Name: cellular affinity of particle-stabilized emulsion to boost antigen internalization
Uploaded: 2022-09-02T13:00:00
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この研究は、中国国家重点研究開発プログラム(2021YFE020527、2021YFC2302605、2021YFC2300142)、中国科学院基礎フロンティア科学研究プログラム(ZDBS-LY-SLH040)の0から1のオリジナルイノベーションプロジェクト、中国国家自然科学財団の革新的研究グループ財団(助成金番号21821005)の支援を受けました。

このプロトコルに記載されているすべての方法は、中国科学院プロセスエンジニアリング研究所によって承認されています。すべての動物実験は、実験動物の管理と使用に関する規則および動物の倫理審査に関するガイドライン(中国、GB / T35892-2018)に厳密に従って実施されました。
1. PLGAナノ粒子の作製と特性評価
<ol><li>PLGAナノ粒子(PNP)の調製<ol><li>90°Cの?...

<ol>
	<li>Ma, G., Gu, Z., Wei, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+vaccine+delivery.">Advanced vaccine delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 183, 114170 (2022).</li><li>Sharma, J., Carson, C. S., Douglas, T., Wilson, J. T., Joyce, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-particulate+platforms+for+vaccine+delivery+to+enhance+antigen-specific+cd8(+)+t-cell+response.">Nano-particulate platforms for vaccine delivery to enhance antigen-specific cd8(+) t-cell response.</a> Methods in Molecular Biology. 2412, 367-398 (2022).</li><li>Nguyen, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+nanocovax,+a+sars-cov-2+recombinant+spike+protein+vaccine:+interim+results+of+a+double-blind,+randomised+controlled+phase+1+and+2+trial.">Safety and immunogenicity of nanocovax, a sars-cov-2 recombinant spike protein vaccine: interim results of a double-blind, randomised controlled phase 1 and 2 trial.</a> The Lancet Regional Health. Western Pacific. 24, 100474 (2022).</li><li>Coates, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+a+trivalent+virus-like+particle+vaccine+against+western,+eastern,+and+venezuelan+equine+encephalitis+viruses:+a+phase+1,+open-label,+dose-escalation,+randomised+clinical+trial.">Safety and immunogenicity of a trivalent virus-like particle vaccine against western, eastern, and venezuelan equine encephalitis viruses: a phase 1, open-label, dose-escalation, randomised clinical trial.</a> The Lancet Infectious Diseases. 22 (8), 1210-1220 (2022).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+a+nanoparticle+therapeutic+vaccine+in+patients+with+chronic+hepatitis+b:+a+randomized+clinical+trial.">Efficacy and safety of a nanoparticle therapeutic vaccine in patients with chronic hepatitis b: a randomized clinical trial.</a> Hepatology. 75 (1), 182-195 (2022).</li><li>Krishnan, R., Kim, J. O., Qadiri, S. S. N., Kim, J. O., Oh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+viral+uptake+and+host-associated+immune+response+in+the+tissues+of+seven-band+grouper+following+a+bath+challenge+with+nervous+necrosis+virus.">Early viral uptake and host-associated immune response in the tissues of seven-band grouper following a bath challenge with nervous necrosis virus.</a> Fish &amp; Shellfish Immunology. 103, 454-463 (2020).</li><li>Mishra, D., Mishra, P. K., Dubey, V., Dabadghao, S., Jain, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+uptake+and+generation+of+immune+response+by+murine+dendritic+cells+pulsed+with+hepatitis+b+surface+antigen-loaded+elastic+liposomes.">Evaluation of uptake and generation of immune response by murine dendritic cells pulsed with hepatitis b surface antigen-loaded elastic liposomes.</a> Vaccine. 25 (39-40), 6939-6944 (2007).</li><li>Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., Mccullough, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+internalization+of+foot-and-mouth+disease+virus:+influence+of+heparan+sulfate+binding+on+virus+uptake+and+induction+of+the+immune+response.">Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response.</a> Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).</li><li>Jing, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+artificial+antigens+revealed+extended+membrane+networks+utilized+by+live+dendritic+cells+for+antigen+uptake.">Fluorescent artificial antigens revealed extended membrane networks utilized by live dendritic cells for antigen uptake.</a> Nano Letters. 22 (10), 4020-4027 (2022).</li><li>Meena, J., Goswami, D. G., Anish, C., Panda, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+of+polylactide+particles+induces+size+dependent+cytoskeletal+remodeling+in+antigen+presenting+cells.">Cellular uptake of polylactide particles induces size dependent cytoskeletal remodeling in antigen presenting cells.</a> Biomaterials Science. 9 (23), 7962-7976 (2021).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+delivery+via+cell+membrane+fusion+using+lipopeptide+modified+liposomes.">Drug delivery via cell membrane fusion using lipopeptide modified liposomes.</a> ACS Central Science. 2 (9), 621-630 (2016).</li><li>Rawle, R., Kasson, P., Boxer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+viral+membrane+fusion+from+receptor+binding+by+using+synthetic+dna-lipid+conjugates+totether+influenza+virus+to+model+lipid+membranes.">Disentangling viral membrane fusion from receptor binding by using synthetic dna-lipid conjugates totether influenza virus to model lipid membranes.</a> Biophysical Journal. 111 (1), 123-131 (2016).</li><li>Ha, H. K., Kim, J. W., Lee, M. R., Jun, W., Lee, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+cytotoxicity+of+&#946;-lactoglobulin+nanoparticles:+the+effects+of+particle+size+and+surface+charge.">Cellular uptake and cytotoxicity of &#946;-lactoglobulin nanoparticles: the effects of particle size and surface charge.</a> Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 28 (3), 420-427 (2015).</li><li>Malara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+structure+and+nano-mechanics+determine+megakaryocyte+function.">Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function.</a> Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).</li><li>Dankovich, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+through+endocytosis+and+resurfacing+of+tenascin-r.">Extracellular matrix remodeling through endocytosis and resurfacing of tenascin-r.</a> Nature Communications. 12 (1), 7129 (2021).</li><li>Evans, E., Buxbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+of+red-blood-cell+membrane+for+particle+surfaces+measured+by+the+extent+of+particle+encapsulation.">Affinity of red-blood-cell membrane for particle surfaces measured by the extent of particle encapsulation.</a> Biophysical Journal. 34 (1), 1-12 (1981).</li><li>Rohner, N. A., Purdue, L. N., Von Recum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-based+polymers+provide+long-term+immunotherapeutic+drug+delivery+across+particle+size+ranges+optimal+for+macrophage+targeting.">Affinity-based polymers provide long-term immunotherapeutic drug delivery across particle size ranges optimal for macrophage targeting.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (4), 1693-1700 (2021).</li><li>Zhou, X., Liu, Y., Wang, X. F., Li, X. M., Xiao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+particle+size+on+the+cellular+uptake+and+anti-inflammatory+activity+of+oral+nanotherapeutics.">Effect of particle size on the cellular uptake and anti-inflammatory activity of oral nanotherapeutics.</a> Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 187, 110880 (2020).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+surface+charge-dependent+cellular+uptake+efficiency+of+upconversion+nanostructures+revealed+by+single-particle+optical+microscopy.">The morphology and surface charge-dependent cellular uptake efficiency of upconversion nanostructures revealed by single-particle optical microscopy.</a> Chemical Science. 13 (12), 3610 (2022).</li><li>Xi, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co2-responsive+pickering+emulsions+stabilized+by+soft+protein+particles+for+interfacial+biocatalysis.">Co2-responsive pickering emulsions stabilized by soft protein particles for interfacial biocatalysis.</a> Chemical Science. 13 (10), 2884-2890 (2022).</li><li>Trivedi, R. P., Klevets, I. I., Senyuk, B., Lee, T., Smalyukh, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconfigurable+interactions+and+three-dimensional+patterning+of+colloidal+particles+and+defects+in+lamellar+soft+media.">Reconfigurable interactions and three-dimensional patterning of colloidal particles and defects in lamellar soft media.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 109 (13), 4744-4749 (2012).</li><li>De Araujo, A. D., Hoang, H. N., Lim, J., Mak, J. Y. W., Fairlie, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+electrostatic+and+hydrophobic+surfaces+of+aromatic+rings+to+enhance+membrane+association+and+cell+uptake+of+peptides.">Tuning electrostatic and hydrophobic surfaces of aromatic rings to enhance membrane association and cell uptake of peptides.</a> Angewandte Chemie. 61 (29), 03995 (2022).</li><li>Waku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+hydrophilic-hydrophobic+balance+of+antigen-loaded+peptide+nanofibers+on+their+cellular+uptake,+cellular+toxicity,+and+immune+stimulatory+properties.">Effect of the hydrophilic-hydrophobic balance of antigen-loaded peptide nanofibers on their cellular uptake, cellular toxicity, and immune stimulatory properties.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3781 (2019).</li><li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+soft+pickering+emulsifier+made+from+chitosan+and+peptides+endows+stimuli-responsiveness,+bioactivity+and+biocompatibility+to+emulsion.">A soft pickering emulsifier made from chitosan and peptides endows stimuli-responsiveness, bioactivity and biocompatibility to emulsion.</a> Carbohydrate Polymers. 277, 118768 (2022).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+in+vitro/vivo+evaluation+of+drug+nanocrystals+self-stabilized+pickering+emulsion+for+oral+delivery+of+quercetin.">Fabrication and in vitro/vivo evaluation of drug nanocrystals self-stabilized pickering emulsion for oral delivery of quercetin.</a> Pharmaceutics. 14 (5), 897 (2022).</li><li>Ji, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell-structured+silica/polyacrylate+particles+prepared+by+pickering+emulsion:+influence+of+the+nucleation+model+on+particle+interfacial+organization+and+emulsion+stability.">Core-shell-structured silica/polyacrylate particles prepared by pickering emulsion: influence of the nucleation model on particle interfacial organization and emulsion stability.</a> Nanoscale Research Letters. 9 (1), 534 (2014).</li><li>Chen, l., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+proteins+with+bicinchoninic+acid+(bca):+resonance+raman+and+surface-enhanced+resonance+raman+scattering-based+methods.">Quantitative evaluation of proteins with bicinchoninic acid (bca): resonance raman and surface-enhanced resonance raman scattering-based methods.</a> Analyst. 137 (24), 5834-5838 (2012).</li><li>Colino, J., Shen, Y., Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+pulsed+with+intact+streptococcus+pneumoniae+elicit+both+protein-+and+polysaccharide-specific+immunoglobulin+isotype+responses+in+vivo+through+distinct+mechanisms.">Dendritic cells pulsed with intact streptococcus pneumoniae elicit both protein- and polysaccharide-specific immunoglobulin isotype responses in vivo through distinct mechanisms.</a> The Journal of Experimental Medicine. 195 (1), 1-13 (2002).</li><li>Zhang, Y., Wu, J., Zhang, H., Wei, J., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles-mimetic+encapsulation+improves+oncolytic+viro-immunotherapy+in+tumors+with+low+coxsackie+and+adenovirus+receptor.">Extracellular vesicles-mimetic encapsulation improves oncolytic viro-immunotherapy in tumors with low coxsackie and adenovirus receptor.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 574007 (2020).</li><li>Cappellano, G., Abreu, H., Casale, C., Dianzani, U., Chiocchetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-microparticle+platforms+in+developing+next-generation+vaccines.">Nano-microparticle platforms in developing next-generation vaccines.</a> Vaccines. 9 (6), 606 (2021).</li><li>McClelland, R. D., Culp, T. N., Marchant, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+and+confocal+immunofluorescence+microscopy+of+virus-host+cell+interactions.">Imaging flow cytometry and confocal immunofluorescence microscopy of virus-host cell interactions.</a> Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 11, 749039 (2021).</li><li>Konry, T., Sarkar, S., Sabhachandani, P., Cohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+tools+and+technology+for+analysis+of+single+cells+and+cell-cell+interaction.">Innovative tools and technology for analysis of single cells and cell-cell interaction.</a> Annual Reviews of Biomedical Engineering. 18 (1), 259-284 (2016).</li><li>D'Aurelio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+EIS+and+QCM+nanoMIP-based+sensors+for+morphine.">A comparison of EIS and QCM nanoMIP-based sensors for morphine.</a> Nanomaterials. 11 (12), 3360 (2021).</li><li>Li, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+exosomes+for+translational+nanomedicine.">Artificial exosomes for translational nanomedicine.</a> Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).</li><li>Rydell, G. E., Dahlin, A. B., Hook, F., Larson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QCM-D+studies+of+human+norovirus+VLPs+binding+to+glycosphingolipids+in+supported+lipid+bilayers+reveal+strain-specific+characteristics.">QCM-D studies of human norovirus VLPs binding to glycosphingolipids in supported lipid bilayers reveal strain-specific characteristics.</a> Glycobiology. 19 (11), 1176-1184 (2009).</li></ol>

我々は、抗原インターナリゼーションを強化するための送達システムとして、PLGAナノ粒子安定化油/水エマルジョンを開発しました。調製されたPNPEは、着弾点を支える高密度に充填された表面と、免疫細胞膜との強力な細胞接触のための独特の柔らかさおよび流動性を有していた。さらに、油/水界面はハイコンテント抗原ローディングを提供し、両親媒性PLGAは免疫細胞への抗原輸送に対し?...

流行病、慢性疾患、感染症と闘うためには、予防的および治療的ワクチン接種のための効果的なアジュバントを開発することが不可欠です1,2。理想的には、アジュバントは優れた安全性および免疫活性化を有するべきである3、4、5。抗原提示細胞(APC)による抗原の効果的な取り込みおよびプロセスは、下流のシグナル伝達カスケードおよび免疫応答の開始において不可欠な段階であると考えられている6、7、8。したがって、免疫細胞と抗原の相互作用のメカニズムを明確に理解し、内在化を促進するためのアジュバントを設計することは、ワクチンの効率を高めるための効率的な戦略です。
ユニークな特性を持つマイクロ/ナノ粒子は、抗原の細胞内取り込みおよび病原体関連分子パターンとの細胞相互作用を媒介する抗原送達システムとして以前に研究されてきた9,10。細胞と接触すると、送達系は細胞外マトリックスおよび細胞膜と相互作用し始め、それが内在化およびその後の細胞応答をもたらした11,12。これまでの研究では、粒子の内在化は細胞膜-粒子接着13、続いて細胞膜の柔軟な変形および表面膜への受容体の拡散によって起こることが明らかになった14,15。このような状況下では、送達システムの特性はAPCへの親和性に依存し、APCはその後、取り込み量に影響を与える16,17。
免疫応答を改善するための送達システムの設計に関する洞察を得るために、粒子の特性と細胞取り込みとの関係の調査に広範な努力が注がれてきました。本研究は、様々な電荷、サイズ、形状を有する固体マイクロ/ナノ粒子がこの観点からしばしば研究される一方で、抗原インターナリゼーションにおける流動性の役割はほとんど研究されないという観察から生じた18,19。実際、接着中、軟質粒子は動的曲率変化および横方向拡散を示し、多価相互作用の接触面積を増加させたが、これは固体粒子20,21によってほとんど複製できない。さらに、細胞膜は取り込み部位のリン脂質二重層(スフィンゴ脂質またはコレステロール)であり、疎水性物質は脂質の立体構造エントロピーを変化させ、細胞の取り込みに必要なエネルギー量を減少させる可能性があります22,23。したがって、移動度を増幅し、送達系の疎水性を促進することは、免疫応答を増強するために抗原インターナリゼーションを強化するための有効な戦略であり得る。
ピッカリングエマルジョンは、2つの非混和性液体間の界面に集合した固体粒子によって安定化され、生物学分野において広く使用されている24、25。実際、油/水界面の凝集粒子は、マルチレベルデリバリーシステムと細胞相互作用を促進し、薬物送達における多機能物理化学的特性をさらに誘導するマルチレベル構造の定式化を決定します。それらの変形能および横方向の移動度のために、ピッカリングエマルジョンは免疫細胞との多価細胞相互作用に入り、膜タンパク質によって認識されることが期待された26。さらに、ピッカリングエマルジョンの油性ミセルコアは固体粒子で完全に覆われていないため、ピッカリングエマルジョンは油/水界面の粒子間に異なるサイズのギャップを持ち、疎水性を高めます。したがって、ピカリングエマルジョンのAPCへの親和性を調査し、その後の内在化について詳しく説明して、効率的なアジュバントを開発することが重要です。
これらの考察に基づいて、我々は、PNPEのBMDCおよび細胞内在化への親和性に関する貴重な洞察を得るのにも役立つ流動性ワクチン送達システムとしてPLGAナノ粒子安定化ピッカリングエマルジョン(PNPE)を設計しました。PNPEへの生体模倣細胞外小胞(bEV、BMDCの置換)のリアルタイム接着を、散逸モニタリング付き水晶振動子マイクロバランス(QCM-D)を用いたラベルフリー法 で モニターしました。PNPEのBMDCへの親和性の特性評価に続いて、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)を使用して抗原取り込みを決定しました。その結果、PNPEのBMDCに対する親和性が高く、抗原の効率的なインターナリゼーションが示されました。PNPEはAPCに対してより高い親和性を示し、抗原の内在化をよりよく刺激して免疫応答を増強する可能性があると予想しました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AddVax</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>Vac-adx-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-70-CS</td>
			<td>70 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 NHS Ester</td>
			<td>YEASEN</td>
			<td>40777ES03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Staining Solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Phalloidin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>CA1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Science</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane emulsification equipment</td>
			<td>Zhongke Senhui Microsphere Technology</td>
			<td></td>
			<td>FM0201/500M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANO ZS</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td>JSM-6700F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membranes</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>26780-50-7</td>
			<td>Mw 7,000-17,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly (vinyl alcohol) (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-89-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QSense Silicon dioxide sensor</td>
			<td>Biolin Scientific</td>
			<td>QSX 303</td>
			<td>Surface roughness &#60; 1 nm RMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Crystal Microbalance</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td>Q-SENSE E4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 basic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C22400500BT</td>
			<td>L-Glutamine, 25 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy (SEM)</td>
			<td>JEOL</td>
			<td></td>
			<td>JSM-6700F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>111-02-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cellular affinity of particle-stabilized emulsion to boost antigen internalization

マイクロ/ナノ粒子の細胞親和性は、薬物送達と免疫応答に不可欠な細胞認識、細胞取り込み、および活性化の前提条件です。本研究は、固体粒子の電荷、サイズ、形状が細胞親和性に及ぼす影響が通常考慮されるが、細胞親和性における柔らかさ、動的再構成現象、および複雑な界面相互作用の本質的な役割をほとんど認識していないという観察から生じました。ここでは、硬質形態の欠点を克服し、病原体の柔軟性と流動性をシミュレートするポリ乳酸-co-グリコール酸(PLGA)ナノ粒子安定化ピッカリングエマルジョン(PNPE)を開発しました。PNPEの細胞表面への親和性をテストし、その後の免疫細胞による内在化について詳しく説明する方法を設定しました。骨髄樹状細胞(BMDC)の代替物である生体模倣細胞外小胞(bEV)に対するPNPEの親和性を、細胞乳剤接着のリアルタイムモニタリングを可能にする散逸モニタリング付き水晶振動子マイクロバランス(QCM-D)を用いて決定した。続いて、PNPEを使用して抗原(オボアルブミン、OVA)を送達し、共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を使用してBMDCによる抗原の取り込みを観察しました。代表的な結果は、PNPEがbEVに遭遇するとすぐに頻度(ΔF)が低下することを示し、PNPEのBMDCへの迅速な接着と高い親和性を示しました。 PNPEは、PLGA微粒子(PMP)およびAddaVaxアジュバント(界面活性剤安定化ナノエマルジョン[SSE]と表記)よりも細胞膜への有意に強い結合を示しました。さらに、動的な曲率変化と側方拡散による免疫細胞への細胞親和性の向上により、PMPやSSEと比較して抗原の取り込みが促進されました。このプロトコルは、高い細胞親和性と効率的な抗原インターナリゼーションを備えた新規製剤を設計するための洞察を提供し、効率的なワクチン開発のためのプラットフォームを提供します。

PNPEを得るために、単純なワンステップソニフィケーションを使用しました。まず、固体安定剤として使用する均一なPNPを準備しました(図1A)。PNPの形態はSEMで観察され、ほとんど均一で球形であることがわかりました(図1B)。製剤の流体力学的サイズおよびゼータ電位をDLS を介して 検出した。PNPの直径は187.7 ± 3.5 nmで、ゼータ電位は-16.4 ± 0....

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Cellular Affinity of Particle-Stabilized Emulsion to Boost Antigen Internalization

効率的なアジュバントを合理的に設計するために、ポリ乳酸-コグリコール酸ナノ粒子安定化ピッカリングエマルジョン(PNPE)を開発しました。PNPEは、強力な細胞接触のための独特の柔らかさと疎水性界面を有し、ハイコンテント抗原ローディングを提供し、抗原提示細胞への送達システムの細胞親和性を改善し、抗原の効率的な内在化を誘導した。

抗原インターナリゼーションを促進する粒子安定化エマルジョンの細胞親和性

The cellular affinity of micro-/nanoparticles is the precondition for cellular recognition, cellular uptake, and activation, which are essential for drug ...

PLGAナノ粒子安定化ピッカリングエマルジョンを開発しました。ピッカリングエマルジョンは、抗原タンパク質細胞に対する細胞親和性を改善し、抗原の効率的なインターナリゼーションを誘導しました。ナノ粒子安定化ピッカリングエマルジョンは、抗原を効率的に調製および送達することが容易であった。さらに、エマルジョンの細胞への親和性を監視し、内在化について詳しく説明する方法が使用されました。このプロトコルは、高い細胞効率と効率的な抗原インターナリゼーションを備えた新規製剤を設計するための洞察を提供し、効率的なワクチン開発のためのプラットフォームを提供します。はじめに、100ミリグラムのポリ乳酸 - コ - グリコール酸を10ミリリットルのアセトンとエタノールの混合物に4対1の比率で加えて油相として機能させる。20ミリリットルのPVA水溶液をヒュームフードの下に置き、毎分400回転で磁気的に攪拌します。シリンジポンプを使用して、5ミリリットルの油相をPVA溶液に一滴ずつ加えます。次に、有機溶媒が完全に蒸発するまで、ヒュームフード内で混合物を攪拌します。有機溶剤の揮発後、最終的な洗浄水が透明で透明になるまで、混合物を15, 000 Gで3回以上遠心分離します。洗浄したPLGAナノ粒子を2ミリリットルの脱イオン水に再懸濁し、混合物を摂氏80度で24時間凍結します。PLGAナノ粒子のサイズとゼータ電位を特徴付けるには、10マイクロリットルのPLGAナノ粒子を1ミリリットルの脱イオン水に加えて希釈液を得て、その希釈液をDTS1070セルに移します。コンピューターと動的光散乱アナライザの電源を入れます。次に、DTS1070セルをDLSシステムに配置します。Zetasizerソフトウェアをクリックし、新しい測定ファイルを作成して決定手順を設定します。次に決定手順を開始し、粒径およびゼータ電位分布を得る。PLGAナノ粒子安定化ピッカリングエマルジョン(PNPE)を調製するには、凍結乾燥PLGAナノ粒子を1ミリリットルあたり4ミリグラムの濃度で脱イオン水に加え、次に油相としてスクワランを加える。水浴超音波処理器で100ワットで5分間のワンステップ超音波処理を介してPNPEを準備します。20マイクロリットルのPNPEと1ミリリットルの脱イオン水を希釈します。スライドに20マイクロリットルのエマルジョンを落とします。エマルションの形態と均質性を光学顕微鏡で40倍の倍率で観察し、写真を取得します。電源ボタンを押してスピンコーターの電源を入れます。コントロールボタンを押して、コーティングの時間と速度を設定します。窒素パイプをスピンコーターに接続し、ガスボンベの分別を0.4キロパスカルに調整します。きれいなチップをスピンコーターの吸盤に置きます。100マイクロリットルのポリ-l-リジンを二酸化ケイ素センサーの中央に滴下し、スピンコーターの上部カバーを閉じます。スタートボタンを押してサンプルのコーティングを開始し、終了したらマシンを停止します。真空ポンプの電源を切り、電源ボタンと制御ボタンをオフにして、ポリ-L-リジン修飾二酸化ケイ素センサーを取り外します。PNPEへの生体模倣細胞外小胞の接着を確認するには、コンピューター、電子ユニット、および蠕動ポンプの電源を入れ、ソフトウェアの右下にある温度制御をアクティブにして、設定温度が室温より摂氏約1度低いことを確認します。操作手順に従ってポリ-l-リジン修飾二酸化ケイ素センサーをフローセルに配置し、フローセルとフローポンプの間に測定ラインを接続します。フロー モジュール システム内にフロー セルを配置します。「集録」ツールバーをクリックし、「測定のセットアップ」を選択して、使用するチャンネル内のチップの1、3、5、7、9、および11オクターブを検索します。ベースラインを修正するには、[測定の開始]をクリックして、空気のベースラインが滑らかになるまで空気がフローモジュールに入るようにします。脱イオン水を10〜15分間流して溶液のベースライン平衡を再び有効にした後、調製したPNPE溶液を毎分50マイクロリットルの流量でフローモジュールに送り込み、二酸化ケイ素センサーへの平衡吸着を達成します。調製した生体模倣細胞外小胞溶液を毎分50マイクロリットルの流量でフローモジュールにポンプで送り込み、PNPE表面へのbEV接着のプロセスを追跡します。骨髄樹状細胞を1640の完全な培地で7日間インキュベートし、摂氏37度で一晩1ウェルあたり10〜6回、小さな共焦点レーザー皿に播種し、5%二酸化炭素インキュベーターに入れます。0.5ミリリットルのシアニン5標識オボアルブミンを0.5ミリリットルのPNPEと1時間混合し、5, 000Gで20分間遠心分離して流体抗原を除去し、ワクチン製剤を開発します。200マイクロリットルの脱イオン水で再懸濁した後、10マイクロリットルの製剤をスーパークリーンベンチ下の小さな共焦点レーザーディッシュに加え、骨髄樹状細胞と6時間共培養します。細胞から培養液を取り出した後、予め温めたリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄する。細胞を4%ホルムアルデヒド溶液とPBSで室温で10分間固定します。細胞をPBSで室温で2〜3回、それぞれ10分間洗浄します。100マイクロリットルの0.5%Triton X-100溶液で室温で5分間細胞を透過処理します。細胞をPBSで再度洗浄した後、小型共焦点レーザー皿のガラス底皿上の細胞を200マイクロリットルのフルオレセインイソチオシアネート結合ファロイジン作業溶液で覆い、暗所で室温で30分間インキュベートします。細胞をPBSでそれぞれ5分間3回洗浄した後、核を200マイクロリットルのDAPI溶液で約30秒間再染色します。画像解析では、レーザー、共焦点、顕微鏡、コンピューターを含む共焦点顕微鏡ハードウェアを順番にオンにします。ソフトウェアをクリックし、ニコン共焦点を選択してテストシステムに入ります。共焦点顕微鏡システムでは、記載されている順序でさまざまなユニットの電源を入れます。まず、FITC、DAPI、およびCy5チャネルを設定し、対応するHVとオフセットを調整します。次に、100倍のオイルレンズを選択した後、染色された骨髄樹状細胞を含む小さな共焦点レーザー皿を顕微鏡ステージ上に置きます。スキャンボタンをクリックします。蛍光顕微鏡下で、x軸、y軸、z軸を動かして目的の細胞を見つけます。レーザー強度、画像サイズ、その他のパラメータを調整して、高品質の共焦点画像をスキャンできるようにします。最後に、[キャプチャ]ボタンをクリックして画像を保存します。PNPEへの生体模倣細胞外小胞の接着をQCM-Dを用いて追跡した。頻度の即時減少は、遭遇後のPNPEへの生体模倣細胞外小胞の急速な接着を示した。さらに、デルタFは、生体模倣細胞外小胞濃度の増加とともに減少し、濃度依存的な効果を反映している。PLGA微粒子と界面活性剤安定化ナノエマルジョンは、ミリリットルあたり80マイクログラムの高濃度でも生体模倣細胞外小胞に弱く結合しており、これはおそらく免疫細胞との接触部位の欠如に起因していた。シアニン-5オボアルブミン蛍光シグナルは、PNPE処理群では、PLGA微粒子および界面活性剤安定化ナノエマルジョン処理群と比較して、細胞内に取り込まれた抗原の総量が有意に高いことを示しました。細胞取り込みの定量分析は、PLGA微粒子および界面活性剤安定化ナノエマルジョンで処理したものよりも、PNPEで処理した蛍光および骨髄樹状細胞の相対強度が有意に高いことを示した。得られた結果は、PNPEが抗原のインターナリゼーションを促進し、抗原を細胞内に効果的に送達することを実証した。均質なエマルジョンを得るためには、超音波処理中に混合物を連続的に振盪しなければならない。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Using Magnetometry to Monitor Cellular Incorporation and Subsequent Biodegradation of Chemically Synthetized Iron Oxide Nanoparticles

磁気測定を用いて細胞の組み込みとそれに続く化学的合成酸化鉄ナノ粒子の生分解をモニタリングする

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