Name: microdissection of the rodent eye
Uploaded: 2023-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection of the Rodent Eye at JoVE.com

Dr. Alaknanda Mishra, Department of Cell Biology and Human Anatomy, University of California Davis, USA, trainde ons in deze methode aan het National Institute of Immunology, New Delhi. Dit werk werd ondersteund door de kernsubsidie ontvangen van het Department of Biotechnology, Government of India aan het National Institute of Immunology, New Delhi. P.S. kreeg een onderzoeksbeurs van de afdeling Biotechnologie.

Deze procedure werd goedgekeurd door de Institutional Animal Ethics Committee van het National Institute of Immunology, New Delhi. Het serienummer van de goedkeuring is IAEC#480/18. De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de regelgevingsrichtlijnen van het Comité voor controle en toezicht op dierproeven, ministerie van Visserij, Veeteelt en Zuivel, regering van India, onder toezicht van een professionele dierenarts bij de SAF, NII.
1. Voorbereiding
<ol><li>...

<ol>
	<li>Choi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cancer+immunotherapy+using+patient-derived+xenografts+(PDXs)+in+humanized+mice.">Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice.</a> Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li><li>Sutherland, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+of+Highly+Pure+Trabecular+Meshwork+from+Mouse+Eyes+for+Gene+Expression+Analysis.">Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis.</a> J Vis Exp. (136), e57576 (2018).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Claybon, A., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+mouse+eye+for+a+whole+mount+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2563 (2011).</li><li>Steven, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+induction+and+three-dimensional+two-photon+imaging+of+conjunctiva-associated+lymphoid+tissue.">Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).</li><li>Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+wholemount+technique:+A+window+to+understanding+the+brain+and+behaviour.">The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour.</a> Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).</li><li>Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatics+and+lymphangiogenesis+in+the+eye.">Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye.</a> Journal of Ophthalmology. 2012, 783163 (2012).</li><li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood-derived+monocytes+show+neuronal+properties+and+integration+in+immune-deficient+rd1+mouse+model+upon+phenotypic+differentiation+and+induction+with+retinal+growth+factors.">Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412 (2020).</li></ol>

Oculaire microdissectie is een moeilijke taak gebleken vanwege de kleine omvang en bolvorm van het knaagdieroog, en het knaagdieroog vereist innovatieve technieken voor een efficiënte hantering8. 
In de huidige gedemonstreerde methode wordt de enucleated muisoogbol verkregen met het derde ooglid bevestigd voor een effectieve en eenvoudige hantering. Met behulp van het derde ooglid kan de oogbol volledig worden geïmmobiliseerd, waardoor de dissectie gemakkelijk en met ...

Oculaire dissectie is een belangrijke techniek in oogheelkundig onderzoek en heeft onderzoekers in staat gesteld om toegang te krijgen tot de segmenten van het oog voor gerichte studies. Eerder vertrouwden oculaire onderzoekers op het oogweefsel van zieke personen voor hun studies. Het geleidelijk groeiende aantal stammen van oogheelkundige knaagdiermodellen1 in de loop der jaren heeft echter de behoefte aan menselijk oogweefsel verminderd. Deze muizenstammen hebben een dieper begrip van oogziekten en interventies mogelijk gemaakt. Toch hebben ze ook een behoefte aan innovatieve technieken van oculaire microdissectie gegenereerd. De kleine omvang en het beperkte werkgebied beperken de effectieve toegang tot de oculaire subdelen ernstig. Verder is het, vanwege de homogene cellulaire assemblage van de achterste en voorste oogschelpen, moeilijk om gerichte interventies na de dissectie uit te voeren. De huidige microdissectietechnieken van laser2 en chirurgische microdissectie 3,4 zijn ontoereikend om aan dergelijke eisen van oculair onderzoek te voldoen. Laser micro-dissectie is zeer effectief in single-cell analyse, maar het specifieke weefsel moet micro-ontleed worden vóór de laserprocedure2. De techniek kan kleine interessante gebieden isoleren van een vooraf ontleed weefsel voor moleculaire analyse. De techniek is dus niet geschikt voor het voorbereiden van wholemounts of voor het isoleren van axiaal verpakte oculaire lagen voor optimale visualisatie.
De chirurgische methode is de meest gebruikte techniek; Deze methode omvat het immobiliseren van het oog via de oogzenuw5 en vervolgens het uitvoeren van de dissectie. Deze oefening is zwaar en kan elk kwetsbaar weefsel beschadigen, omdat het bolvormige oog blijft bewegen tijdens de dissectie. Ondanks dat het gunstig is voor het isoleren van de verschillende delen van de retinale lagen, kan de techniek de ruimtelijke oriëntatie van het weefsel bij dissectie niet afbakenen.
Tijdens de dissectie biedt het handhaven van de aanwezigheid van het aangehechte nictitating membraan of het derde ooglid (figuur 1) unieke en significante voordelen. Bij deze methode wordt eerst de oogbol geënucleeerd met het derde ooglid. Vervolgens wordt het derde ooglid gebruikt om het oog6 te immobiliseren (figuur 2A). Dit wordt gevolgd door het doorboren van de oogbol door de corneale limbus en het gebruik van de incisie als het punt van binnenkomst (figuur 2B, C). Vervolgens worden de oogschelpen gescheiden door anterieur en posterieur langs de omtrek te snijden (figuur 2D-G). Door de achterste oogschelp verder te ontleden, kan de doorschijnende laag van het neurale netvlies worden geïdentificeerd en voorzichtig worden afgepeld. Drie of vier equidistante sneden worden vervolgens gemaakt in de verkregen halfronde voorste en achterste kopjes, waardoor deze bloemvormige kopjes plat op een glijbaan kunnen vallen (figuur 2H).
Het derde ooglid helpt bij een eenvoudige en efficiënte hantering tijdens de dissectie, waardoor minimale schade aan het weefsel wordt gegarandeerd tijdens de toegang tot de verschillende ooglagen en bij het produceren van hele mounts. Verder helpt de aanwezigheid van het derde ooglid om gelokaliseerde interventies tijdens visualisatie te lokaliseren en te onderzoeken.
De procedure, in ons laboratorium, is uitgevoerd op een CBA / J of een rd1-muizenstam op P28 van elk geslacht. De procedure kan worden uitgevoerd op elke stam, leeftijd of geslacht van het dier en heeft geen vooroordeel volgens deze kenmerken.
De dieren werden verkregen uit commerciële bronnen (zie tabel met materialen) en onderhouden in de Small Animal Facility (SAF) van het National Institute of Immunology (NII). Ze werden gehouden in individuele geventileerde kooien (IVC) en kregen ad libitum toegang tot verzuurd geautoclaveerd water en voedsel. Ze werden gehandhaafd bij 21-23 °C en met een licht/donkercyclus van 14 uur/10 uur.
Hieronder wordt een aangepaste chirurgische methode gegeven voor de microdissectie van een muizenoog.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetaminophen (Biocetamol)</td>
			<td>EG Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Kit (DEA)</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated analyser</td>
			<td>Tulip, Alto Santracruz, India</td>
			<td>Screen Maaster 3000</td>
			<td>Biochemical analyser for liver functional test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine (Povidon-Iodine Solution)</td>
			<td>Win-Medicare;&#160; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet ( Class I)</td>
			<td>Kartos international; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright Field Microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>LX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBA/J inbred mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No. 000654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime (Taxim)</td>
			<td>AlKem ; India</td>
			<td></td>
			<td>cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Buds</td>
			<td>Pure Swabs Pvt Ltd ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape Sheet</td>
			<td>JSD Surgicals, Delhi, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution, alcoholic</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>HT110132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>Ugo Basile; Italy</td>
			<td>211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Himedia, India</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair removing cream (Veet)</td>
			<td>Reckitt Benckiser , India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Mayer&#39;s</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>MHS16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>RM554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase From Sheep Testes</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>H6254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I.V. Cannula (Plusflon)</td>
			<td>Mediplus, India</td>
			<td>Ref 1732411420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD ; US</td>
			<td>REF 303060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane ( Forane)</td>
			<td>Asecia Queenborough</td>
			<td>No B506</td>
			<td>Inhalation Anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketamax)</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Melonex)</td>
			<td>Intas Pharmaceuticals Ltd; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; 
			curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Histo-Line Laboratories, Italy</td>
			<td>MRS3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Thread</td>
			<td>Mighty ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>GRM 3660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Tears/Eyemist Gel</td>
			<td>Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India</td>
			<td>P3060</td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGOT (ASAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGPT (ALAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryotome E Cryostat</td>
			<td>Thermo Electron Corporation ; US</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade No. 22</td>
			<td>La Medcare, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Board</td>
			<td>Locally made</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical White Tape</td>
			<td>3M India ; India</td>
			<td>1530-1</td>
			<td>Micropore Surgical Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon, Johnson &#38; Johnson, India</td>
			<td>NW 5047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1ml, 26 G)</td>
			<td>Dispo Van; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer (Clipper)</td>
			<td>Philips</td>
			<td>NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Machine</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#39;s E Media</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>AT125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Xylaxin)</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection of the rodent eye

De oculaire microdissectie van het knaagdieroog omvat de segmentatie van de enucleated oogbol met het aangehechte nictitating membraan, of derde ooglid, om de voorste en achterste oogschelpen te verkrijgen. Met deze techniek kunnen de subdelen van het oog, inclusief het hoornvliesweefsel, neuraal weefsel, retinale pigmentepitheel (RPE) weefsel en lens, worden verkregen voor wholemounts, cryo-sectie en / of eencellige suspensies van een specifiek oogweefsel. De aanwezigheid van het derde ooglid biedt unieke en significante voordelen, omdat het het behoud van de oriëntatie van het oog ten goede komt, wat belangrijk is voor het begrijpen van de oogfysiologie na een gelokaliseerde interventie of in studies met oculaire analyse met betrekking tot de ruimtelijke topografie van het oog.
Bij deze methode enucleeerden we de oogbol bij de oogkas samen met het derde ooglid door voorzichtig en langzaam door de extraoculaire spieren te snijden en de oogzenuw door te snijden. De oogbol werd met behulp van een microblade door de corneale limbus gestoken. De incisie werd gebruikt als het punt van binnenkomst, waardoor langs de cornea-sclerale overgang kon worden gesneden door microscharen door het incisiepunt in te brengen. Kleine en continue sneden langs de omtrek werden gemaakt totdat de kopjes gescheiden waren. Deze kunnen verder worden ontleed door de doorschijnende laag van het neurale netvlies voorzichtig af te pellen met behulp van een Colibri-hechttang om het neurale netvlies en de RPE-lagen te verkrijgen. Verder werden drie/vier equidistante sneden gemaakt van de periferie loodrecht op het optische centrum totdat de oogzenuw werd bereikt. Hierdoor werden de halfronde kopjes in een roosvorm geopend zodat ze plat vielen en gemakkelijk gemonteerd konden worden. Deze techniek is in ons lab gebruikt voor cornea wholemounts en retinale secties. De aanwezigheid van het derde ooglid bakent de nasale-temporele oriëntatie af, wat de studie van verschillende celtherapie-interventies na transplantatie mogelijk maakt en dus de gerichte fysiologische validatie die van vitaal belang is voor visualisatie en nauwkeurige weergave in dergelijke studies.

Een hele verzameling rd1 muis oog/hoornvliesweefsel werd voorbereid om potentiële lymfe-angiogenese in het voorste/hoornvliesweefsel in een zieke toestand te bestuderen. Het aangehechte conjunctivale weefsel van het derde ooglid fungeerde als een positieve controle, omdat het hoornvlies geen lymfevaten heeft. Voor het onderzoek werd het hoornvliesweefsel ontleed met het bindvlies en gefixeerd met 4% PFA, gevolgd door permeabilisatie en blokkering. Het weefsel werd vervolgens gekleurd met een primair antilichaam tegen de...

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection of the Rodent Eye at JoVE.com

Microdissection of the Rodent Eye

Dit artikel presenteert een protocol voor oculaire microdissectie bij knaagdieren. Het proces omvat de enucleatie van de oogbol samen met het nictitating membraan (d.w.z. het derde ooglid). Dit wordt dan gevolgd door de scheiding van de achterste en voorste oogschelpen.

Microdissectie van het knaagdieroog

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, ...

Oculair onderzoek in vroegere tijden was vooral gebaseerd op het oogweefsel van overleden personen. In de loop der jaren zijn er echter veel oogheelkundige knaagdiermodellen ontwikkeld en is de behoefte aan menselijk oogweefsel afgenomen. Vanwege de kleine omvang en het beperkte operatiegebied in het oog van het knaagdier, is de effectieve toegang tot de oculaire subonderdelen ernstig beperkt.Typisch, om het oog van een knaagdier te opereren, wordt het oog geïmmobiliseerd via de oogzenuw en wordt de dissectie uitgevoerd. Deze oefening is zwaar en kan het fragiele weefsel beschadigen omdat het bolvormige oog blijft bewegen tijdens de dissectie. Ondanks dat het nuttig is bij het isoleren van de verschillende secties van retinale lagen, kan deze techniek de ruimtelijke oriëntatie van het weefsel bij dissectie van het weefsel niet afbakenen.Verder is een gerichte interventie moeilijk te lokaliseren na dissectie vanwege de homogene cellulaire assemblage van de achterste en voorste oogcup. In deze video wordt een aangepaste chirurgische methode voor microdissectie gedemonstreerd. De aanwezigheid van het bijgevoegde nictitating membraan, of het derde ooglid, biedt unieke en significante voordelen.Bij deze methode wordt eerst de oogbol geënucleeerd met het derde ooglid, waarna het derde ooglid wordt gebruikt om het oog te immobiliseren. Het wordt gevolgd door het doorboren van de oogbol door de corneale limbus en de incisie wordt gebruikt als het punt van binnenkomst. Vervolgens worden door langs de omtrek te snijden, voorste en achterste oogschelpen gescheiden.Door de achterste oogschelp verder te ontleden, wordt de doorschijnende laag van het neurale netvlies geïdentificeerd en voorzichtig afgepeld. De neurale en RPE-lagen worden zo verkregen voor verdere verwerking. Het derde ooglid zal ons in staat stellen om de ruimtelijke oriëntatie van de oogpost-enucleatie af te bakenen.Laten we nu een gedetailleerde stapsgewijze procedure volgen. Verwijd de knaagdierogen met behulp van een druppel 0,8% tropicamide en 5% fenylefrine oftalmische oplossingen en plaats het dier gedurende 30 minuten vóór de procedure in een donker gebied. Euthanaseer het dier door intraperitoneaal vijf keer doses anesthesie toe te dienen.Een typische dosis is 200 microliter PBS met 10 mg ketamine en één mg xylazine. Bevestig het volledige gebrek aan respons op stimulus door de pedaalreflex te onderzoeken. Plaats de muis in laterale lighouding om volledige toegang tot het oog mogelijk te maken.Houd een Colibri-hechttang, een gebogen tang, een micromesje van 15 graden en drie millimeter groot, een veermicroschaar en een schuine veermicroschaar klaar voor de procedure. Plaats een gebogen tang rond de oogbol en knijp om het oog te bevrijden van externe aanhechtingen. Het derde ooglid, ook bekend als het nictitating membraan, bevindt zich in de bovenhoek van de nasale tangens en kan worden geïdentificeerd als een kleine doorschijnende uitstulping met gepigmenteerde grenzen.Gebruik vervolgens een veermicroschaar en knip rond de oogbol. Kleine, doorlopende sneden bevrijden de oogbol van sclerale hulpstukken. Plaats een gebogen veermicroschaar onder de oogbol om het oog te bevrijden door de oogzenuw door te snijden.Plaats het enucleated oog in een petrischaaltje met PBS-buffer, zodat de oogbol wordt ondergedompeld in PBS. Sommige extraoculaire spieren of weefsels beginnen weg te drijven van de oogbol. Verwijder ze door ze met een veermicroschaar van de oogbol af te knippen.Verwijder vervolgens de oogzenuw van de basis van de oogbol om een betere scheiding van het netvlies mogelijk te maken voor hele voorbereidingen. Het is niet nodig om de oogzenuw te verwijderen voor weefselsecties. Breng de oogbol over in een tube van 1,5 ml met één ml 4% paraformaldehyde of PFA.Bewaar het twee uur bij vier graden Celsius voor weefselfixatie. Het is mogelijk om bij deze stap te pauzeren door het weefsel maximaal 12 uur in PFA te laten bij vier graden Celsius. Voor de isolatie van levende cellen mogen de fixatiestappen echter niet worden uitgevoerd en moet de hele procedure in continuüm worden uitgevoerd.Breng na PFA-fixatie de oogbol over in een petrischaaltje met PBS en plaats het onder een ontleedmicroscoop om de volgende procedure uit te voeren. Immobiliseer de oogbol door het derde ooglid stevig vast te houden met een Colibri-hechttang. De limbus is de corneale sclerale overgang.Maak een kleine incisie bij de limbus door deze te doorboren met een microblade. De incisie wordt bij voorkeur tegenover het derde ooglid gemaakt. Vervolgens, met deze incisie als uitgangspunt, maak je met de microschaar kleine en continue sneden langs deze corneale sclerale limbusomtrek.Voltooi eerst een halve cirkel van sneden vanaf het incisiepunt tot het derde ooglid. Voltooi vervolgens de resterende halve cirkel van sneden aan de andere kant. Maak ten slotte een snee rond het derde ooglid om de achterste en de voorste cup te scheiden.Verwijder de lens van de achterste cup met behulp van een tang om de achterste cup te verkrijgen die bestaat uit het neurale netvlies en de RPE-laag en de corneale voorste cup. Bij het werken met niet-gefixeerde weefsels kunnen de voorste en achterste cups nu enzymatisch worden verteerd om corneale of retinale eencellige suspensie te verkrijgen. Voor het fixeren van de weefsels, breng deze cups over in een buis van 1,5 ml met 1 ml 4% PFA gedurende 12 uur bij vier graden Celsius.Na fixatie kan het weefsel worden ingebed in het juiste medium en kan cryosectionering of paraffinesectie worden uitgevoerd om cornea- of retinale secties te verkrijgen. Breng de achterste beker opnieuw in de petrischaal met PBS-buffer. Een ondoorzichtige laag op de gepigmenteerde RPE-laag is het neurale netvlies.Verwijder het neurale netvlies met een tweede tang. Een zeer zachte en lichte beweging van de hand wordt ten zeerste aanbevolen om het weefsel niet te beschadigen. Bij de oogzenuw, uitgang, kan de gebogen veerschaar onder het neurale netvlies worden ingebracht en kan een snede worden gemaakt om de lagen volledig vrij te maken als het neurale netvlies vast blijft zitten.Het netvlies kan ook worden bevrijd of losgemaakt door het zachtjes te aaien met een zachte borstel. Breng de voorste en achterste kopjes opnieuw in de petrischaal met PBS-buffer. Gebruik een schuine veermicroschaar om een snede te maken naast het derde ooglid van de periferie loodrecht op het optische centrum.Houd het derde ooglid vast en maak een snee naast de eerste snede. Maak een vergelijkbare snee tussen de tweede snee en het derde ooglid. Drie of vier van dergelijke gelijke sneden openen de halfronde kopjes in een bloemvorm, die plat valt en gemakkelijk kan worden gemonteerd.Maak geen zeer diepe sneden tot het midden van de beker, omdat dit ervoor kan zorgen dat de bladsecties uit elkaar vallen of gemakkelijk scheiden. Het vloeibare medium zorgt ervoor dat de voorste oogschelp een gebogen structuur krijgt. Volg dezelfde stappen als gegeven voor het maken van sneden op de achterste beker om drie of vier gelijke sneden op de voorste beker te maken.De weefsels zijn nu klaar voor verdere kleuring. In deze figuur wordt de hele voorste beker getoond. Het hoornvliesweefsel werd zoals beschreven gemicrodissecteerd om de lymfevaten in het aangehechte conjunctivale weefsel van de hoornvliesblaadje te onthullen.In deze figuur wordt het geheel van het neurale netvlies getoond. De retinale vasculatuur van het neurale netvlies was gekleurd met isolectine en is zichtbaar als groene bloedvaten. Bij deze methode wordt de enucleated oogbol van de muizen verkregen met het bijgevoegde derde ooglid voor effectieve en eenvoudige hantering.Het derde ooglid immobiliseert de oogbol volledig en laat de dissectie met gemak en minimale fouten verlopen. Deze methode is voordelig voor oculaire weefselspecifieke secties, eencellige analyse en wholemounts. De noodzaak van repetitieve weefselfixatie maakt het weefsel echter niet levensvatbaar voor celkweek of dergelijke levende celbehoeften.Daarom moet de procedure in continuüm worden uitgevoerd voor levende celisolatie.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Medicine

Unit 1

The Special Senses

SCIENTISTS IN ACTION

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

Een muis model van het hoornvlies Pocket Assay voor Angiogenese Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Verbeterd protocol voor Laser Microdissection der humane pancreatische eilandjes Van Chirurgische Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

Laser-capture microdissectie van Human Prostatic Epithelium voor RNA-analyse

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Kwantitatieve fundus autofluorescentie voor de beoordeling van Netvliesaandoeningen

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy (rNAION)

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy rNAION

Het knaagdier Model van nonarteritic anterior ischemische optische neuropathie (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Fluorescent Dye Etikettering van Erythrocyten en Leukocyten voor het bestuderen van de Flow Dynamics in de retinale circulatie van de muis

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

Punctie-geïnduceerde Iris Neovascularization als een muismodel van Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Ruimtelijke kwantificering van Drugs in longtuberculose laesies door Laser vangen Microdissection vloeistof chromatografie massaspectrometrie (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Karakterisering van een nieuwe menselijke organotypische retinale cultuurtechniek

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy

Toepassing van optische coherentietomografie op een muismodel van retinopathie

Optical coherence tomography (OCT) offers a noninvasive method for the diagnosis of retinopathy. The OCT machine can capture retinal crosssectional images ...