Name: microdissection of the rodent eye
Uploaded: 2023-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection of the Rodent Eye at JoVE.com

Le Dr Alaknanda Mishra, du Département de biologie cellulaire et d’anatomie humaine de l’Université de Californie à Davis, aux États-Unis, nous a formés à cette méthode à l’Institut national d’immunologie de New Delhi. Ce travail a été soutenu par la subvention de base reçue du Département de biotechnologie du gouvernement indien à l’Institut national d’immunologie de New Delhi. P.S. a reçu une bourse de recherche du Département de biotechnologie.

Cette procédure a été approuvée par le Comité institutionnel d’éthique animale de l’Institut national d’immunologie de New Delhi. Le numéro de référence de série de l’homologation est IAEC#480/18. Les expériences ont été réalisées conformément aux directives réglementaires du Comité pour le contrôle et la supervision des expériences sur les animaux, Ministère de la pêche, de l’élevage et de la production laitière, Gouvernement indien, sous la supervision d’un vétérinaire professionne...

<ol>
	<li>Choi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cancer+immunotherapy+using+patient-derived+xenografts+(PDXs)+in+humanized+mice.">Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice.</a> Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li><li>Sutherland, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+of+Highly+Pure+Trabecular+Meshwork+from+Mouse+Eyes+for+Gene+Expression+Analysis.">Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis.</a> J Vis Exp. (136), e57576 (2018).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Claybon, A., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+mouse+eye+for+a+whole+mount+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2563 (2011).</li><li>Steven, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+induction+and+three-dimensional+two-photon+imaging+of+conjunctiva-associated+lymphoid+tissue.">Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).</li><li>Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+wholemount+technique:+A+window+to+understanding+the+brain+and+behaviour.">The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour.</a> Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).</li><li>Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatics+and+lymphangiogenesis+in+the+eye.">Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye.</a> Journal of Ophthalmology. 2012, 783163 (2012).</li><li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood-derived+monocytes+show+neuronal+properties+and+integration+in+immune-deficient+rd1+mouse+model+upon+phenotypic+differentiation+and+induction+with+retinal+growth+factors.">Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412 (2020).</li></ol>

La microdissection oculaire s’est avérée être une tâche difficile en raison de la petite taille et de la forme sphérique de l’œil de rongeur, et l’œil de rongeur nécessite des techniques innovantes pour une manipulation efficace8. 
Dans la méthode actuellement démontrée, le globe oculaire de souris énucléé est obtenu avec la troisième paupière attachée pour une manipulation efficace et facile. En utilisant la troisième paupière, le globe oculair...

La dissection oculaire est une technique importante dans la recherche ophtalmique et a permis aux chercheurs d’accéder aux segments de l’œil pour des études ciblées. Auparavant, les chercheurs oculaires s’appuyaient sur le tissu oculaire d’individus malades pour leurs études. Cependant, le nombre croissant de souches de modèles ophtalmiques de rongeurs1 au fil des ans a diminué le besoin de tissu oculaire humain. Ces souches de souris ont permis une meilleure compréhension des maladies oculaires et des interventions. Pourtant, ils ont également généré un besoin de techniques innovantes de micro-dissection oculaire. La petite taille et la zone d’exploitation limitée limitent considérablement l’accès effectif aux sous-parties oculaires. De plus, en raison de l’assemblage cellulaire homogène des oculaires postérieur et antérieur, il est difficile de mener des interventions ciblées après la dissection. Les techniques actuelles de microdissection du laser2 et de la microdissection chirurgicale 3,4 sont insuffisantes pour répondre à ces exigences de la recherche oculaire. La micro-dissection au laser est très efficace dans l’analyse unicellulaire, mais le tissu spécifique doit être micro-disséqué avant la procédure au laser2. La technique permet d’isoler de petites régions d’intérêt à partir d’un tissu pré-disséqué pour une analyse moléculaire. Ainsi, la technique n’est pas adaptée à la préparation de montages entiers ou à l’isolement de couches oculaires emballées axialement pour une visualisation optimale.
La méthode chirurgicale est la technique la plus utilisée; Cette méthode consiste à immobiliser l’œil via le nerf optique5 puis à effectuer la dissection. Cette pratique est ardue et peut endommager tout tissu fragile, car l’œil sphérique continue de bouger pendant la dissection. Bien qu’elle soit bénéfique pour isoler les différentes sections des couches rétiniennes, la technique ne peut pas délimiter l’orientation spatiale du tissu lors de la dissection.
Lors de la dissection, le maintien de la présence de la membrane nictitante attachée ou de la troisième paupière (Figure 1) présente des avantages uniques et significatifs. Dans cette méthode, d’abord, le globe oculaire est énucléé avec la troisième paupière. Ensuite, la troisième paupière sert à immobiliser l’œil6 (Figure 2A). Ceci est suivi en perçant le globe oculaire à travers le limbe cornéen et en utilisant l’incision comme point d’entrée (Figure 2B, C). Ensuite, les œillets sont séparés en coupant le long de la circonférence antérieurement et postérieurement (Figure 2D-G). En disséquant davantage l’œilleton postérieur, la couche translucide de la rétine neurale peut être identifiée et délicatement décollée. Trois ou quatre coupes équidistantes sont ensuite réalisées dans les coupes hémisphériques antérieures et postérieures obtenues, ce qui permet à ces coupes en forme de fleurs de tomber à plat sur une lame (Figure 2H).
La troisième paupière facilite la manipulation facile et efficace pendant la dissection, assurant ainsi des dommages minimes au tissu lors de l’accès aux différentes couches oculaires et lors de la production de montures entières. De plus, la présence de la troisième paupière aide à localiser et à examiner les interventions localisées pendant la visualisation.
La procédure, dans notre laboratoire, a été effectuée sur une souche de souris CBA / J ou rd1 à P28 de n’importe quel sexe. La procédure peut être effectuée sur n’importe quelle souche, âge ou sexe de l’animal et n’a aucun biais en fonction de ces caractéristiques.
Les animaux ont été achetés auprès de sources commerciales (voir le tableau des matériaux) et conservés à l’installation pour petits animaux (SAF) de l’Institut national d’immunologie (NII). Ils ont été gardés dans des cages ventilées individuelles (IVC) et ont reçu un accès ad libitum à de l’eau autoclavée acidifiée et à de la nourriture. Ils ont été maintenus à 21-23 °C et avec un cycle lumière/obscurité de 14 h/10 h.
Vous trouverez ci-dessous une méthode chirurgicale modifiée pour la micro-dissection d’un œil de souris.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetaminophen (Biocetamol)</td>
			<td>EG Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Kit (DEA)</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated analyser</td>
			<td>Tulip, Alto Santracruz, India</td>
			<td>Screen Maaster 3000</td>
			<td>Biochemical analyser for liver functional test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine (Povidon-Iodine Solution)</td>
			<td>Win-Medicare;&#160; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet ( Class I)</td>
			<td>Kartos international; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright Field Microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>LX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBA/J inbred mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No. 000654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime (Taxim)</td>
			<td>AlKem ; India</td>
			<td></td>
			<td>cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Buds</td>
			<td>Pure Swabs Pvt Ltd ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape Sheet</td>
			<td>JSD Surgicals, Delhi, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution, alcoholic</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>HT110132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>Ugo Basile; Italy</td>
			<td>211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Himedia, India</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair removing cream (Veet)</td>
			<td>Reckitt Benckiser , India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Mayer&#39;s</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>MHS16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>RM554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase From Sheep Testes</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>H6254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I.V. Cannula (Plusflon)</td>
			<td>Mediplus, India</td>
			<td>Ref 1732411420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD ; US</td>
			<td>REF 303060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane ( Forane)</td>
			<td>Asecia Queenborough</td>
			<td>No B506</td>
			<td>Inhalation Anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketamax)</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Melonex)</td>
			<td>Intas Pharmaceuticals Ltd; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; 
			curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Histo-Line Laboratories, Italy</td>
			<td>MRS3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Thread</td>
			<td>Mighty ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>GRM 3660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Tears/Eyemist Gel</td>
			<td>Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India</td>
			<td>P3060</td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGOT (ASAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGPT (ALAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryotome E Cryostat</td>
			<td>Thermo Electron Corporation ; US</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade No. 22</td>
			<td>La Medcare, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Board</td>
			<td>Locally made</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical White Tape</td>
			<td>3M India ; India</td>
			<td>1530-1</td>
			<td>Micropore Surgical Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon, Johnson &#38; Johnson, India</td>
			<td>NW 5047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1ml, 26 G)</td>
			<td>Dispo Van; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer (Clipper)</td>
			<td>Philips</td>
			<td>NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Machine</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#39;s E Media</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>AT125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Xylaxin)</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection of the rodent eye

La micro-dissection oculaire de l’œil de rongeur implique la segmentation du globe oculaire énucléé avec la membrane nictitante attachée, ou troisième paupière, pour obtenir les oculaires antérieur et postérieur. Avec cette technique, les sous-parties de l’œil, y compris le tissu cornéen, le tissu neural, le tissu épithélial pigmentaire rétinien (EPR) et le cristallin, peuvent être obtenues pour des montages entiers, une cryosection et / ou des suspensions unicellulaires d’un tissu oculaire spécifique. La présence de la troisième paupière présente des avantages uniques et significatifs, car elle favorise le maintien de l’orientation de l’œil, ce qui est important pour comprendre la physiologie oculaire à la suite de toute intervention localisée ou dans les études impliquant une analyse oculaire relative à la topographie spatiale de l’œil.
Dans cette méthode, nous avons énucléé le globe oculaire à l’orbite avec la troisième paupière en coupant soigneusement et lentement les muscles extraoculaires et en sectionnant le nerf optique. Le globe oculaire a été percé à travers le limbe cornéen à l’aide d’une microlame. L’incision a été utilisée comme point d’entrée, permettant de couper le long de la jonction cornéenne-sclérale en insérant des micro-ciseaux à travers le point d’incision. De petites coupes continues le long de la circonférence ont été faites jusqu’à ce que les tasses se séparent. Ceux-ci pourraient être disséqués davantage en décollant doucement la couche translucide de la rétine neurale à l’aide de pinces de suture Colibri pour obtenir la rétine neurale et les couches RPE. De plus, trois/quatre coupes équidistantes ont été faites de la périphérie perpendiculairement au centre optique jusqu’à ce que le nerf optique soit atteint. Cela a ouvert les coupes hémisphériques en forme de fleuron afin qu’elles tombent à plat et puissent être facilement montées. Cette technique a été utilisée dans notre laboratoire pour les montages cornéens entiers et les coupes rétiniennes. La présence de la troisième paupière délimite l’orientation nasale-temporale, ce qui permet l’étude de diverses interventions de thérapie cellulaire post-transplantation et, par conséquent, la validation physiologique ciblée vitale pour la visualisation et la représentation précise dans de telles études.

Une monture entière d’œil/tissu cornéen de souris rd1 a été préparée pour étudier la lympho-angiogenèse potentielle dans le tissu antérieur/cornéen à l’état malade. Le tissu conjonctival attaché de la troisième paupière a agi comme un contrôle positif, car la cornée manque de vaisseaux lymphatiques. Pour l’étude, le tissu cornéen a été disséqué avec la conjonctive et a été fixé avec 4% PFA, suivi d’une perméabilisation et d’un blocage. Le tissu a ensuite été coloré avec un anticor...

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection of the Rodent Eye at JoVE.com

Microdissection of the Rodent Eye

Cet article présente un protocole pour la microdissection oculaire chez les rongeurs. Le processus implique l’énucléation du globe oculaire avec la membrane nictitante (c’est-à-dire la troisième paupière). Ceci est ensuite suivi par la séparation des cupules postérieures et antérieures.

Microdissection de l’œil de rongeur

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, ...

La recherche oculaire dans les premiers temps reposait principalement sur le tissu oculaire d’individus décédés. Cependant, au fil des ans, de nombreux modèles ophtalmiques de rongeurs ont été développés et le besoin de tissu oculaire humain a diminué. En raison de la petite taille et de la zone d’opérations limitée dans l’œil du rongeur, l’accès effectif aux sous-parties oculaires est sévèrement limité.Typiquement, pour opérer sur l’œil d’un rongeur, l’œil est immobilisé via le nerf optique et la dissection est effectuée. Cette pratique est ardue et peut endommager le tissu fragile car l’œil sphérique continue de bouger pendant la dissection. Bien qu’elle soit bénéfique pour isoler les différentes sections des couches rétiniennes, cette technique ne peut pas délimiter l’orientation spatiale du tissu lors de la dissection du tissu.De plus, une intervention ciblée est difficile à localiser après la dissection en raison de l’assemblage cellulaire homogène de la cupule postérieure et antérieure. Dans cette vidéo, une méthode chirurgicale modifiée pour la microdissection est démontrée. La présence de la membrane nictitante attachée, ou troisième paupière, présente des avantages uniques et significatifs.Dans cette méthode, le globe oculaire est d’abord énucléé avec la troisième paupière, puis la troisième paupière est utilisée pour immobiliser l’œil. Il est suivi par le perçage du globe oculaire à travers le limbe cornéen, et l’incision est utilisée comme point d’entrée. Ensuite, en coupant le long de la circonférence, les œillets antérieurs et postérieurs sont séparés.En disséquant davantage la coupelle postérieure de l’œillet, la couche translucide de la rétine neurale est identifiée et délicatement décollée. Les couches neuronales et RPE sont ainsi obtenues pour un traitement ultérieur. La troisième paupière nous permettra de délimiter l’orientation spatiale de l’œil après l’énucléation.Suivons maintenant la procédure détaillée étape par étape. Dilatez les yeux des rongeurs à l’aide d’une goutte de solutions ophtalmiques à 0,8% de tropicamide et à 5% de phényléphrine et placez l’animal dans une zone sombre pendant 30 minutes avant l’intervention. Euthanasier l’animal en lui administrant par voie intrapéritonéale cinq doses d’anesthésie.Une dose typique est de 200 microlitres de PBS contenant 10 mg de kétamine et un mg de xylazine. Confirmez l’absence totale de réponse au stimulus en examinant le réflexe de pédale. Placez la souris en position couchée latérale pour permettre un accès complet à l’œil.Gardez une pince de suture Colibri, une pince incurvée, une micro-lame de 15 degrés de taille de trois millimètres, des micro-ciseaux à ressort et un micro-ciseau à ressort incliné prêts pour la procédure. Placez une pince incurvée autour du globe oculaire et pincez pour libérer l’œil des attaches étrangères. La troisième paupière, également connue sous le nom de membrane nictitante, est située vers le coin supérieur de la tangente nasale et peut être identifiée comme une protubérance translucide mineure avec des limites pigmentées.Ensuite, utilisez un micro-ciseau à ressort et coupez autour du globe oculaire. De petites coupures continues libèrent le globe oculaire des attaches sclérales. Placez un micro-ciseau à ressort incurvé sous le globe oculaire pour libérer l’œil en coupant le nerf optique.Placez l’œil énucléé dans une boîte de Petri contenant un tampon PBS de sorte que le globe oculaire soit immergé dans le PBS. Certains muscles ou tissus extraoculaires commenceront à flotter loin du globe oculaire. Retirez-les en les coupant du globe oculaire à l’aide de micro-ciseaux à ressort.Ensuite, retirez le nerf optique de la base du globe oculaire pour permettre une meilleure séparation de la rétine pour les préparations complètes. Il n’est pas nécessaire de retirer le nerf optique pour la section des tissus. Transférer le globe oculaire dans un tube de 1,5 ml contenant un ml de paraformaldéhyde ou PFA à 4%.Conservez-le pendant deux heures à quatre degrés Celsius pour la fixation des tissus. Il est possible de faire une pause à cette étape en laissant le tissu dans le PFA jusqu’à 12 heures à quatre degrés Celsius. Cependant, pour l’isolement des cellules vivantes, les étapes de fixation ne doivent pas être effectuées et l’ensemble de la procédure doit être effectué en continuum.Après la fixation du PFA, transférez le globe oculaire dans une boîte de Petri contenant du PBS et placez-le sous un microscope à dissection pour effectuer la procédure suivante. Immobiliser le globe oculaire en maintenant fermement la troisième paupière enfoncée avec la pince à suture Colibri. Le limbe est la jonction sclérale cornéenne.Faites une petite incision au limbe en le perçant à l’aide d’une microlame. L’incision est faite de préférence en face de la troisième paupière. Ensuite, en utilisant cette incision comme point de départ, avec le micro-ciseau faire de petites coupures continues le long de cette circonférence du limbe scléral cornéen.Tout d’abord, complétez un demi-cercle de coupures à partir du point d’incision jusqu’à la troisième paupière. Ensuite, complétez le demi-cercle de coupes restant de l’autre côté. Enfin, faites une coupe autour de la troisième paupière pour séparer la coupe postérieure et la coupe antérieure.Retirez la lentille de la cupule postérieure à l’aide d’une pince pour obtenir la cupule postérieure comprenant la rétine neurale et la couche RPE et la cupule antérieure cornéenne. Si vous travaillez avec des tissus non fixés, les cupules antérieure et postérieure peuvent maintenant être digérées enzymatiquement pour obtenir une suspension unicellulaire cornéenne ou rétinienne. Pour fixer les tissus, transférer ces tasses dans un tube de 1,5 ml contenant 1 ml de PFA à 4% pendant 12 heures à quatre degrés Celsius.Après la fixation, le tissu peut être incorporé dans un milieu approprié et une cryosection ou une section de paraffine peut être effectuée pour obtenir des coupes cornéennes ou rétiniennes. Réintroduisez la coupe postérieure dans la boîte de Petri contenant le tampon PBS. Une couche opaque sur la couche pigmentée d’EPR est la rétine neurale.Décollez la rétine neurale à l’aide d’une deuxième pince. Un mouvement très doux et léger de la main est fortement recommandé pour ne pas endommager le tissu. Au niveau du nerf optique, à la sortie, les ciseaux à ressort incurvés peuvent être insérés sous la rétine neurale, et une coupe peut être faite pour libérer complètement les couches si la rétine neurale reste attachée.La rétine peut également être libérée ou détachée en la caressant doucement avec une brosse douce. Réintroduisez les coupes antérieure et postérieure dans la boîte de Petri contenant le tampon PBS. Utilisez un micro-ciseau à ressort incliné pour faire une coupe à côté de la troisième paupière de la périphérie perpendiculairement vers le centre optique.Maintenez une prise de la troisième paupière et faites une coupe à côté de la première coupe. Faites une coupe similaire entre la deuxième coupe et la troisième paupière. Trois ou quatre coupes équidistantes ouvrent les coupes hémisphériques en une forme de fleur, qui tombe à plat et peut être facilement montée.Ne faites pas de coupes très profondes jusqu’au centre de la tasse, car cela pourrait faire en sorte que les sections de feuilles se désagrègent ou se séparent facilement. Le milieu liquide permet à la coupelle antérieure de l’œil d’atteindre une structure incurvée. Suivez les mêmes étapes que celles données pour faire des coupes sur la coupe postérieure pour faire trois ou quatre coupes équidistantes sur la coupe antérieure.Les tissus sont maintenant prêts pour une coloration supplémentaire. Dans cette figure, l’ensemble de la coupe antérieure est montré. Le tissu cornéen a été microdisséqué comme décrit pour révéler les vaisseaux lymphatiques dans le tissu conjonctival attaché du feuillet cornéen.Dans cette figure, l’ensemble de la rétine neurale est montré. Le système vasculaire rétinien de la rétine neurale a été coloré à l’isolectine et est visible sous forme de vaisseaux verts. Dans cette méthode, le globe oculaire énucléé des souris est obtenu avec la troisième paupière attachée pour une manipulation efficace et facile.La troisième paupière immobilise complètement le globe oculaire et permet à la dissection de se dérouler avec facilité et un minimum d’erreurs. Cette méthode est avantageuse pour la section spécifique du tissu oculaire, l’analyse unicellulaire et les montages entiers. Cependant, la nécessité d’une fixation tissulaire répétitive rend le tissu non viable pour la culture cellulaire ou de telles nécessités de cellules vivantes.Par conséquent, la procédure doit être effectuée dans un continuum pour l’isolement des cellules vivantes.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Medicine

Unit 1

The Special Senses

SCIENTISTS IN ACTION

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

Un modèle murin de l&#39;Assay Pocket cornée pour l&#39;étude de l&#39;angiogenèse

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Recherche

Médecine

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Protocole amélioré pour la microdissection laser d&#39;îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

Laser-microdissection de la prostate humaine épithélium pour l&#39;analyse de l&#39;ARN

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Quantitative Fundus autofluorescence pour l&#39;évaluation des maladies rétiniennes

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy (rNAION)

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy rNAION

Le modèle Rongeur de non-artéritique neuropathie optique ischémique antérieure (de rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Étiquetage des colorants fluorescents des érythrocytes et des leucocytes pour étudier la dynamique du flux dans la circulation de la rétine de la souris

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

Induite par la ponction de néovascularisation Iris comme un modèle de souris de Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Quantification spatiale des drogues dans les lésions de la tuberculose pulmonaire par Laser capturer Microdissection liquide chromatographie en spectrométrie de masse (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Caractérisation d’une nouvelle technique de culture rétinienne organotypique humaine

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy

Application de la tomographie par cohérence optique à un modèle murin de rétinopathie

Optical coherence tomography (OCT) offers a noninvasive method for the diagnosis of retinopathy. The OCT machine can capture retinal crosssectional images ...