Name: microdissection of the rodent eye
Uploaded: 2023-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection of the Rodent Eye at JoVE.com

Dr. Alaknanda Mishra, Institut for Cellebiologi og Human Anatomi, University of California Davis, USA, trænede os i denne metode ved National Institute of Immunology, New Delhi. Dette arbejde blev støttet af kernetilskuddet modtaget fra Department of Biotechnology, Indiens regering til National Institute of Immunology, New Delhi. P.S. blev tildelt et forskningsstipendium af Institut for Bioteknologi.

Denne procedure blev godkendt af den institutionelle dyreetiske komité ved National Institute of Immunology, New Delhi. Godkendelsens serienummer er IAEC#480/18. Forsøgene blev udført i overensstemmelse med reguleringsretningslinjerne fra Udvalget for Kontrol og Tilsyn med Dyreforsøg, Ministeriet for Fiskeri, Husdyrhold og Mejeri, Indiens regering, under tilsyn af en professionel dyrlæge ved SAF, NII.
1. Forberedelse
<ol><li>Udvid gnaverøjnene ved hjælp af en dråbe 0...

<ol>
	<li>Choi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cancer+immunotherapy+using+patient-derived+xenografts+(PDXs)+in+humanized+mice.">Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice.</a> Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li><li>Sutherland, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+of+Highly+Pure+Trabecular+Meshwork+from+Mouse+Eyes+for+Gene+Expression+Analysis.">Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis.</a> J Vis Exp. (136), e57576 (2018).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Claybon, A., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+mouse+eye+for+a+whole+mount+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2563 (2011).</li><li>Steven, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+induction+and+three-dimensional+two-photon+imaging+of+conjunctiva-associated+lymphoid+tissue.">Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).</li><li>Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+wholemount+technique:+A+window+to+understanding+the+brain+and+behaviour.">The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour.</a> Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).</li><li>Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatics+and+lymphangiogenesis+in+the+eye.">Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye.</a> Journal of Ophthalmology. 2012, 783163 (2012).</li><li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood-derived+monocytes+show+neuronal+properties+and+integration+in+immune-deficient+rd1+mouse+model+upon+phenotypic+differentiation+and+induction+with+retinal+growth+factors.">Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412 (2020).</li></ol>

Okulær mikrodissektion har vist sig at være en vanskelig opgave på grund af gnaverøjets lille størrelse og sfæriske form, og gnaverøjet kræver innovative teknikker til effektiv håndtering8. 
I den nuværende demonstrerede metode opnås det enukleerede museøjeæble med det tredje øjenlåg fastgjort til effektiv og nem håndtering. Ved hjælp af det tredje øjenlåg kan øjet immobiliseres fuldstændigt, hvilket gør det muligt for dissektionen at fortsætte me...

Okulær dissektion er en vigtig teknik i oftalmisk forskning og har gjort det muligt for efterforskere at få adgang til segmenterne af øjet til målrettede undersøgelser. Tidligere stolede okulære forskere på det okulære væv fra syge individer til deres studier. Imidlertid har det gradvist voksende antal stammer af oftalmiske gnavermodeller1 gennem årene mindsket behovet for humant okulært væv. Disse musestammer har muliggjort en dybere forståelse af okulær sygdom og interventioner. Men de har også skabt et behov for innovative teknikker til okulær mikrodissektion. Den lille størrelse og det begrænsede operationsområde begrænser i alvorlig grad den effektive adgang til de okulære underdele. På grund af den homogene cellulære samling af de bageste og forreste øjenkopper er det desuden vanskeligt at gennemføre målrettede interventioner efter dissektion. De nuværende mikrodissektionsteknikker for laser2 og kirurgisk mikrodissektion 3,4 er utilstrækkelige til at opfylde sådanne krav til okulær forskning. Lasermikrodissektion er meget effektiv i enkeltcelleanalyse, men det specifikke væv skal mikrodissekeres inden laserproceduren2. Teknikken kan isolere små områder af interesse fra et præ-dissekeret væv til molekylær analyse. Teknikken er således ikke egnet til fremstilling af helmonteringer eller til isolering af aksialt pakkede okulære lag for optimal visualisering.
Den kirurgiske metode er den mest anvendte teknik; Denne metode indebærer immobilisering af øjet via synsnerven5 og derefter udførelse af dissektionen. Denne praksis er vanskelig og kan beskadige ethvert skrøbeligt væv, da det sfæriske øje fortsætter med at bevæge sig under dissektion. På trods af at det er gavnligt for at isolere de forskellige sektioner af retinalagene, kan teknikken ikke afgrænse vævets rumlige orientering ved dissektion.
Under dissektion giver opretholdelse af tilstedeværelsen af den vedhæftede niktiterende membran eller det tredje øjenlåg (figur 1) unikke og betydelige fordele. I denne metode er øjet først enukleeret med det tredje øjenlåg. Derefter bruges det tredje øjenlåg til at immobilisere øjet6 (figur 2A). Dette efterfølges af gennemboring af øjeæblet gennem hornhindens limbus og brug af snittet som indgangspunkt (figur 2B, C). Derefter adskilles øjenkopperne ved at skære langs omkredsen anteriort og posteriort (figur 2D-G). Ved at dissekere den bageste øjenkop yderligere kan det gennemskinnelige lag af nethinden identificeres og forsigtigt skrælles af. Tre eller fire lige store snit foretages derefter i de opnåede halvkugleformede forreste og bageste kopper, som gør det muligt for disse blomsterformede kopper at falde fladt ned på et dias (figur 2H).
Det tredje øjenlåg hjælper med nem og effektiv håndtering under dissektionen, hvilket sikrer minimal skade på vævet, mens du får adgang til de forskellige okulære lag, og når der produceres helemonteringer. Endvidere hjælper tilstedeværelsen af det tredje øjenlåg med at lokalisere og undersøge lokaliserede interventioner under visualisering.
Proceduren i vores laboratorium er blevet udført på en CBA / J eller en rd1 musestamme ved P28 af ethvert køn. Proceduren kan udføres på enhver stamme, alder eller køn af dyr og har ingen bias i henhold til disse egenskaber.
Dyrene blev indkøbt fra kommercielle kilder (se materialetabel) og vedligeholdt på Small Animal Facility (SAF) ved National Institute of Immunology (NII). De blev holdt i individuelle ventilerede bure (IVC) og fik ad libitum adgang til forsuret autoklaveret vand og mad. De blev opretholdt ved 21-23 °C og med en 14 timers/10 timers lys/mørkecyklus.
Nedenfor er en modificeret kirurgisk metode til mikrodissektion af et museøje.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetaminophen (Biocetamol)</td>
			<td>EG Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Kit (DEA)</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated analyser</td>
			<td>Tulip, Alto Santracruz, India</td>
			<td>Screen Maaster 3000</td>
			<td>Biochemical analyser for liver functional test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine (Povidon-Iodine Solution)</td>
			<td>Win-Medicare;&#160; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet ( Class I)</td>
			<td>Kartos international; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright Field Microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>LX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBA/J inbred mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No. 000654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime (Taxim)</td>
			<td>AlKem ; India</td>
			<td></td>
			<td>cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Buds</td>
			<td>Pure Swabs Pvt Ltd ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape Sheet</td>
			<td>JSD Surgicals, Delhi, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution, alcoholic</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>HT110132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>Ugo Basile; Italy</td>
			<td>211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Himedia, India</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair removing cream (Veet)</td>
			<td>Reckitt Benckiser , India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Mayer&#39;s</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>MHS16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>RM554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase From Sheep Testes</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>H6254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I.V. Cannula (Plusflon)</td>
			<td>Mediplus, India</td>
			<td>Ref 1732411420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD ; US</td>
			<td>REF 303060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane ( Forane)</td>
			<td>Asecia Queenborough</td>
			<td>No B506</td>
			<td>Inhalation Anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketamax)</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Melonex)</td>
			<td>Intas Pharmaceuticals Ltd; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; 
			curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Histo-Line Laboratories, Italy</td>
			<td>MRS3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Thread</td>
			<td>Mighty ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>GRM 3660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Tears/Eyemist Gel</td>
			<td>Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India</td>
			<td>P3060</td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGOT (ASAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGPT (ALAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryotome E Cryostat</td>
			<td>Thermo Electron Corporation ; US</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade No. 22</td>
			<td>La Medcare, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Board</td>
			<td>Locally made</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical White Tape</td>
			<td>3M India ; India</td>
			<td>1530-1</td>
			<td>Micropore Surgical Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon, Johnson &#38; Johnson, India</td>
			<td>NW 5047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1ml, 26 G)</td>
			<td>Dispo Van; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer (Clipper)</td>
			<td>Philips</td>
			<td>NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Machine</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#39;s E Media</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>AT125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Xylaxin)</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection of the rodent eye

Den okulære mikrodissektion af gnaverøjet involverer segmenteringen af det enukleerede øjeæble med den vedhæftede niktiterende membran eller tredje øjenlåg for at opnå de forreste og bageste øjenkopper. Med denne teknik kan underdelene af øjet, herunder hornhindevæv, neuralt væv, retinal pigmentepitel (RPE) væv og linse, opnås til helmonteringer, kryosektionering og / eller enkeltcellesuspensioner af et specifikt okulært væv. Tilstedeværelsen af det tredje øjenlåg giver unikke og betydelige fordele, da det gavner vedligeholdelsen af øjets orientering, hvilket er vigtigt for forståelsen af øjenfysiologi efter enhver lokaliseret intervention eller i undersøgelser, der involverer okulær analyse vedrørende øjets rumlige topografi.
I denne metode enucleerede vi øjeæblet ved soklen sammen med det tredje øjenlåg ved forsigtigt og langsomt at skære gennem de ekstraokulære muskler og skære synsnerven. Øjeæblet blev gennemboret gennem hornhinden limbus ved hjælp af et mikroblad. Snittet blev brugt som indgangspunkt, hvilket gjorde det muligt at skære langs hornhinde-scleral-krydset ved at indsætte mikrosaks gennem snitpunktet. Små og kontinuerlige snit langs omkredsen blev lavet, indtil kopperne adskiltes. Disse kunne yderligere dissekeres ved forsigtigt at skrælle det gennemskinnelige lag af nethinden ved hjælp af Colibri suturerende tang for at opnå de neurale nethinden og RPE lag. Endvidere blev der foretaget tre/fire lige store snit fra periferien vinkelret på synscentret, indtil synsnerven blev nået. Dette åbnede de halvkugleformede kopper i en blomsterform, så de faldt fladt og let kunne monteres. Denne teknik er blevet brugt i vores laboratorium til hornhinde helmounts og retinale sektioner. Tilstedeværelsen af det tredje øjenlåg afgrænser den nasal-temporale orientering, som muliggør undersøgelse af forskellige celleterapiinterventioner efter transplantation og dermed den målrettede fysiologiske validering, der er afgørende for visualisering og nøjagtig repræsentation i sådanne undersøgelser.

En hel del rd1 museøje/hornhindevæv blev forberedt til at undersøge potentiel lymfangiogenese i det forreste / hornhindevæv i en syg tilstand. Det vedhæftede konjunktivvæv fra det tredje øjenlåg fungerede som en positiv kontrol, da hornhinden mangler lymfekar. Til undersøgelsen blev hornhindevævet dissekeret med bindehinden og blev fikseret med 4% PFA efterfulgt af permeabilisering og blokering. Vævet blev derefter farvet med et primært antistof mod lymfeendotelmarkøren (LYVE1)9. Dett...

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection of the Rodent Eye at JoVE.com

Microdissection of the Rodent Eye

Dette papir præsenterer en protokol for okulær mikrodissektion hos gnavere. Processen involverer enukleation af øjeæblet sammen med niktiteringsmembranen (dvs. det tredje øjenlåg). Dette efterfølges derefter af adskillelsen af de bageste og forreste øjenkopper.

Mikrodissektion af gnaverøjet

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, ...

Okulær forskning i tidligere tider var for det meste afhængig af okulært væv fra afdøde individer. I årenes løb er der imidlertid udviklet mange oftalmiske gnavermodeller, og behovet for humant okulært væv er faldet. På grund af den lille størrelse og det begrænsede operationsområde i gnaverens øje er den effektive adgang til de okulære underdele alvorligt begrænset.For at operere på en gnavers øje immobiliseres øjet typisk via synsnerven, og dissektionen udføres. Denne praksis er vanskelig og kan beskadige det skrøbelige væv, da det sfæriske øje fortsætter med at bevæge sig under dissektionen. På trods af at den er gavnlig ved isolering af de forskellige sektioner af retinale lag, kan denne teknik ikke afgrænse vævets rumlige orientering ved dissektion af vævet.Endvidere er en målrettet intervention vanskelig at lokalisere efter dissektion på grund af den homogene cellulære samling af den bageste og forreste øjenkop. I denne video demonstreres en modificeret kirurgisk metode til mikrodissektion. Tilstedeværelsen af den vedhæftede niktiterende membran eller det tredje øjenlåg giver unikke og betydelige fordele.I denne metode er øjet først enukleeret med det tredje øjenlåg, så bruges det tredje øjenlåg til at immobilisere øjet. Det efterfølges af at gennembore øjet gennem hornhinden limbus, og snittet bruges som indgangspunkt. Derefter adskilles forreste og bageste øjenkopper ved at skære langs omkredsen.Ved at dissekere den bageste øjenkop yderligere identificeres det gennemskinnelige lag af nethinden og skrælles forsigtigt af. De neurale lag og RPE-lagene opnås således til videre behandling. Det tredje øjenlåg vil gøre det muligt for os at afgrænse den rumlige orientering af øjets postenukleation.Lad os nu følge en detaljeret trin-for-trin procedure. Udvid gnaverøjnene ved hjælp af en dråbe 0,8% tropamid og 5% phenylephrin oftalmiske opløsninger og læg dyret i et mørkt område i 30 minutter før proceduren. Euthanize dyret ved intraperitonealt administration fem gange doser af anæstesi.En typisk dosis er 200 mikroliter PBS indeholdende 10 mg ketamin og en mg xylazin. Bekræft fuldstændig mangel på respons på stimulus ved at undersøge pedalrefleksen. Placer musen i lateral liggende for at give fuld adgang til øjet.Hold en Colibri suturerende tang, en buet tang, et mikroblad 15 grader tre millimeter størrelse, fjedermikrosaks og en vinklet fjedermikrosaks klar til proceduren. Placer en buet tang omkring øjeæblet og klem for at frigøre øjet fra fremmede vedhæftede filer. Det tredje øjenlåg, også kendt som niktiteringsmembranen, er placeret mod det øverste hjørne af næsetangenten og kan identificeres som en mindre gennemskinnelig fremspring med pigmenterede grænser.Brug derefter en fjedermikrosaks og skær rundt om øjeæblet. Små, kontinuerlige snit frigiver øjeæblet fra scleral vedhæftede filer. Placer en buet fjedermikrosaks under øjeæblet for at frigøre øjet ved at skære synsnerven.Placer det enukleerede øje i en petriskål, der indeholder PBS-buffer, således at øjeæblet er nedsænket i PBS. Nogle ekstraokulære muskler eller væv begynder at flyde væk fra øjet. Fjern dem ved at skære dem af øjeæblet ved hjælp af fjedermikrosaks.Fjern derefter synsnerven fra bunden af øjeæblet for at muliggøre bedre adskillelse af nethinden til helmonterede præparater. Det er ikke nødvendigt at fjerne synsnerven til vævssektionering. Overfør øjeæblet til et 1,5 ml rør indeholdende en ml 4% paraformaldehyd eller PFA.Opbevar det i to timer ved fire grader Celsius til vævsfiksering. Det er muligt at holde pause på dette trin ved at lade vævet stå i PFA i op til 12 timer ved fire grader Celsius. For isolering af levende celler bør fikseringstrinnene imidlertid ikke udføres, og hele proceduren skal udføres i kontinuum.Efter PFA-fiksering overføres øjeæblet til en petriskål, der indeholder PBS, og placeres under et dissekeringsmikroskop for at udføre den efterfølgende procedure. Immobiliser øjeæblet ved at holde det tredje øjenlåg fast med Colibri suturerende tang. Limbus er hornhinden scleral junction.Lav et lille snit ved limbussen ved at gennembore det ved hjælp af et mikroblad. Snittet er lavet fortrinsvis modsat det tredje øjenlåg. Dernæst skal du bruge dette snit som udgangspunkt med mikrosaksen lave små og kontinuerlige snit langs denne hornhinde scleral limbus omkreds.Først skal du udfylde en halvcirkel af snit startende fra snitpunktet til det tredje øjenlåg. Afslut derefter den resterende halvcirkel af snit på den anden side. Til sidst skal du lave et snit omkring det tredje øjenlåg for at adskille den bageste og den forreste kop.Fjern linsen fra den bageste kop ved hjælp af tang for at opnå den bageste kop bestående af neurale nethinden og RPE-laget og hornhinden forreste kop. Hvis der arbejdes med ufikseret væv, kan de forreste og bageste kopper nu enzymatisk fordøjes for at opnå hornhinde eller retinal enkeltcellesuspension. Til fastgørelse af vævene overføres disse kopper til et 1,5 ml rør indeholdende 1 ml 4% PFA i 12 timer ved fire grader Celsius.Efter fiksering kan vævet indlejres i passende medium, og kryosektionering eller paraffinsektionering kan udføres for at opnå hornhinde eller retinale sektioner. Genindfør den bageste kop i petriskålen, der indeholder PBS-buffer. Et uigennemsigtigt lag på det pigmenterede RPE-lag er den neurale nethinde.Skræl den neurale nethinden af ved hjælp af en anden tang. En meget blid og let bevægelse af hånden anbefales stærkt for ikke at beskadige vævet. Ved synsnerven, udgang, kan den buede fjedersaks indsættes under neuralnethinden, og der kan laves et snit for helt at frigøre lagene, hvis neuralhinden forbliver fastgjort.Nethinden kan også frigøres eller løsnes ved forsigtigt at stryge den med en blød børste. Genindfør de forreste og bageste kopper i petriskålen, der indeholder PBS-buffer. Brug en vinklet fjedermikrosaks til at lave et snit ved siden af det tredje øjenlåg fra periferien vinkelret mod det optiske center.Hold et greb om det tredje øjenlåg og lav et snit ved siden af det første snit. Lav et lignende snit mellem det andet snit og det tredje øjenlåg. Tre eller fire sådanne lige store snit åbner de halvkugleformede kopper i en blomsterform, som falder fladt og let kan monteres.Foretag ikke meget dybe snit før midten af koppen, da dette kan få bladsektionerne til at falde fra hinanden eller adskille let. Det flydende medium gør det muligt for den forreste øjenkop at opnå en buet struktur. Følg de samme trin som angivet for at lave snit på den bageste kop for at lave tre eller fire lige store snit på den forreste kop.Vævene er nu klar til yderligere farvning. I denne figur vises hele monteringen af forreste kop. Hornhindevævet blev mikrodissekeret som beskrevet for at afsløre lymfekarrene i det vedhæftede konjunktivvæv i hornhindeindlægssedlen.I denne figur vises hele neurale nethinden. Den retinale vaskulatur af neuralhinden blev farvet med Isolectin og er synlig som grønne kar. Ved denne metode opnås musenes enukleerede øjeæble med det vedhæftede tredje øjenlåg for effektiv og nem håndtering.Det tredje øjenlåg immobiliserer øjet fuldstændigt og gør det muligt for dissektionen at fortsætte med lethed og minimale fejl. Denne metode er fordelagtig til okulær vævsspecifik sektionering, enkeltcelleanalyse og helmonteringer. Behovet for gentagen vævsfiksering gør imidlertid vævet uigennemtrængeligt for cellekultur eller sådanne levende cellebehov.Derfor skal proceduren udføres i kontinuum for levende celleisolering.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Medicine

Unit 1

The Special Senses

SCIENTISTS IN ACTION

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Forbedret protokol for Laser mikrodissektion Of Menneskelige pancreasøer fra kirurgiske Prøver

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

Laser-capture mikrodissektion for Human prostata epitel til RNA analyse

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Kvantitativ Fundus Autofluorescens for Vurdering af retinale sygdomme

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy (rNAION)

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy rNAION

Den gnaver Model of Nonarteritic anterior iskæmisk opticusneuropati (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Fluorescerende farvestofmærkning af erytrocytter og leukocytter til at studere strømdynamikken i muskelspiralcirkulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

Punktering-induceret Iris Neovascularization som en musemodel af Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Rumlige kvantificering af narkotika i lungetuberkulose læsioner af Laser fange Microdissection Liquid Chromatography massespektrometri (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Karakterisering af en ny human organotypic retinal kultur teknik

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy

Anvendelse af optisk kohærenstomografi på en musemodel af retinopati

Optical coherence tomography (OCT) offers a noninvasive method for the diagnosis of retinopathy. The OCT machine can capture retinal crosssectional images ...