og omrør magnetisk ved 400 rotationer pr. Minut. Tilsæt fem milliliter af oliefasen i PVA-opløsningen dråbe for dråbe ved hjælp af en sprøjtepumpe. Rør derefter blandingen i røghætten, indtil de organiske opløsningsmidler fordamper fuldstændigt.Efter fordampning af organiske opløsningsmidler centrifugeres blandingen ved 15.000 G.Vask tre eller flere gange, indtil det endelige vaskevand er klart og gennemsigtigt. Suspender de vaskede PLGA-nanopartikler i to milliliter deioniseret vand og frys blandingen ved 80 grader Celsius i 24 timer. For at karakterisere størrelsen og zetapotentialet for PLGA-nanopartikler tilsættes 10 mikroliter PLGA-nanopartikler i en milliliter deioniseret vand for at opnå en fortyndingsopløsning og overføre fortyndingsopløsningen til en DTS1070-celle.Tænd for computeren og den dynamiske lysspredningsanalysator. Placer derefter DTS1070-cellen i DLS-systemet. Klik på Zetasizer-softwaren, og opret en ny målefil for at konfigurere bestemmelsesproceduren.Start derefter bestemmelsesproceduren for at opnå partikelstørrelsen og zeta-potentialefordelingen. For at forberede PLGA nanopartikler stabiliseret Pickering emulsion, eller PNPE, tilsættes frysetørrede PLGA nanopartikler til deioniseret vand i en koncentration på fire milligram per milliliter og derefter tilsættes squalane som oliefasen. Forbered PNPE via et-trins sonikering i fem minutter ved 100 watt i en vandbad sonikator.Fortynd 20 mikroliter PNPE og en milliliter deioniseret vand. Slip 20 mikroliter af emulsionen på diaset. Overhold emulsionens morfologi og homogenitet ved hjælp af optisk mikroskopi ved 40 gange forstørrelse og få fotografier.Tænd for spin coateren ved at trykke på tænd / sluk-knappen. Tryk på kontrolknappen, og indstil belægningstid og hastighed. Tilslut nitrogenrøret til spincoateren, og juster fraktioneringen af gascylinderen til 0,4 kilopascal.Placer den rene chip på spincoaterens sugekop. Tilsæt 100 mikroliter poly-l-lysin dråbevis til midten af siliciumdioxidsensoren og luk topdækslet på spin coateren. Tryk på startknappen for at begynde at belægge prøven og stoppe maskinen, når den er færdig.Sluk for vakuumpumpen, sluk for tænd / sluk- og kontrolknapperne, og fjern poly-l-lysinmodificeret siliciumdioxidsensor. For at bestemme vedhæftningen af biomimetiske ekstracellulære vesikler til PNPE skal du tænde computeren, den elektroniske enhed og den peristaltiske pumpe og aktivere temperaturreguleringen nederst til højre i softwaren for at sikre, at den indstillede temperatur er ca. en grad Celsius under stuetemperatur. Anbring poly-l-lysinmodificerede siliciumdioxidsensorer i flowcellen i henhold til betjeningsvejledningen, og tilslut målelinjen mellem flowcellen og flowpumpen.Placer flowcellen inde i flowmodulsystemet. Klik på værktøjslinjen Anskaffelse, og vælg Opsætningsmåling for at søge efter 1, 3, 5, 7, 9 og 11 oktaver af chippen i den anvendte kanal. For at rette grundlinjen skal du klikke på Start måling for at lade luft komme ind i flowmodulet, indtil luftbasislinjen er glat.Efter at have flydende deioniseret vand i 10 til 15 minutter for at muliggøre opløsningens basisligevægt igen, pumpes den forberedte PNPE-opløsning ind i flowmodulet med en strømningshastighed på 50 mikroliter pr. Minut for at opnå ligevægtadsorption på siliciumdioxidsensoren. Pump den forberedte biomimetiske ekstracellulære vesikelopløsning ind i flowmodulet med en strømningshastighed på 50 mikroliter pr. Minut for at spore processen med bEV-vedhæftning til PNPE-overfladen. Inkuber knoglemarven dendritiske celler med 1640 komplette medier i syv dage og frø dem derefter i små konfokale laserskåle ved 1 gange 10 til 6 pr. brønd natten over ved 37 grader Celsius og en 5% kuldioxidinkubator.Bland 0,5 ml cyanin 5 mærket ovalbumin med 0,5 ml PNPE i en time og fjern det flydende antigen ved centrifugering ved 5.000 G i 20 minutter for at udvikle vaccineformulering. Efter re-suspension med 200 mikroliter deioniseret vand, tilsættes 10 mikroliter af formuleringen i de små konfokale laserskåle under en super ren bænk og samkultur med knoglemarvsdendritiske celler i seks timer. Efter fjernelse af kulturvæsken fra cellerne vaskes dem to gange med forvarmet fosfatbufferet saltvand.Cellerne fastgøres med 4% formaldehydopløsning og PBS i 10 minutter ved stuetemperatur. Cellerne vaskes med PBS to eller tre gange ved stuetemperatur i 10 minutter hver. Gennemtræng cellerne med 100 mikroliter 0,5% Triton X-100 opløsning i fem minutter ved stuetemperatur.Efter vask af cellerne igen med PBS dækkes cellerne på glasbundskålen i de små konfokale laserskåle med 200 mikroliter fluoresceinisothiocyanat konjugeret phalloidin-arbejdsopløsning og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke. Efter vask af cellerne med PBS tre gange i fem minutter hver, restain kernerne med 200 mikroliter DAPI-opløsning i ca. 30 sekunder. Til billedanalyse skal du tænde for konfokalmikroskopets hardware i rækkefølge inklusive laser, konfokal, mikroskop og computer.Klik på softwaren, og vælg Nikon Confocal for at få adgang til testsystemet. I konfokalmikroskopsystemet skal du tænde de forskellige enheder i den angivne rækkefølge. Først skal du konfigurere FITC-, DAPI- og Cy5-kanalerne og justere den tilsvarende HV og offset.Efter at have valgt 100 gange olielinsen og lagt en dråbe cedertræolie på toppen, placeres de små konfokale laserskåle indeholdende farvede knoglemarvsdendritiske celler på mikroskopstadiet. Klik på scanningsknappen. Under fluorescensmikroskop lokaliseres celler af interesse ved at flytte x-aksen, y-aksen og z-aksen.Indstil laserintensiteten, billedstørrelsen og andre parametre for at muliggøre scanning af konfokale billeder i høj kvalitet. Til sidst skal du klikke på Capture-knappen og gem billederne. Vedhæftningen af biomimetiske ekstracellulære vesikler til PNPE blev sporet ved hjælp af QCM-D.Et øjeblikkeligt fald i frekvensen indikerede en hurtig vedhæftning af biomimetiske ekstracellulære vesikler til PNPE efter mødet. Desuden faldt delta F med stigende biomimetisk ekstracellulær vesikelkoncentration, hvilket afspejler en koncentrationsafhængig effekt. PLGA-mikropartikler og overfladeaktivt stabiliseret nanoemulsion var svagt bundet til biomimetiske ekstracellulære vesikler, selv ved en høj koncentration på 80 mikrogram pr. milliliter, hvilket sandsynligvis skyldtes mangel på kontaktsteder med immuncellerne.Cyanin-5 ovalbuminfluorescerende signal indikerede, at den samlede mængde antigen internaliseret i celler er signifikant højere i den PNPE-behandlede gruppe sammenlignet med den i PLGA-mikropartikler og overfladeaktivt stabiliserede nanoemulsionsbehandlede gruppe. Den kvantitative analyse af cellulær optagelse viste en signifikant højere relativ intensitet af fluorescens og knoglemarv dendritiske celler behandlet med PNPE end hos dem, der blev behandlet med PLGA-mikropartikler og overfladeaktivt stabiliseret nanoemulsion. De opnåede resultater viste, at PNPE fremmede antigeninternaliseringen og effektivt leverede antigenet intracellulært.For at opnå homogen emulsion skal blandingen kontinuerligt rystes under sonikering.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modeller og metoder til evaluering Transport af Drug Delivery Systems over cellulære Barrierer

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Udnyttelse af Microscale Silicon udkragninger at Vurdere Cellular kontraktile funktion<em&gt; In Vitro</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Dobbelt Emulsion Generation Ved hjælp af en Polydimethylsiloxan (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: En kraftfuld, Noninvasive tilgang at undersøge cellulære energimetabolisme

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

3D analyse af multi-cellulære svar til Chemoattraktant gradienter

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Using Magnetometry to Monitor Cellular Incorporation and Subsequent Biodegradation of Chemically Synthetized Iron Oxide Nanoparticles

Brug af magnetometri til at overvåge cellulær inkorporering og efterfølgende bionedbrydning af kemisk syntetiserede jernoxidnanopartikler

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized ...