3.7K Views
•
11:03 min
•
April 21st, 2023
DOI :
April 21st, 2023
•0:07
Introduction
2:16
Preparation
3:15
Enucleation of the Mouse Eye Along with the Third Eyelid
4:03
Clearing the Extraneous Tissue
5:17
Dissection of the Enucleated Eye to Obtain Anterior and Posterior Eyecups
7:28
Isolation of Neural Retina and RPE Layers
8:16
Segmentation of Retinal and RPE Layers for Whole Mounts
9:38
Results
10:12
Conclusion
Transcript
Okulær forskning i tidligere tider var for det meste afhængig af okulært væv fra afdøde individer. I årenes løb er der imidlertid udviklet mange oftalmiske gnavermodeller, og behovet for humant okulært væv er faldet. På grund af den lille størrelse og det begrænsede operationsområde i gnaverens øje er den effektive adgang til de okulære underdele alvorligt begrænset.
For at operere på en gnavers øje immobiliseres øjet typisk via synsnerven, og dissektionen udføres. Denne praksis er vanskelig og kan beskadige det skrøbelige væv, da det sfæriske øje fortsætter med at bevæge sig under dissektionen. På trods af at den er gavnlig ved isolering af de forskellige sektioner af retinale lag, kan denne teknik ikke afgrænse vævets rumlige orientering ved dissektion af vævet.
Endvidere er en målrettet intervention vanskelig at lokalisere efter dissektion på grund af den homogene cellulære samling af den bageste og forreste øjenkop. I denne video demonstreres en modificeret kirurgisk metode til mikrodissektion. Tilstedeværelsen af den vedhæftede niktiterende membran eller det tredje øjenlåg giver unikke og betydelige fordele.
I denne metode er øjet først enukleeret med det tredje øjenlåg, så bruges det tredje øjenlåg til at immobilisere øjet. Det efterfølges af at gennembore øjet gennem hornhinden limbus, og snittet bruges som indgangspunkt. Derefter adskilles forreste og bageste øjenkopper ved at skære langs omkredsen.
Ved at dissekere den bageste øjenkop yderligere identificeres det gennemskinnelige lag af nethinden og skrælles forsigtigt af. De neurale lag og RPE-lagene opnås således til videre behandling. Det tredje øjenlåg vil gøre det muligt for os at afgrænse den rumlige orientering af øjets postenukleation.
Lad os nu følge en detaljeret trin-for-trin procedure. Udvid gnaverøjnene ved hjælp af en dråbe 0,8% tropamid og 5% phenylephrin oftalmiske opløsninger og læg dyret i et mørkt område i 30 minutter før proceduren. Euthanize dyret ved intraperitonealt administration fem gange doser af anæstesi.
En typisk dosis er 200 mikroliter PBS indeholdende 10 mg ketamin og en mg xylazin. Bekræft fuldstændig mangel på respons på stimulus ved at undersøge pedalrefleksen. Placer musen i lateral liggende for at give fuld adgang til øjet.
Hold en Colibri suturerende tang, en buet tang, et mikroblad 15 grader tre millimeter størrelse, fjedermikrosaks og en vinklet fjedermikrosaks klar til proceduren. Placer en buet tang omkring øjeæblet og klem for at frigøre øjet fra fremmede vedhæftede filer. Det tredje øjenlåg, også kendt som niktiteringsmembranen, er placeret mod det øverste hjørne af næsetangenten og kan identificeres som en mindre gennemskinnelig fremspring med pigmenterede grænser.
Brug derefter en fjedermikrosaks og skær rundt om øjeæblet. Små, kontinuerlige snit frigiver øjeæblet fra scleral vedhæftede filer. Placer en buet fjedermikrosaks under øjeæblet for at frigøre øjet ved at skære synsnerven.
Placer det enukleerede øje i en petriskål, der indeholder PBS-buffer, således at øjeæblet er nedsænket i PBS. Nogle ekstraokulære muskler eller væv begynder at flyde væk fra øjet. Fjern dem ved at skære dem af øjeæblet ved hjælp af fjedermikrosaks.
Fjern derefter synsnerven fra bunden af øjeæblet for at muliggøre bedre adskillelse af nethinden til helmonterede præparater. Det er ikke nødvendigt at fjerne synsnerven til vævssektionering. Overfør øjeæblet til et 1,5 ml rør indeholdende en ml 4% paraformaldehyd eller PFA.
Opbevar det i to timer ved fire grader Celsius til vævsfiksering. Det er muligt at holde pause på dette trin ved at lade vævet stå i PFA i op til 12 timer ved fire grader Celsius. For isolering af levende celler bør fikseringstrinnene imidlertid ikke udføres, og hele proceduren skal udføres i kontinuum.
Efter PFA-fiksering overføres øjeæblet til en petriskål, der indeholder PBS, og placeres under et dissekeringsmikroskop for at udføre den efterfølgende procedure. Immobiliser øjeæblet ved at holde det tredje øjenlåg fast med Colibri suturerende tang. Limbus er hornhinden scleral junction.
Lav et lille snit ved limbussen ved at gennembore det ved hjælp af et mikroblad. Snittet er lavet fortrinsvis modsat det tredje øjenlåg. Dernæst skal du bruge dette snit som udgangspunkt med mikrosaksen lave små og kontinuerlige snit langs denne hornhinde scleral limbus omkreds.
Først skal du udfylde en halvcirkel af snit startende fra snitpunktet til det tredje øjenlåg. Afslut derefter den resterende halvcirkel af snit på den anden side. Til sidst skal du lave et snit omkring det tredje øjenlåg for at adskille den bageste og den forreste kop.
Fjern linsen fra den bageste kop ved hjælp af tang for at opnå den bageste kop bestående af neurale nethinden og RPE-laget og hornhinden forreste kop. Hvis der arbejdes med ufikseret væv, kan de forreste og bageste kopper nu enzymatisk fordøjes for at opnå hornhinde eller retinal enkeltcellesuspension. Til fastgørelse af vævene overføres disse kopper til et 1,5 ml rør indeholdende 1 ml 4% PFA i 12 timer ved fire grader Celsius.
Efter fiksering kan vævet indlejres i passende medium, og kryosektionering eller paraffinsektionering kan udføres for at opnå hornhinde eller retinale sektioner. Genindfør den bageste kop i petriskålen, der indeholder PBS-buffer. Et uigennemsigtigt lag på det pigmenterede RPE-lag er den neurale nethinde.
Skræl den neurale nethinden af ved hjælp af en anden tang. En meget blid og let bevægelse af hånden anbefales stærkt for ikke at beskadige vævet. Ved synsnerven, udgang, kan den buede fjedersaks indsættes under neuralnethinden, og der kan laves et snit for helt at frigøre lagene, hvis neuralhinden forbliver fastgjort.
Nethinden kan også frigøres eller løsnes ved forsigtigt at stryge den med en blød børste. Genindfør de forreste og bageste kopper i petriskålen, der indeholder PBS-buffer. Brug en vinklet fjedermikrosaks til at lave et snit ved siden af det tredje øjenlåg fra periferien vinkelret mod det optiske center.
Hold et greb om det tredje øjenlåg og lav et snit ved siden af det første snit. Lav et lignende snit mellem det andet snit og det tredje øjenlåg. Tre eller fire sådanne lige store snit åbner de halvkugleformede kopper i en blomsterform, som falder fladt og let kan monteres.
Foretag ikke meget dybe snit før midten af koppen, da dette kan få bladsektionerne til at falde fra hinanden eller adskille let. Det flydende medium gør det muligt for den forreste øjenkop at opnå en buet struktur. Følg de samme trin som angivet for at lave snit på den bageste kop for at lave tre eller fire lige store snit på den forreste kop.
Vævene er nu klar til yderligere farvning. I denne figur vises hele monteringen af forreste kop. Hornhindevævet blev mikrodissekeret som beskrevet for at afsløre lymfekarrene i det vedhæftede konjunktivvæv i hornhindeindlægssedlen.
I denne figur vises hele neurale nethinden. Den retinale vaskulatur af neuralhinden blev farvet med Isolectin og er synlig som grønne kar. Ved denne metode opnås musenes enukleerede øjeæble med det vedhæftede tredje øjenlåg for effektiv og nem håndtering.
Det tredje øjenlåg immobiliserer øjet fuldstændigt og gør det muligt for dissektionen at fortsætte med lethed og minimale fejl. Denne metode er fordelagtig til okulær vævsspecifik sektionering, enkeltcelleanalyse og helmonteringer. Behovet for gentagen vævsfiksering gør imidlertid vævet uigennemtrængeligt for cellekultur eller sådanne levende cellebehov.
Derfor skal proceduren udføres i kontinuum for levende celleisolering.
Dette papir præsenterer en protokol for okulær mikrodissektion hos gnavere. Processen involverer enukleation af øjeæblet sammen med niktiteringsmembranen (dvs. det tredje øjenlåg). Dette efterfølges derefter af adskillelsen af de bageste og forreste øjenkopper.
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved