Name: cellular affinity of particle-stabilized emulsion to boost antigen internalization
Uploaded: 2022-09-02T13:00:00
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Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Projekt, das vom National Key Research and Development Program of China (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), From 0 to 1 Original Innovation Project of Basic Frontier Scientific Research Program of Chinese Academy of Sciences (ZDBS-LY-SLH040), der Foundation for Innovative Research Groups der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21821005), unterstützt wurde.

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden vom Institut für Verfahrenstechnik der Chinesischen Akademie der Wissenschaften genehmigt. Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den Vorschriften für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren und der Richtlinie für die ethische Überprüfung von Tieren (China, GB/T35892-2018) durchgeführt.
1. Herstellung und Charakterisierung von PLGA-Nanopartikeln
<ol><li>Herstellung von PLGA-Nanopartikeln (PN...

<ol>
	<li>Ma, G., Gu, Z., Wei, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+vaccine+delivery.">Advanced vaccine delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 183, 114170 (2022).</li><li>Sharma, J., Carson, C. S., Douglas, T., Wilson, J. T., Joyce, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-particulate+platforms+for+vaccine+delivery+to+enhance+antigen-specific+cd8(+)+t-cell+response.">Nano-particulate platforms for vaccine delivery to enhance antigen-specific cd8(+) t-cell response.</a> Methods in Molecular Biology. 2412, 367-398 (2022).</li><li>Nguyen, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+nanocovax,+a+sars-cov-2+recombinant+spike+protein+vaccine:+interim+results+of+a+double-blind,+randomised+controlled+phase+1+and+2+trial.">Safety and immunogenicity of nanocovax, a sars-cov-2 recombinant spike protein vaccine: interim results of a double-blind, randomised controlled phase 1 and 2 trial.</a> The Lancet Regional Health. Western Pacific. 24, 100474 (2022).</li><li>Coates, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+a+trivalent+virus-like+particle+vaccine+against+western,+eastern,+and+venezuelan+equine+encephalitis+viruses:+a+phase+1,+open-label,+dose-escalation,+randomised+clinical+trial.">Safety and immunogenicity of a trivalent virus-like particle vaccine against western, eastern, and venezuelan equine encephalitis viruses: a phase 1, open-label, dose-escalation, randomised clinical trial.</a> The Lancet Infectious Diseases. 22 (8), 1210-1220 (2022).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+a+nanoparticle+therapeutic+vaccine+in+patients+with+chronic+hepatitis+b:+a+randomized+clinical+trial.">Efficacy and safety of a nanoparticle therapeutic vaccine in patients with chronic hepatitis b: a randomized clinical trial.</a> Hepatology. 75 (1), 182-195 (2022).</li><li>Krishnan, R., Kim, J. O., Qadiri, S. S. N., Kim, J. O., Oh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+viral+uptake+and+host-associated+immune+response+in+the+tissues+of+seven-band+grouper+following+a+bath+challenge+with+nervous+necrosis+virus.">Early viral uptake and host-associated immune response in the tissues of seven-band grouper following a bath challenge with nervous necrosis virus.</a> Fish &amp; Shellfish Immunology. 103, 454-463 (2020).</li><li>Mishra, D., Mishra, P. K., Dubey, V., Dabadghao, S., Jain, N. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+through+endocytosis+and+resurfacing+of+tenascin-r.">Extracellular matrix remodeling through endocytosis and resurfacing of tenascin-r.</a> Nature Communications. 12 (1), 7129 (2021).</li><li>Evans, E., Buxbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+of+red-blood-cell+membrane+for+particle+surfaces+measured+by+the+extent+of+particle+encapsulation.">Affinity of red-blood-cell membrane for particle surfaces measured by the extent of particle encapsulation.</a> Biophysical Journal. 34 (1), 1-12 (1981).</li><li>Rohner, N. A., Purdue, L. N., Von Recum, H. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co2-responsive+pickering+emulsions+stabilized+by+soft+protein+particles+for+interfacial+biocatalysis.">Co2-responsive pickering emulsions stabilized by soft protein particles for interfacial biocatalysis.</a> Chemical Science. 13 (10), 2884-2890 (2022).</li><li>Trivedi, R. P., Klevets, I. I., Senyuk, B., Lee, T., Smalyukh, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconfigurable+interactions+and+three-dimensional+patterning+of+colloidal+particles+and+defects+in+lamellar+soft+media.">Reconfigurable interactions and three-dimensional patterning of colloidal particles and defects in lamellar soft media.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 109 (13), 4744-4749 (2012).</li><li>De Araujo, A. D., Hoang, H. N., Lim, J., Mak, J. Y. W., Fairlie, D. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+pulsed+with+intact+streptococcus+pneumoniae+elicit+both+protein-+and+polysaccharide-specific+immunoglobulin+isotype+responses+in+vivo+through+distinct+mechanisms.">Dendritic cells pulsed with intact streptococcus pneumoniae elicit both protein- and polysaccharide-specific immunoglobulin isotype responses in vivo through distinct mechanisms.</a> The Journal of Experimental Medicine. 195 (1), 1-13 (2002).</li><li>Zhang, Y., Wu, J., Zhang, H., Wei, J., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles-mimetic+encapsulation+improves+oncolytic+viro-immunotherapy+in+tumors+with+low+coxsackie+and+adenovirus+receptor.">Extracellular vesicles-mimetic encapsulation improves oncolytic viro-immunotherapy in tumors with low coxsackie and adenovirus receptor.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 574007 (2020).</li><li>Cappellano, G., Abreu, H., Casale, C., Dianzani, U., Chiocchetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-microparticle+platforms+in+developing+next-generation+vaccines.">Nano-microparticle platforms in developing next-generation vaccines.</a> Vaccines. 9 (6), 606 (2021).</li><li>McClelland, R. D., Culp, T. N., Marchant, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+and+confocal+immunofluorescence+microscopy+of+virus-host+cell+interactions.">Imaging flow cytometry and confocal immunofluorescence microscopy of virus-host cell interactions.</a> Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 11, 749039 (2021).</li><li>Konry, T., Sarkar, S., Sabhachandani, P., Cohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+tools+and+technology+for+analysis+of+single+cells+and+cell-cell+interaction.">Innovative tools and technology for analysis of single cells and cell-cell interaction.</a> Annual Reviews of Biomedical Engineering. 18 (1), 259-284 (2016).</li><li>D'Aurelio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+EIS+and+QCM+nanoMIP-based+sensors+for+morphine.">A comparison of EIS and QCM nanoMIP-based sensors for morphine.</a> Nanomaterials. 11 (12), 3360 (2021).</li><li>Li, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+exosomes+for+translational+nanomedicine.">Artificial exosomes for translational nanomedicine.</a> Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).</li><li>Rydell, G. E., Dahlin, A. B., Hook, F., Larson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QCM-D+studies+of+human+norovirus+VLPs+binding+to+glycosphingolipids+in+supported+lipid+bilayers+reveal+strain-specific+characteristics.">QCM-D studies of human norovirus VLPs binding to glycosphingolipids in supported lipid bilayers reveal strain-specific characteristics.</a> Glycobiology. 19 (11), 1176-1184 (2009).</li></ol>

Wir haben die PLGA-Nanopartikel-stabilisierte Öl/Wasser-Emulsion als Abgabesystem für eine verbesserte Antigeninternalisierung entwickelt. Das präparierte PNPE besaß eine dicht gepackte Oberfläche, um den Landeplatz zu unterstützen, und eine einzigartige Weichheit und Fließfähigkeit für einen starken zellulären Kontakt mit der Immunzellmembran. Darüber hinaus bot die Öl/Wasser-Schnittstelle eine hochgradige Antigenbeladung, und amphiphiles PLGA verlieh PNPE eine hohe Stabilität für den Transport von Antigen...

Zur Bekämpfung epidemischer, chronischer und infektiöser Krankheiten ist es unerlässlich, wirksame Adjuvantien für prophylaktische und therapeutische Impfungen zu entwickeln 1,2. Idealerweise sollten die Adjuvantien eine ausgezeichnete Sicherheit und Immunaktivierungbesitzen 3,4,5. Es wird angenommen, dass die effektive Aufnahme und Verarbeitung von Antigenen durch Antigen-präsentierende Zellen (APCs) ein wesentliches Stadium in den nachgeschalteten Signalkaskaden und der Initiierung der Immunantwortist 6,7,8. Daher sind ein klares Verständnis des Mechanismus der Interaktion von Immunzellen mit Antigenen und die Entwicklung von Adjuvantien zur Verbesserung der Internalisierung effiziente Strategien, um die Effizienz von Impfstoffen zu verbessern.
Mikro-/Nanopartikel mit einzigartigen Eigenschaften wurden zuvor als Antigenabgabesysteme untersucht, um die zelluläre Aufnahme von Antigenen und die zelluläre Interaktion mit pathogenassoziierten molekularen Mustern zu vermitteln 9,10. Bei Kontakt mit Zellen beginnen Abgabesysteme mit der extrazellulären Matrix und Zellmembran zu interagieren, was zur Internalisierung und nachfolgenden zellulären Reaktionen führte11,12. Frühere Studien haben ans Licht gebracht, dass die Internalisierung von Partikeln durch Zellmembran-Partikel-Adhäsion13 erfolgt, gefolgt von flexibler Verformung der Zellmembran und Diffusion des Rezeptors zur Oberflächenmembran14,15. Unter diesen Umständen hängen die Eigenschaften des Verabreichungssystems von der Affinität zu APCs ab, die sich anschließend auf die Aufnahmemenge16,17 auswirken.
Um Erkenntnisse über das Design des Abgabesystems für eine verbesserte Immunantwort zu gewinnen, wurden umfangreiche Anstrengungen unternommen, um den Zusammenhang zwischen den Eigenschaften von Partikeln und der zellulären Aufnahme zu untersuchen. Die vorliegende Studie entstand aus der Beobachtung, dass feste Mikro-/Nanopartikel mit unterschiedlichen Ladungen, Größen und Formen oft in diesem Licht untersucht werden, während die Rolle der Fluidität bei der Antigeninternalisierung selten untersucht wird18,19. Tatsächlich zeigten die weichen Partikel während der Adhäsion dynamische Krümmungsänderungen und laterale Diffusionen, um die Kontaktfläche für multivalente Wechselwirkungen zu vergrößern, die von den festen Partikeln kaum repliziert werden können20,21. Darüber hinaus sind Zellmembranen Phospholipiddoppelschichten (Sphingolipide oder Cholesterin) an der Aufnahmestelle, und hydrophobe Substanzen können die Konformationsentropie von Lipiden verändern und die für die zelluläre Aufnahme erforderliche Energiemenge verringern22,23. Daher kann die Verstärkung der Mobilität und die Förderung der Hydrophobie des Abgabesystems eine wirksame Strategie zur Stärkung der Antigeninternalisierung sein, um die Immunantwort zu verbessern.
Pickering-Emulsion, stabilisiert durch feste Partikel, die an der Grenzfläche zwischen zwei nicht mischbaren Flüssigkeiten angeordnet sind, sind im biologischen Bereich weit verbreitet24,25. Tatsächlich bestimmen die aggregierenden Partikel an der Öl-Wasser-Grenzfläche die Formulierung von mehrstufigen Strukturen, die mehrstufige Verabreichungssystem-zelluläre Interaktionen fördern und weitere multifunktionale physikalisch-chemische Eigenschaften bei der Wirkstoffabgabe induzieren. Aufgrund ihrer Verformbarkeit und lateralen Beweglichkeit wurde erwartet, dass Pickering-Emulsionen in multivalente zelluläre Interaktion mit den Immunzyten eintreten und von den Membranproteinen26 erkannt werden. Da ölige Mizellenkerne in Pickering-Emulsionen nicht vollständig mit festen Partikeln bedeckt sind, besitzen Pickering-Emulsionen unterschiedlich große Lücken zwischen Partikeln an der Öl-Wasser-Grenzfläche, die eine höhere Hydrophobie verursachen. Daher ist es entscheidend, die Affinität von Pickering-Emulsionen zu APCs zu untersuchen und die anschließende Internalisierung zu erarbeiten, um effiziente Adjuvantien zu entwickeln.
Basierend auf diesen Überlegungen entwickelten wir eine PLGA-nanopartikelstabilisierte Pickering-Emulsion (PNPE) als Fluiditäts-Impfstoffverabreichungssystem, das auch dazu beitrug, wertvolle Erkenntnisse über die Affinität des PNPE zu BMDCs und die zelluläre Internalisierung zu gewinnen. Die Echtzeit-Adhäsion von biomimetischen extrazellulären Vesikeln (bEVs; ein Ersatz von BMDCs) an PNPE wurde über eine markierungsfreie Methode unter Verwendung einer Quarzkristallmikrowaage mit Dissipationsüberwachung (QCM-D) überwacht. Nach der Charakterisierung der Affinität von PNPE zu BMDCs wurde die konfokale Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) verwendet, um die Antigenaufnahme zu bestimmen. Das Ergebnis zeigte die höhere Affinität von PNPE zu BMDCs und die effiziente Internalisierung des Antigens. Wir erwarteten, dass die PNPE eine höhere Affinität zu APCs aufweisen würde, was die Internalisierung von Antigenen besser stimulieren könnte, um die Immunantwort zu verstärken.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>AddVax</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Vac-adx-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-70-CS</td>
			<td>70 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 NHS Ester</td>
			<td>YEASEN</td>
			<td>40777ES03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Staining Solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Phalloidin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>CA1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Science</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane emulsification equipment</td>
			<td>Zhongke Senhui Microsphere Technology</td>
			<td></td>
			<td>FM0201/500M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANO ZS</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td>JSM-6700F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membranes</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26780-50-7</td>
			<td>Mw 7,000-17,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly (vinyl alcohol) (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-89-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QSense Silicon dioxide sensor</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td>QSX 303</td>
			<td>Surface roughness &#60; 1 nm RMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Crystal Microbalance</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td>Q-SENSE E4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 basic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C22400500BT</td>
			<td>L-Glutamine, 25 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy (SEM)</td>
			<td>JEOL</td>
			<td></td>
			<td>JSM-6700F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>111-02-4</td>
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cellular affinity of particle-stabilized emulsion to boost antigen internalization

Die zelluläre Affinität von Mikro-/Nanopartikeln ist die Voraussetzung für zelluläre Erkennung, zelluläre Aufnahme und Aktivierung, die für die Wirkstoffabgabe und Immunantwort unerlässlich sind. Die vorliegende Studie entstand aus der Beobachtung, dass die Auswirkungen von Ladung, Größe und Form fester Partikel auf die Zellaffinität normalerweise berücksichtigt werden, aber wir erkennen selten die wesentliche Rolle von Weichheit, dynamischem Umstrukturierungsphänomen und komplexer Grenzflächeninteraktion in der Zellaffinität. Hier entwickelten wir die Polymilch-Co-Glykolsäure (PLGA) nanopartikelstabilisierte Pickering-Emulsion (PNPE), die die Mängel starrer Formen überwand und die Flexibilität und Fließfähigkeit von Krankheitserregern simulierte. Es wurde eine Methode entwickelt, um die Affinität von PNPE zu Zelloberflächen zu testen und die anschließende Internalisierung durch Immunzellen zu erarbeiten. Die Affinität von PNPE zu biomimetischen extrazellulären Vesikeln (bEVs) - dem Ersatz für dendritische Knochenmarkzellen (BMDCs) - wurde unter Verwendung einer Quarzkristallmikrowaage mit Dissipationsüberwachung (QCM-D) bestimmt, die eine Echtzeitüberwachung der Zellemulsionsadhäsion ermöglichte. Anschließend wurde das PNPE verwendet, um das Antigen (Ovalbumin, OVA) zu verabreichen, und die Aufnahme der Antigene durch BMDCs wurde mit konfokalem Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) beobachtet. Repräsentative Ergebnisse zeigten, dass die PNPE sofort die Frequenz (ΔF) verringerte, wenn sie auf die bEVs traf, was auf eine schnelle Adhäsion und eine hohe Affinität der PNPE zu den BMDCs hindeutet. PNPE zeigte eine signifikant stärkere Bindung an die Zellmembran als PLGA-Mikropartikel (PMPs) und AddaVax-Adjuvans (bezeichnet als tensidstabilisierte Nanoemulsion [SSE]). Darüber hinaus wurde aufgrund der erhöhten zellulären Affinität zu den Immunzyten durch dynamische Krümmungsänderungen und laterale Diffusionen die Antigenaufnahme im Vergleich zu PMPs und SSE gesteigert. Dieses Protokoll liefert Erkenntnisse für die Entwicklung neuartiger Formulierungen mit hoher Zellaffinität und effizienter Antigeninternalisierung und bietet eine Plattform für die Entwicklung effizienter Impfstoffe.

Eine einfache einstufige Sonifikation wurde verwendet, um PNPE zu erhalten. Zunächst bereiteten wir einheitliche PNPs für den Einsatz als Festkörperstabilisator vor (Abbildung 1A). Die Morphologie der PNPs wurde durch REM beobachtet, was zeigt, dass sie meist einheitlich und kugelförmig sind (Abbildung 1B). Die hydrodynamische Größe und das Zetapotenzial der Formulierungen wurden mittels DLS detektiert. Der Durchmesser der PNPs betrug 187,7 ± 3,5...

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Cellular Affinity of Particle-Stabilized Emulsion to Boost Antigen Internalization

Um effiziente Adjuvantien rational zu gestalten, haben wir die Poly-Milchsäure-Co-Glykolsäure-Nanopartikel-stabilisierte Pickering-Emulsion (PNPE) entwickelt. Das PNPE besaß eine einzigartige Weichheit und eine hydrophobe Schnittstelle für einen potenten zellulären Kontakt und bot eine Antigenladung mit hohem Gehalt, was die zelluläre Affinität des Abgabesystems zu Antigen-präsentierenden Zellen verbesserte und eine effiziente Internalisierung von Antigenen induzierte.

Zelluläre Affinität der partikelstabilisierten Emulsion zur Förderung der Antigeninternalisierung

The cellular affinity of micro-/nanoparticles is the precondition for cellular recognition, cellular uptake, and activation, which are essential for drug ...

Wir haben die PLGA-Nanopartikel-stabilisierte Pickering-Emulsion entwickelt. Die Pickering-Emulsion verbesserte die zelluläre Affinität zu Antigenproteinzellen und induzierte eine effiziente Internalisierung von Antigenen. Die nanopartikelstabilisierten Pickering-Emulsionen waren einfach herzustellen und liefern Antigene effizient.Zusätzlich wurde eine Methode verwendet, um die Affinität der Emulsion zur Zelle zu überwachen und die Internalisierung zu erarbeiten. Dieses Protokoll liefert Erkenntnisse für die Entwicklung neuartiger Formulierungen mit hoher Zelleffizienz und effizienter Antigeninternalisierung, die eine Plattform für die Entwicklung effizienter Impfstoffe bieten. Zu Beginn fügen Sie 100 Milligramm Polymilch-Co-Glykolsäure zu 10 Milliliter Aceton-Ethanol-Mischung in einem Verhältnis von vier zu eins hinzu, um als Ölphase zu dienen.20 Milliliter PVA-wässrige Lösung unter den Abzug geben und bei 400 Umdrehungen pro Minute magnetisch rühren. Fünf Milliliter der Ölphase tropfenweise mit einer Spritzenpumpe in die PVA-Lösung geben. Dann rühren Sie die Mischung im Abzug um, bis die organischen Lösungsmittel vollständig verdampft sind.Nach der Verflüchtigung organischer Lösungsmittel zentrifugieren Sie die Mischung bei 15.000 G.Waschen Sie drei oder mehrmals, bis das endgültige Waschwasser klar und transparent ist. Suspendieren Sie die gewaschenen PLGA-Nanopartikel in zwei Milliliter entionisiertem Wasser und frieren Sie die Mischung bei 80 Grad Celsius für 24 Stunden ein. Um die Größe und das Zetapotenzial von PLGA-Nanopartikeln zu charakterisieren, fügen Sie 10 Mikroliter PLGA-Nanopartikel in einen Milliliter entionisiertes Wasser hinzu, um eine Verdünnungslösung zu erhalten, und übertragen Sie die Verdünnungslösung in eine DTS1070-Zelle.Schalten Sie den Computer und den dynamischen Lichtstreuanalysator ein. Setzen Sie dann die DTS1070-Zelle in das DLS-System ein. Klicken Sie auf die Zetasizer-Software und erstellen Sie eine neue Messdatei, um das Bestimmungsverfahren einzurichten.Starten Sie dann das Bestimmungsverfahren, um die Partikelgröße und Zetapotentialverteilung zu erhalten. Um PLGA-Nanopartikel stabilisierte Pickering-Emulsion oder PNPE herzustellen, fügen Sie gefriergetrocknete PLGA-Nanopartikel zu entionisiertem Wasser in einer Konzentration von vier Milligramm pro Milliliter hinzu und fügen Sie dann Squalan als Ölphase hinzu. Bereiten Sie PNPE über eine einstufige Beschallung für fünf Minuten bei 100 Watt in einem Wasserbadsonikator vor.Verdünnen Sie 20 Mikroliter PNPE und einen Milliliter entionisiertes Wasser. Lassen Sie 20 Mikroliter der Emulsion auf den Objektträger fallen. Beobachten Sie die Morphologie und Homogenität der Emulsion mit optischer Mikroskopie bei 40-facher Vergrößerung und erhalten Sie Fotos.Schalten Sie den Spin Coater ein, indem Sie den Netzschalter drücken. Drücken Sie die Steuertaste und stellen Sie die Beschichtungszeit und -geschwindigkeit ein. Verbinden Sie das Stickstoffrohr mit dem Schleuderbeschichter und stellen Sie die Fraktionierung der Gasflasche auf 0,4 Kilopascal ein.Legen Sie den sauberen Chip auf den Saugnapf des Schleuderbeschichters. Fügen Sie 100 Mikroliter Poly-L-Lysin tropfenweise in die Mitte des Siliziumdioxidsensors und schließen Sie die obere Abdeckung des Schleuderbeschichters. Drücken Sie die Starttaste, um die Beschichtung der Probe zu starten und die Maschine zu stoppen, wenn sie fertig ist.Schalten Sie die Vakuumpumpe aus, schalten Sie die Netz- und Steuertasten aus und entfernen Sie den Poly-L-Lysin-modifizierten Siliziumdioxidsensor. Um die Adhäsion von biomimetischen extrazellulären Vesikeln an PNPE zu bestimmen, schalten Sie den Computer, die elektronische Einheit und die Schlauchpumpe ein und aktivieren Sie die Temperaturregelung unten rechts in der Software, um sicherzustellen, dass die eingestellte Temperatur etwa ein Grad Celsius unter Raumtemperatur liegt. Setzen Sie die Poly-L-Lysin-modifizierten Siliziumdioxidsensoren gemäß der Bedienungsanleitung in die Durchflusszelle ein und verbinden Sie die Messleitung zwischen Durchflusszelle und Durchflusspumpe.Platzieren Sie die Durchflusszelle im Durchflussmodulsystem. Klicken Sie auf die Erfassungssymbolleiste und wählen Sie Messung einrichten, um nach 1, 3, 5, 7, 9 und 11 Oktaven des Chips im verwendeten Kanal zu suchen. Um die Basislinie zu korrigieren, klicken Sie auf Messung starten, damit Luft in das Strömungsmodul eindringen kann, bis die Luftbasislinie glatt ist.Nachdem deionisiertes Wasser 10 bis 15 Minuten lang geflossen ist, um das Ausgangsgleichgewicht der Lösung wieder zu ermöglichen, wird die vorbereitete PNPE-Lösung mit einer Durchflussrate von 50 Mikrolitern pro Minute in das Durchflussmodul gepumpt, um eine Gleichgewichtsadsorption auf dem Siliziumdioxidsensor zu erreichen. Pumpen Sie die vorbereitete biomimetische extrazelluläre Vesikellösung mit einer Durchflussrate von 50 Mikrolitern pro Minute in das Durchflussmodul, um den Prozess der bEV-Adhäsion an der PNPE-Oberfläche zu verfolgen. Inkubieren Sie die dendritischen Knochenmarkzellen mit 1640 vollständigen Medien für sieben Tage und säen Sie sie dann in kleine konfokale Laserschalen bei 1 mal 10 bis 6 pro Vertiefung über Nacht bei 37 Grad Celsius und einem 5% Kohlendioxid-Inkubator.Mischen Sie 0,5 Milliliter Cyanin 5-markiertes Ovalbumin mit 0,5 Milliliter PNPE für eine Stunde und entfernen Sie das fluidische Antigen durch Zentrifugation bei 5.000 G für 20 Minuten, um eine Impfstoffformulierung zu entwickeln. Nach der Resuspension mit 200 Mikrolitern entionisiertem Wasser 10 Mikroliter der Formulierung in die kleinen konfokalen Laserschalen unter einer super sauberen Bank geben und sechs Stunden lang mit dendritischen Knochenmarkzellen kokulturieren. Nachdem Sie die Kulturflüssigkeit aus den Zellen entfernt haben, waschen Sie sie zweimal mit vorgewärmter phosphatgepufferter Kochsalzlösung.Fixieren Sie die Zellen mit 4% Formaldehydlösung und PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen mit PBS zwei- bis dreimal bei Raumtemperatur für jeweils 10 Minuten. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern 0,5% Triton X-100 Lösung für fünf Minuten bei Raumtemperatur.Nachdem Sie die Zellen erneut mit PBS gewaschen haben, bedecken Sie die Zellen auf der Glasbodenschale der kleinen konfokalen Laserschalen mit 200 Mikrolitern Fluorescein-Isothiocyanat-konjugierter Phalloidin-Arbeitslösung und inkubieren Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nachdem die Zellen dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS gewaschen wurden, ruhen Sie die Zellkerne für etwa 30 Sekunden mit 200 Mikrolitern DAPI-Lösung auf. Für die Bildanalyse schalten Sie die konfokale Mikroskophardware nacheinander ein, einschließlich Laser, Konfokal, Mikroskop und Computer.Klicken Sie auf die Software und wählen Sie Nikon Confocal aus, um das Testsystem aufzurufen. Schalten Sie im konfokalen Mikroskopsystem die verschiedenen Einheiten in der angegebenen Reihenfolge ein. Richten Sie zunächst die FITC-, DAPI- und Cy5-Kanäle ein und passen Sie die entsprechenden HV- und Offset-Kanäle an.Nachdem Sie die 100-fache Öllinse ausgewählt und einen Tropfen Zedernöl auf die Oberseite gegeben haben, legen Sie die kleinen konfokalen Laserschalen mit gefärbten dendritischen Knochenmarkzellen auf den Mikroskoptisch. Klicken Sie auf die Schaltfläche Scannen. Unter dem Fluoreszenzmikroskop lokalisieren Sie Zellen von Interesse, indem Sie die x-Achse, y-Achse und z-Achse bewegen.Stimmen Sie die Laserintensität, Bildgröße und andere Parameter ab, um qualitativ hochwertige konfokale Bilder zu scannen. Klicken Sie abschließend auf die Schaltfläche Aufnehmen und speichern Sie die Bilder. Die Adhäsion von biomimetischen extrazellulären Vesikeln an PNPE wurde mit QCM-D verfolgt.Eine sofortige Abnahme der Häufigkeit zeigte eine schnelle Adhäsion von biomimetischen extrazellulären Vesikeln an PNPE nach der Begegnung. Darüber hinaus nahm delta F mit zunehmender biomimetischer extrazellulärer Vesikelkonzentration ab, was einen konzentrationsabhängigen Effekt widerspiegelt. PLGA-Mikropartikel und tensidstabilisierte Nanoemulsionen waren selbst bei hohen Konzentrationen von 80 Mikrogramm pro Milliliter schwach an biomimetische extrazelluläre Vesikel gebunden, was wahrscheinlich auf fehlende Kontaktstellen mit den Immunzellen zurückzuführen war.Das Cyanin-5-Ovalbumin-Fluoreszenzsignal zeigte, dass die Gesamtmenge des in Zellen internalisierten Antigens in der PNPE-behandelten Gruppe signifikant höher ist als in der Gruppe der PLGA-Mikropartikel und der tensidstabilisierten Nanoemulsion. Die quantitative Analyse der zellulären Aufnahme zeigte eine signifikant höhere relative Intensität von Fluoreszenz- und Knochenmark-dendritischen Zellen, die mit PNPE behandelt wurden, als bei denen, die mit PLGA-Mikropartikeln und tensidstabilisierter Nanoemulsion behandelt wurden. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass die PNPE die Antigeninternalisierung förderte und das Antigen effektiv intrazellulär abgab.Um eine homogene Emulsion zu erhalten, muss die Mischung während der Beschallung kontinuierlich geschüttelt werden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Die dreidimensionalen humanen Haut Rekonstruieren Modell: ein Tool für normale Haut und Melanom Progression Study

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Forschung

Biotechnik

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

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Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Die Analyse der zellulären Internalisierung Nanopartikel und Bakterien durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modelle und Methoden zum Transport von Drug Delivery Systems über zelluläre Barrieren Bewerten

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

PLGA-Nanopartikel durch Einzel-oder Doppel-Emulsion mit Vitamin E-TPGS gegründet

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Nutzung von Microscale Siliziumcantilevern to Cellular Kontraktionsfähigkeit beurteilen<em&gt; In-vitro-</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Doppelemulsion Erstellung Mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS) Co-Axial Flow Fokus Geräte-

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: Eine starke, nicht-invasive Ansatz zur zellulären Energiestoffwechsel untersuchen

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

3D-Analyse von multizellulären Reaktionen auf tschoattraktive Verläufe

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Using Magnetometry to Monitor Cellular Incorporation and Subsequent Biodegradation of Chemically Synthetized Iron Oxide Nanoparticles

Verwendung der Magnetometrie zur Überwachung der zellulären Inkorporation und des anschließenden biologischen Abbaus chemisch synthetisierter Eisenoxid-Nanopartikel

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized ...