Name: microdissection of the rodent eye
Uploaded: 2023-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection of the Rodent Eye at JoVE.com

قام الدكتور ألاكناندا ميشرا ، قسم بيولوجيا الخلية والتشريح البشري ، جامعة كاليفورنيا ديفيس ، الولايات المتحدة الأمريكية ، بتدريبنا على هذه الطريقة في المعهد الوطني لعلم المناعة ، نيودلهي. وقد دعم هذا العمل بالمنحة الأساسية التي تلقاها من إدارة التكنولوجيا الأحيائية بحكومة الهند إلى المعهد الوطني لعلم المناعة في نيودلهي. تم منح PS زمالة بحثية من قبل قسم التكنولوجيا الحيوية.

تمت الموافقة على هذا الإجراء من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية التابعة للمعهد الوطني لعلم المناعة ، نيودلهي. الرقم المرجعي التسلسلي للموافقة هو IAEC # 480/18. تم إجراء التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية التنظيمية للجنة الرقابة والإشراف على التجارب على الحيوانات ، وزارة مصايد الأسماك وتربية ا...

<ol>
	<li>Choi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cancer+immunotherapy+using+patient-derived+xenografts+(PDXs)+in+humanized+mice.">Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice.</a> Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li><li>Sutherland, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+of+Highly+Pure+Trabecular+Meshwork+from+Mouse+Eyes+for+Gene+Expression+Analysis.">Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis.</a> J Vis Exp. (136), e57576 (2018).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Claybon, A., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+mouse+eye+for+a+whole+mount+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2563 (2011).</li><li>Steven, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+induction+and+three-dimensional+two-photon+imaging+of+conjunctiva-associated+lymphoid+tissue.">Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).</li><li>Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+wholemount+technique:+A+window+to+understanding+the+brain+and+behaviour.">The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour.</a> Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).</li><li>Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatics+and+lymphangiogenesis+in+the+eye.">Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye.</a> Journal of Ophthalmology. 2012, 783163 (2012).</li><li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood-derived+monocytes+show+neuronal+properties+and+integration+in+immune-deficient+rd1+mouse+model+upon+phenotypic+differentiation+and+induction+with+retinal+growth+factors.">Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412 (2020).</li></ol>

تم العثور على تشريح العين المجهري لتكون مهمة صعبة بسبب صغر حجم وشكل كروية لعين القوارض ، وتتطلب عين القوارض تقنيات مبتكرة للتعامل الفعال8. 
في الطريقة الموضحة الحالية ، يتم الحصول على مقلة عين الفأر المنزوعة النواة مع الجفن الثالث المتصل للتعامل الفعال والسهل. ...

تشريح العين هو تقنية مهمة في أبحاث العيون وقد سمح للباحثين بالوصول إلى أجزاء العين للدراسات المستهدفة. في السابق ، اعتمد باحثو العين على أنسجة العين من الأفراد المرضى في دراساتهم. ومع ذلك ، فإن العدد المتزايد تدريجيا من سلالات نماذج القوارض العينية1 على مر السنين قد قلل من الحاجة إلى أنسجة العين البشرية. سمحت سلالات الفئران هذه بفهم أعمق لأمراض العين والتدخلات. ومع ذلك ، فقد ولدوا أيضا الحاجة إلى تقنيات مبتكرة للتشريح الدقيق للعين. الحجم الصغير ومساحة التشغيل المحدودة يعيقان بشدة الوصول الفعال إلى الأجزاء الفرعية للعين. علاوة على ذلك ، نظرا للتجميع الخلوي المتجانس لأكواب العين الخلفية والأمامية ، من الصعب إجراء تدخلات مستهدفة بعد التسلخ. تقنيات التشريح المجهري الحالية لليزر2 والتشريح المجهري الجراحي 3,4 غير كافية لتلبية متطلبات أبحاث العين. التشريح الدقيق بالليزر فعال جدا في تحليل الخلية الواحدة ، ولكن يجب تشريح الأنسجة المحددة قبل إجراء الليزر2. يمكن لهذه التقنية عزل المناطق الصغيرة ذات الأهمية من الأنسجة التي تم تشريحها مسبقا للتحليل الجزيئي. وبالتالي ، فإن هذه التقنية ليست مناسبة لإعداد حوامل كاملة أو لعزل طبقات العين المعبأة محوريا من أجل التصور الأمثل.
الطريقة الجراحية هي التقنية الأكثر استخداما. تتضمن هذه الطريقة شل حركة العين عبر العصب البصري5 ثم إجراء التشريح. هذه الممارسة شاقة ويمكن أن تلحق الضرر بأي نسيج هش ، حيث تستمر العين الكروية في التحرك أثناء التشريح. على الرغم من كونها مفيدة لعزل الأقسام المختلفة لطبقات الشبكية ، إلا أن هذه التقنية لا يمكنها تحديد الاتجاه المكاني للأنسجة عند التشريح.
أثناء التشريح ، فإن الحفاظ على وجود الغشاء المرفق أو الجفن الثالث (الشكل 1) يقدم مزايا فريدة ومهمة. في هذه الطريقة ، أولا ، يتم استئصال مقلة العين بالجفن الثالث. ثم ، يتم استخدام الجفن الثالث لشل حركة العين6 (الشكل 2 أ). يتبع ذلك ثقب مقلة العين من خلال حافة القرنية واستخدام الشق كنقطة دخول (الشكل 2B ، C). بعد ذلك ، يتم فصل النظارات عن طريق قطع على طول المحيط الأمامي والخلفي (الشكل 2D-G). من خلال تشريح فنجان العين الخلفي بشكل أكبر ، يمكن تحديد الطبقة الشفافة من الشبكية العصبية وتقشيرها بلطف. ثم يتم إجراء ثلاث أو أربع قطع متساوية البعد في الكؤوس الأمامية والخلفية نصف الكروية التي تم الحصول عليها ، والتي تسمح لهذه الأكواب على شكل زهرة بالسقوط بشكل مسطح على شريحة (الشكل 2H).
يساعد الجفن الثالث في التعامل السهل والفعال أثناء التشريح ، وبالتالي ضمان الحد الأدنى من الضرر للأنسجة أثناء الوصول إلى طبقات العين المختلفة وعند إنتاج حوامل كاملة. علاوة على ذلك ، يساعد وجود الجفن الثالث في تحديد وفحص التدخلات الموضعية أثناء التصور.
تم إجراء الإجراء ، في مختبرنا ، على سلالة فأر CBA / J أو rd1 في P28 من أي جنس. يمكن إجراء الإجراء على أي سلالة أو عمر أو جنس وليس له تحيز وفقا لهذه الخصائص.
تم شراء الحيوانات من مصادر تجارية (انظر جدول المواد) وصيانتها في مرفق الحيوانات الصغيرة (SAF) في المعهد الوطني لعلم المناعة (NII). تم احتجازهم في أقفاص فردية جيدة التهوية (IVC) وحصلوا على إمكانية الوصول إلى الماء والغذاء المعقم المحمض. تم الحفاظ عليها عند 21-23 درجة مئوية ومع دورة ضوء / مظلمة 14 ساعة / 10 ساعات.
فيما يلي طريقة جراحية معدلة للتشريح الدقيق لعين الفأر.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetaminophen (Biocetamol)</td>
			<td>EG Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Kit (DEA)</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated analyser</td>
			<td>Tulip, Alto Santracruz, India</td>
			<td>Screen Maaster 3000</td>
			<td>Biochemical analyser for liver functional test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine (Povidon-Iodine Solution)</td>
			<td>Win-Medicare;&#160; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet ( Class I)</td>
			<td>Kartos international; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright Field Microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>LX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBA/J inbred mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No. 000654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime (Taxim)</td>
			<td>AlKem ; India</td>
			<td></td>
			<td>cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Buds</td>
			<td>Pure Swabs Pvt Ltd ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape Sheet</td>
			<td>JSD Surgicals, Delhi, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution, alcoholic</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>HT110132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>Ugo Basile; Italy</td>
			<td>211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Himedia, India</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair removing cream (Veet)</td>
			<td>Reckitt Benckiser , India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Mayer&#39;s</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>MHS16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>RM554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase From Sheep Testes</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>H6254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I.V. Cannula (Plusflon)</td>
			<td>Mediplus, India</td>
			<td>Ref 1732411420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD ; US</td>
			<td>REF 303060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane ( Forane)</td>
			<td>Asecia Queenborough</td>
			<td>No B506</td>
			<td>Inhalation Anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketamax)</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Melonex)</td>
			<td>Intas Pharmaceuticals Ltd; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; 
			curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Histo-Line Laboratories, Italy</td>
			<td>MRS3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Thread</td>
			<td>Mighty ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>GRM 3660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Tears/Eyemist Gel</td>
			<td>Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India</td>
			<td>P3060</td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGOT (ASAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGPT (ALAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryotome E Cryostat</td>
			<td>Thermo Electron Corporation ; US</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade No. 22</td>
			<td>La Medcare, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Board</td>
			<td>Locally made</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical White Tape</td>
			<td>3M India ; India</td>
			<td>1530-1</td>
			<td>Micropore Surgical Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon, Johnson &#38; Johnson, India</td>
			<td>NW 5047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1ml, 26 G)</td>
			<td>Dispo Van; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer (Clipper)</td>
			<td>Philips</td>
			<td>NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Machine</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#39;s E Media</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>AT125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Xylaxin)</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection of the rodent eye

يتضمن تشريح العين الدقيقة لعين القوارض تجزئة مقلة العين المنزوعة النواة مع الغشاء المتصل ، أو الجفن الثالث ، للحصول على أكواب العين الأمامية والخلفية. باستخدام هذه التقنية ، يمكن الحصول على الأجزاء الفرعية للعين ، بما في ذلك أنسجة القرنية والأنسجة العصبية والأنسجة الظهارية الصبغية في شبكية العين (RPE) والعدسة ، من أجل التركيب الكامل ، والتقسيم بالتبريد ، و / أو معلقات الخلية المفردة لنسيج عيني معين. يقدم وجود الجفن الثالث مزايا فريدة ومهمة ، لأنه يفيد في الحفاظ على اتجاه العين ، وهو أمر مهم لفهم فسيولوجيا العين بعد أي تدخل موضعي أو في الدراسات التي تنطوي على تحليل العين المتعلق بالتضاريس المكانية للعين.
في هذه الطريقة ، قمنا باستئصال مقلة العين في التجويف جنبا إلى جنب مع الجفن الثالث عن طريق قطع عضلات العين بعناية وببطء وقطع العصب البصري. تم ثقب مقلة العين من خلال حافة القرنية باستخدام microblade. تم استخدام الشق كنقطة دخول ، مما يسمح بالقطع على طول تقاطع القرنية الصلبة عن طريق إدخال مقص دقيق من خلال نقطة الشق. تم إجراء جروح صغيرة ومستمرة على طول المحيط حتى انفصلت الكؤوس. يمكن تشريحها بشكل أكبر عن طريق تقشير الطبقة الشفافة من الشبكية العصبية برفق باستخدام ملقط خياطة كوليبري للحصول على الشبكية العصبية وطبقات RPE. علاوة على ذلك ، تم إجراء ثلاثة / أربعة قطع متساوية البعد من المحيط بشكل عمودي على المركز البصري حتى تم الوصول إلى العصب البصري. فتح هذا الكؤوس نصف الكروية في شكل زهرة بحيث سقطت مسطحة ويمكن تركيبها بسهولة. تم استخدام هذه التقنية في مختبرنا لتركيب القرنية بالكامل وأقسام الشبكية. يحدد وجود الجفن الثالث الاتجاه الأنفي الصدغي ، والذي يسمح بدراسة تدخلات العلاج بالخلايا المختلفة بعد الزرع ، وبالتالي ، التحقق الفسيولوجي المستهدف الحيوي للتصور والتمثيل الدقيق في مثل هذه الدراسات.

تم إعداد مجموعة كاملة من أنسجة عين الفأر / القرنية rd1 لدراسة تكوين الأوعية اللمفاوية المحتملة في الأنسجة الأمامية / القرنية في حالة مرضية. كان نسيج الملتحمة المرفق من الجفن الثالث بمثابة عنصر تحكم إيجابي ، لأن القرنية تفتقر إلى الأوعية اللمفاوية. بالنسبة للدراسة ، تم تشريح أنسجة القرنية با...

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection of the Rodent Eye at JoVE.com

Microdissection of the Rodent Eye

تقدم هذه الورقة بروتوكولا للتشريح الدقيق للعين في القوارض. تتضمن العملية استئصال مقلة العين جنبا إلى جنب مع الغشاء النيكتيتي (أي الجفن الثالث). ثم يتبع ذلك فصل كؤوس العين الخلفية والأمامية.

التشريح المجهري لعين القوارض

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, ...

اعتمدت أبحاث العين في الأوقات السابقة في الغالب على أنسجة العين من الأفراد المتوفين. ومع ذلك ، على مر السنين ، تم تطوير العديد من نماذج القوارض العينية وتضاءلت الحاجة إلى أنسجة العين البشرية. نظرا لصغر حجمها ومحدودية مساحة العمليات في عين القوارض ، فإن الوصول الفعال إلى الأجزاء الفرعية للعين مقيد بشدة.عادة ، للعمل على عين القوارض ، يتم تجميد العين عن طريق العصب البصري ويتم إجراء التشريح. هذه الممارسة شاقة ويمكن أن تلحق الضرر بالأنسجة الهشة حيث تستمر العين الكروية في التحرك أثناء التشريح. على الرغم من كونها مفيدة في عزل الأقسام المختلفة لطبقات الشبكية ، إلا أن هذه التقنية لا يمكنها تحديد الاتجاه المكاني للأنسجة عند تشريح الأنسجة.علاوة على ذلك ، من الصعب تحديد موقع التدخل المستهدف بعد التشريح بسبب التجمع الخلوي المتجانس لكأس العين الخلفي والأمامي. في هذا الفيديو ، يتم عرض طريقة جراحية معدلة للتشريح المجهري. يقدم وجود الغشاء المرفق ، أو الجفن الثالث ، مزايا فريدة ومهمة.في هذه الطريقة ، يتم أولا استئصال مقلة العين بالجفن الثالث ، ثم يتم استخدام الجفن الثالث لشل حركة العين. يتبعه ثقب مقلة العين من خلال ليمبوس القرنية ، ويتم استخدام الشق كنقطة دخول. ثم ، عن طريق قطع على طول المحيط ، يتم فصل أكواب العين الأمامية والخلفية.من خلال تشريح كوب العين الخلفي بشكل أكبر ، يتم تحديد الطبقة الشفافة من الشبكية العصبية وتقشيرها بلطف. وبالتالي يتم الحصول على الطبقات العصبية و RPE لمزيد من المعالجة. سيمكننا الجفن الثالث من تحديد الاتجاه المكاني لاستئصال العين بعد الاستئصال.دعونا الآن نتبع الإجراء التفصيلي خطوة بخطوة. تمدد عيون القوارض باستخدام قطرة من 0.8 ٪ تروبيكاميد و 5 ٪ من محاليل العيون فينيليفرين ووضع الحيوان في منطقة مظلمة لمدة 30 دقيقة قبل العملية. القتل الرحيم للحيوان عن طريق إعطاء جرعات التخدير خمس مرات داخل الصفاق.الجرعة النموذجية هي 200 ميكرولتر PBS تحتوي على 10 ملغ من الكيتامين وواحد من الزيلازين. تأكد من عدم الاستجابة الكاملة للتحفيز من خلال فحص منعكس الدواسة. ضع الماوس في الاستلقاء الجانبي للسماح بالوصول الكامل إلى العين.احتفظ بملقط خياطة كوليبري ، وملقط منحني ، وشفرة صغيرة بحجم 15 درجة وثلاثة ملليمترات ، ومقص زنبركي صغير ، ومقص صغير بزاوية جاهزة للإجراء. ضع ملقط منحني حول مقلة العين واضغط لتحرير العين من المرفقات الدخيلة. يقع الجفن الثالث ، المعروف أيضا باسم الغشاء النخاعي ، باتجاه الزاوية العليا من الظل الأنفي ويمكن تحديده على أنه نتوء شفاف ثانوي مع حدود مصطبغة.بعد ذلك ، استخدم مقصا صغيرا زنبركيا وقطعه حول مقلة العين. تعمل الجروح الصغيرة المستمرة على تحرير مقلة العين من ملحقات الصلبة. ضع مقصا صغيرا زنبركيا منحنيا تحت مقلة العين لتحرير العين عن طريق قطع العصب البصري.ضع العين المنزوعة النواة في طبق بتري يحتوي على مخزن مؤقت ل PBS بحيث يتم غمر مقلة العين في برنامج تلفزيوني. ستبدأ بعض العضلات أو الأنسجة خارج العين في الطفو بعيدا عن مقلة العين. قم بإزالتها عن طريق قطعها عن مقلة العين باستخدام مقص زنبركي صغير.بعد ذلك ، قم بإزالة العصب البصري من قاعدة مقلة العين للسماح بفصل أفضل للشبكية للاستعدادات الكاملة. ليس من الضروري إزالة العصب البصري لتقسيم الأنسجة. نقل مقلة العين إلى أنبوب 1.5 مل يحتوي على مل واحد من 4٪ بارافورمالدهيد أو PFA.احتفظ بها لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية لتثبيت الأنسجة. من الممكن التوقف عند هذه الخطوة عن طريق ترك الأنسجة في PFA لمدة تصل إلى 12 ساعة عند أربع درجات مئوية. ومع ذلك ، لعزل الخلايا الحية ، لا ينبغي تنفيذ خطوات التثبيت ويجب تنفيذ الإجراء بأكمله بشكل مستمر.بعد تثبيت PFA ، انقل مقلة العين إلى طبق بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني وضعه تحت مجهر تشريح لتنفيذ الإجراء اللاحق. شل حركة مقلة العين عن طريق الضغط باستمرار على الجفن الثالث بإحكام باستخدام ملقط كوليبري للخياطة. الحافة هي تقاطع القرنية الصلبة.قم بعمل شق صغير في الحافة عن طريق ثقبه باستخدام شفرة صغيرة. يفضل إجراء شق مقابل الجفن الثالث. بعد ذلك ، باستخدام هذا الشق كنقطة انطلاق ، باستخدام المقص الدقيق ، قم بعمل جروح صغيرة ومستمرة على طول محيط الحافة الصلبة للقرنية.أولا ، أكمل نصف دائرة من الجروح بدءا من نقطة الشق حتى الجفن الثالث. ثم أكمل نصف الدائرة المتبقية من التخفيضات على الجانب الآخر. أخيرا ، قم بعمل قطع حول الجفن الثالث لفصل الكأس الخلفي والأمامي.قم بإزالة العدسة من الكأس الخلفي باستخدام ملقط للحصول على الكأس الخلفي المكون من الشبكية العصبية وطبقة RPE والكأس الأمامية للقرنية. في حالة العمل مع الأنسجة غير الثابتة ، يمكن الآن هضم الكؤوس الأمامية والخلفية إنزيميا للحصول على تعليق القرنية أو الشبكية أحادي الخلية. لتثبيت الأنسجة ، انقل هذه الأكواب إلى أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من 4٪ PFA لمدة 12 ساعة عند أربع درجات مئوية.بعد التثبيت ، يمكن تضمين الأنسجة في وسط مناسب ويمكن إجراء التقسيم بالتبريد أو تقسيم البارافين للحصول على أقسام القرنية أو الشبكية. أعد إدخال الكوب الخلفي في طبق بتري الذي يحتوي على مخزن مؤقت PBS. الطبقة المعتمة على طبقة RPE المصطبغة هي الشبكية العصبية.انزع الشبكية العصبية باستخدام ملقط ثان. يوصى بشدة بحركة يد لطيفة وخفيفة للغاية حتى لا تتلف الأنسجة. عند العصب البصري ، يمكن إدخال مقص الزنبرك المنحني تحت الشبكية العصبية ، ويمكن إجراء قطع لتحرير الطبقات تماما إذا ظلت الشبكية العصبية متصلة.يمكن أيضا تحرير شبكية العين أو فصلها عن طريق التمسيد بها برفق بفرشاة ناعمة. أعد إدخال الأكواب الأمامية والخلفية في طبق بتري الذي يحتوي على مخزن مؤقت PBS. استخدم مقصا صغيرا بزاوية زنبركية لعمل قطع بجوار الجفن الثالث من المحيط بشكل عمودي باتجاه المركز البصري.الحفاظ على قبضة الجفن الثالث وجعل قطع بجانب القطع الأول. قم بعمل قطع مماثل بين القطع الثاني والجفن الثالث. ثلاثة أو أربعة قطع متساوية البعد تفتح الكؤوس نصف الكروية على شكل زهرة ، والتي تسقط بشكل مسطح ويمكن تركيبها بسهولة.لا تقم بعمل جروح عميقة جدا حتى مركز الكوب ، لأن هذا قد يجعل أقسام الأوراق تنهار أو تنفصل بسهولة. يسمح الوسط السائل لكوب العين الأمامي بالوصول إلى بنية منحنية. اتبع نفس الخطوات المعطاة لإجراء جروح على الكوب الخلفي لإجراء ثلاث أو أربع جروح متساوية البعد على الكوب الأمامي.الأنسجة جاهزة الآن لمزيد من التلطيخ. في هذا الشكل، يوضح الكوب الأمامي بالكامل. تم تشريح أنسجة القرنية كما هو موضح للكشف عن الأوعية اللمفاوية في نسيج الملتحمة المرفق بنشرة القرنية.في هذا الشكل، يوضح الشكل الشبكية العصبية بالكامل. كانت الأوعية الدموية في شبكية العين العصبية ملطخة ب Isolectin ويمكن رؤيتها كأوعية خضراء. في هذه الطريقة ، يتم الحصول على مقلة العين المنزوعة النواة للفئران مع الجفن الثالث المرفق للتعامل الفعال والسهل.الجفن الثالث يجمد مقلة العين تماما ويسمح للتشريح بالمضي قدما بسهولة وبأقل قدر من الأخطاء. هذه الطريقة مفيدة للتقسيم الخاص بأنسجة العين ، وتحليل الخلية الواحدة ، والتركيب الكامل. ومع ذلك ، فإن الحاجة إلى تثبيت الأنسجة المتكررة تجعل الأنسجة غير قابلة للحياة لزراعة الخلايا أو ضرورات الخلايا الحية هذه.ومن ثم ، يجب تنفيذ الإجراء في سلسلة متصلة لعزل الخلايا الحية.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Medicine

Unit 1

The Special Senses

SCIENTISTS IN ACTION

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

نموذج الفأر من القرنية الفحص جيب للدراسة الأوعية الدموية

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

تحسين بروتوكول للتسليخ مجهري ليزر من الجزر البنكرياسية الإنسان من عينات جراحية

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

الليزر التقاط تسليخ مجهري من الإنسان البروستات الظهارة لتحليل الحمض النووي الريبي

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

الكمية قاع العين تألق ذاتي لتقييم أمراض الشبكية

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy (rNAION)

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy rNAION

نموذج القوارض من Nonarteritic الإقفارية العصبي البصري الأمامي (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

صبغة الفلورسنت وصفها من كرات الدم الحمراء والكريات البيض لدراسة ديناميات التدفق في الماوس دوران الشبكية

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

نيوفاسكولاريزيشن آيريس المستحثة بثقب كنموذج الفأر من إيريديس روبيوسيس

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

التقاط الكمي المكانية للمخدرات في الآفات السل الرئوي بالليزر اللوني السائل ميكروديسيكشن الكتلي (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

توصيف رواية الإنسان Organotypic تقنية ثقافة الشبكية

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy

تطبيق التصوير المقطعي للتماسك البصري على نموذج فأر لاعتلال الشبكية

Optical coherence tomography (OCT) offers a noninvasive method for the diagnosis of retinopathy. The OCT machine can capture retinal crosssectional images ...