Name: microdissection of the rodent eye
Uploaded: 2023-04-21T12:30:00
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Dr. Alaknanda Mishra, Department of Cell Biology and Human Anatomy, University of California Davis, USA, hat uns am National Institute of Immunology, New Delhi, in dieser Methode geschult. Diese Arbeit wurde durch den Hauptzuschuss unterstützt, den das Department of Biotechnology der indischen Regierung an das National Institute of Immunology, Neu-Delhi, erhalten hat. P.S. erhielt ein Forschungsstipendium des Instituts für Biotechnologie.

Dieses Verfahren wurde von der institutionellen Tierethikkommission des Nationalen Instituts für Immunologie in Neu-Delhi genehmigt. Die laufende Referenznummer der Genehmigung lautet IAEC#480/18. Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Regulierungsrichtlinien des Ausschusses für die Kontrolle und Überwachung von Tierversuchen des Ministeriums für Fischerei, Tierhaltung und Milchwirtschaft der indischen Regierung unter der Aufsicht eines professionellen Tierarztes der SAF, NII, durchgeführt.
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	<li>Choi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cancer+immunotherapy+using+patient-derived+xenografts+(PDXs)+in+humanized+mice.">Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice.</a> Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li><li>Sutherland, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+of+Highly+Pure+Trabecular+Meshwork+from+Mouse+Eyes+for+Gene+Expression+Analysis.">Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis.</a> J Vis Exp. (136), e57576 (2018).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Claybon, A., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+mouse+eye+for+a+whole+mount+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2563 (2011).</li><li>Steven, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+induction+and+three-dimensional+two-photon+imaging+of+conjunctiva-associated+lymphoid+tissue.">Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).</li><li>Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+wholemount+technique:+A+window+to+understanding+the+brain+and+behaviour.">The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour.</a> Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).</li><li>Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatics+and+lymphangiogenesis+in+the+eye.">Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye.</a> Journal of Ophthalmology. 2012, 783163 (2012).</li><li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood-derived+monocytes+show+neuronal+properties+and+integration+in+immune-deficient+rd1+mouse+model+upon+phenotypic+differentiation+and+induction+with+retinal+growth+factors.">Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412 (2020).</li></ol>

Die okuläre Mikrodissektion hat sich aufgrund der geringen Größe und Kugelform des Nagetierauges als schwierige Aufgabe erwiesen, und das Nagetierauge erfordert innovative Techniken für eine effiziente Handhabung8. 
Bei der derzeit demonstrierten Methode wird der enukleierte Mausaugapfel mit dem dritten Augenlid erhalten, um eine effektive und einfache Handhabung zu gewährleisten. Mit dem dritten Augenlid kann der Augapfel vollständig immobilisiert werden, wodurch...

Die Augendissektion ist eine wichtige Technik in der ophthalmologischen Forschung und hat es den Forschern ermöglicht, für gezielte Studien auf die Augensegmente zuzugreifen. Früher verließen sich Augenforscher für ihre Studien auf das Augengewebe von erkrankten Personen. Die im Laufe der Jahre immer größer werdende Anzahl von Stämmen von ophthalmologischen Nagetiermodellen1 hat jedoch den Bedarf an menschlichem Augengewebe verringert. Diese Mausstämme haben ein tieferes Verständnis von Augenerkrankungen und Interventionen ermöglicht. Sie haben jedoch auch einen Bedarf an innovativen Techniken der okulären Mikrodissektion geweckt. Die geringe Größe und der begrenzte Arbeitsbereich schränken den effektiven Zugang zu den Augenunterteilen stark ein. Darüber hinaus ist es aufgrund der homogenen zellulären Anordnung der hinteren und vorderen Augenmuscheln schwierig, gezielte Eingriffe nach der Dissektion durchzuführen. Die derzeitigen Mikrodissektionstechniken des Lasers2 und der chirurgischen Mikrodissektion 3,4 reichen nicht aus, um diese Anforderungen der Augenforschung zu erfüllen. Die Laser-Mikrodissektion ist bei der Einzelzellanalyse sehr effektiv, aber das spezifische Gewebe muss vor dem Laserverfahren mikropräpariert werden2. Die Technik kann kleine Regionen von Interesse aus einem vorpräparierten Gewebe für die molekulare Analyse isolieren. Daher eignet sich die Technik nicht zur Herstellung von Ganzkörpern oder zur Isolierung von axial gepackten Augenschichten für eine optimale Visualisierung.
Die chirurgische Methode ist die am weitesten verbreitete Technik; Bei dieser Methode wird das Auge über den Sehnerv5 ruhiggestellt und anschließend die Dissektion durchgeführt. Diese Praxis ist mühsam und kann jedes zerbrechliche Gewebe beschädigen, da sich das sphärische Auge während der Dissektion weiter bewegt. Obwohl die Technik für die Isolierung der verschiedenen Abschnitte der Netzhautschichten vorteilhaft ist, kann sie die räumliche Orientierung des Gewebes bei der Dissektion nicht abgrenzen.
Während der Dissektion bietet die Aufrechterhaltung des Vorhandenseins der angebrachten Nickhaut oder des dritten Augenlids (Abbildung 1) einzigartige und signifikante Vorteile. Bei dieser Methode wird zunächst der Augapfel mit dem dritten Augenlid enukleiert. Dann wird das dritte Augenlid verwendet, um das Auge6 zu immobilisieren (Abbildung 2A). Es folgt das Durchstechen des Augapfels durch den Hornhautlimbus und die Verwendung des Einschnitts als Eintrittspunkt (Abbildung 2B, C). Dann werden die Augenmuscheln getrennt, indem entlang des Umfangs nach vorne und hinten geschnitten wird (Abbildung 2D-G). Durch eine weitere Präparation der hinteren Augenmuschel kann die durchscheinende Schicht der neuralen Netzhaut identifiziert und vorsichtig abgezogen werden. In den erhaltenen halbkugelförmigen vorderen und hinteren Schalen werden dann drei oder vier äquidistante Schnitte gemacht, die es diesen blütenförmigen Bechern ermöglichen, flach auf einen Objektträger zu fallen (Abbildung 2H).
Das dritte Augenlid ermöglicht eine einfache und effiziente Handhabung während der Dissektion und sorgt so für eine minimale Schädigung des Gewebes beim Zugang zu den verschiedenen Augenschichten und bei der Herstellung ganzer Halterungen. Darüber hinaus hilft das Vorhandensein des dritten Augenlids, lokalisierte Eingriffe während der Visualisierung zu lokalisieren und zu untersuchen.
Das Verfahren wurde in unserem Labor an einem CBA/J- oder einem rd1-Mausstamm bei P28 jeglichen Geschlechts durchgeführt. Das Verfahren kann an jedem Stamm, Alter oder Geschlecht des Tieres durchgeführt werden und hat keine Verzerrung gemäß diesen Merkmalen.
Die Tiere wurden aus kommerziellen Quellen beschafft (siehe Materialtabelle) und in der Small Animal Facility (SAF) des National Institute of Immunology (NII) gehalten. Sie wurden in einzeln belüfteten Käfigen (IVC) gehalten und erhielten ad libitum Zugang zu angesäuertem autoklaviertem Wasser und Nahrung. Sie wurden bei 21-23 °C und mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 14 h/10 h gehalten.
Im Folgenden ist eine modifizierte chirurgische Methode für die Mikrodissektion eines Mausauges angegeben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetaminophen (Biocetamol)</td>
			<td>EG Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Kit (DEA)</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated analyser</td>
			<td>Tulip, Alto Santracruz, India</td>
			<td>Screen Maaster 3000</td>
			<td>Biochemical analyser for liver functional test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine (Povidon-Iodine Solution)</td>
			<td>Win-Medicare;&#160; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet ( Class I)</td>
			<td>Kartos international; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright Field Microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>LX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBA/J inbred mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No. 000654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime (Taxim)</td>
			<td>AlKem ; India</td>
			<td></td>
			<td>cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Buds</td>
			<td>Pure Swabs Pvt Ltd ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape Sheet</td>
			<td>JSD Surgicals, Delhi, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution, alcoholic</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>HT110132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>Ugo Basile; Italy</td>
			<td>211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Himedia, India</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair removing cream (Veet)</td>
			<td>Reckitt Benckiser , India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Mayer&#39;s</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>MHS16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>RM554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase From Sheep Testes</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>H6254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I.V. Cannula (Plusflon)</td>
			<td>Mediplus, India</td>
			<td>Ref 1732411420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD ; US</td>
			<td>REF 303060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane ( Forane)</td>
			<td>Asecia Queenborough</td>
			<td>No B506</td>
			<td>Inhalation Anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketamax)</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Melonex)</td>
			<td>Intas Pharmaceuticals Ltd; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; 
			curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Histo-Line Laboratories, Italy</td>
			<td>MRS3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Thread</td>
			<td>Mighty ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>GRM 3660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Tears/Eyemist Gel</td>
			<td>Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India</td>
			<td>P3060</td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGOT (ASAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGPT (ALAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryotome E Cryostat</td>
			<td>Thermo Electron Corporation ; US</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade No. 22</td>
			<td>La Medcare, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Board</td>
			<td>Locally made</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical White Tape</td>
			<td>3M India ; India</td>
			<td>1530-1</td>
			<td>Micropore Surgical Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon, Johnson &#38; Johnson, India</td>
			<td>NW 5047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1ml, 26 G)</td>
			<td>Dispo Van; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer (Clipper)</td>
			<td>Philips</td>
			<td>NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Machine</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#39;s E Media</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>AT125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Xylaxin)</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection of the rodent eye

Die okuläre Mikrodissektion des Nagetierauges beinhaltet die Segmentierung des enukleierten Augapfels mit der angebrachten Nickhaut oder dem dritten Augenlid, um die vorderen und hinteren Augenmuscheln zu erhalten. Mit dieser Technik können die Teilteile des Auges, einschließlich des Hornhautgewebes, des Nervengewebes, des retinalen Pigmentepithelgewebes (RPE) und der Linse, für Ganzkörper, Kryoschnitte und/oder Einzelzellsuspensionen eines bestimmten Augengewebes erhalten werden. Das Vorhandensein des dritten Augenlids bietet einzigartige und bedeutende Vorteile, da es der Aufrechterhaltung der Ausrichtung des Auges zugute kommt, was für das Verständnis der Augenphysiologie nach einem lokalisierten Eingriff oder bei Studien mit Augenanalyse in Bezug auf die räumliche Topographie des Auges wichtig ist.
Bei dieser Methode haben wir den Augapfel an der Augenhöhle zusammen mit dem dritten Augenlid enukleiert, indem wir vorsichtig und langsam durch die extraokularen Muskeln geschnitten und den Sehnerv durchtrennt haben. Der Augapfel wurde mit einer Mikroklinge durch den Hornhautlimbus gestochen. Der Schnitt wurde als Eintrittspunkt verwendet, der es ermöglichte, entlang des Hornhaut-Sklera-Übergangs zu schneiden, indem eine Mikroschere durch die Inzisionsstelle eingeführt wurde. Es wurden kleine und kontinuierliche Schnitte entlang des Umfangs vorgenommen, bis sich die Becher trennten. Diese könnten weiter präpariert werden, indem die durchscheinende Schicht der neuralen Netzhaut mit einer Colibri-Nahzange sanft abgezogen wird, um die neurale Netzhaut und die RPE-Schichten zu erhalten. Ferner wurden drei/vier äquidistante Schnitte von der Peripherie senkrecht zum optischen Zentrum vorgenommen, bis der Sehnerv erreicht war. Dadurch öffneten sich die halbkugelförmigen Becher in eine Röschenform, so dass sie flach fielen und leicht montiert werden konnten. Diese Technik wurde in unserem Labor für Hornhaut-Wholemounts und Netzhautschnitte verwendet. Das Vorhandensein des dritten Augenlids beschreibt die nasal-zeitliche Orientierung, die die Untersuchung verschiedener zelltherapeutischer Interventionen nach der Transplantation und damit die gezielte physiologische Validierung ermöglicht, die für die Visualisierung und genaue Darstellung in solchen Studien unerlässlich ist.

Ein ganzer Berg von rd1-Augen-/Hornhautgewebe der Maus wurde hergestellt, um eine mögliche Lymphangiogenese im vorderen / Hornhautgewebe in einem erkrankten Zustand zu untersuchen. Das anhaftende Bindehautgewebe aus dem dritten Augenlid wirkte als Positivkontrolle, da der Hornhaut Lymphgefäße fehlen. Für die Studie wurde das Hornhautgewebe mit der Bindehaut präpariert und mit 4% PFA fixiert, gefolgt von Permeabilisierung und Blockierung. Das Gewebe wurde dann mit einem primären Antikörper gegen den lymphatischen E...

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Microdissection of the Rodent Eye

In diesem Artikel wird ein Protokoll für die okuläre Mikrodissektion bei Nagetieren vorgestellt. Der Prozess beinhaltet die Enukleation des Augapfels zusammen mit der Nickhaut (d.h. dem dritten Augenlid). Es folgt die Trennung der hinteren und vorderen Augenmuscheln.

Mikrodissektion des Nagetierauges

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, ...

Die Augenforschung in früheren Zeiten stützte sich hauptsächlich auf das Augengewebe von Verstorbenen. Im Laufe der Jahre wurden jedoch viele ophthalmologische Nagetiermodelle entwickelt und der Bedarf an menschlichem Augengewebe hat abgenommen. Aufgrund der geringen Größe und des begrenzten Operationsbereichs im Auge des Nagetiers ist der effektive Zugang zu den okulären Unterteilen stark eingeschränkt.Um das Auge eines Nagetiers zu operieren, wird das Auge typischerweise über den Sehnerv immobilisiert und die Dissektion durchgeführt. Diese Praxis ist mühsam und kann das zerbrechliche Gewebe beschädigen, da sich das sphärische Auge während der Dissektion weiter bewegt. Obwohl diese Technik bei der Isolierung der verschiedenen Abschnitte der Netzhautschichten vorteilhaft ist, kann sie die räumliche Orientierung des Gewebes bei der Dissektion des Gewebes nicht abgrenzen.Darüber hinaus ist ein gezielter Eingriff nach der Dissektion aufgrund der homogenen zellulären Anordnung der hinteren und vorderen Augenmuschel schwer zu lokalisieren. In diesem Video wird eine modifizierte Operationsmethode für die Mikrodissektion demonstriert. Das Vorhandensein der angebrachten Nickhaut oder des dritten Augenlids bietet einzigartige und signifikante Vorteile.Bei dieser Methode wird zuerst der Augapfel mit dem dritten Augenlid enukleiert, dann wird das dritte Augenlid verwendet, um das Auge zu immobilisieren. Es folgt das Durchstechen des Augapfels durch den Hornhautlimbus, und der Schnitt wird als Eintrittspunkt verwendet. Dann werden durch Schneiden entlang des Umfangs vordere und hintere Augenmuscheln getrennt.Durch eine weitere Sektion der hinteren Augenmuschel wird die durchscheinende Schicht der neuralen Netzhaut identifiziert und sanft abgezogen. Auf diese Weise werden die neuronalen und RPE-Schichten für die weitere Verarbeitung erhalten. Das dritte Augenlid ermöglicht es uns, die räumliche Orientierung der Enukleation des Augenpfostens abzugrenzen.Lassen Sie uns nun eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung befolgen. Erweitern Sie die Augen der Nagetiere mit einem Tropfen 0,8 % Tropicamid und 5 % Phenylephrin-Augenlösungen und legen Sie das Tier vor dem Eingriff 30 Minuten lang in einen dunklen Bereich. Euthanasieren Sie das Tier durch intraperitoneale Verabreichung der fünffachen Anästhesie.Eine typische Dosis beträgt 200 Mikroliter PBS, die 10 mg Ketamin und ein mg Xylazin enthalten. Bestätigen Sie das völlige Fehlen einer Reaktion auf den Reiz, indem Sie den Pedalreflex untersuchen. Legen Sie die Maus in die seitliche Liegelage, um einen vollständigen Zugang zum Auge zu ermöglichen.Halten Sie eine Colibri-Nahzange, eine gebogene Pinzette, eine Mikroklinge mit einer Größe von 15 Grad und drei Millimetern, eine Feder-Mikroschere und eine abgewinkelte Feder-Mikroschere für den Eingriff bereit. Legen Sie eine gebogene Pinzette um den Augapfel und kneifen Sie, um das Auge von Fremdanhaftungen zu befreien. Das dritte Augenlid, auch Nickhaut genannt, befindet sich in Richtung des oberen Winkels der Nasentangente und kann als kleiner durchscheinender Vorsprung mit pigmentierten Rändern identifiziert werden.Verwenden Sie anschließend eine Federmikroschere und schneiden Sie um den Augapfel herum. Kleine, kontinuierliche Schnitte lösen den Augapfel von Skleraansätzen. Legen Sie eine gebogene Feder-Mikroschere unter den Augapfel, um das Auge zu befreien, indem Sie den Sehnerv durchtrennen.Legen Sie das enukleierte Auge in eine Petrischale, die PBS-Puffer enthält, so dass der Augapfel in PBS eingetaucht ist. Einige extraokulare Muskeln oder Gewebe beginnen vom Augapfel wegzuschweben. Entfernen Sie sie, indem Sie sie mit einer Feder-Mikroschere vom Augapfel abschneiden.Entfernen Sie dann den Sehnerv von der Basis des Augapfels, um eine bessere Trennung der Netzhaut für Wholemount-Präparate zu ermöglichen. Es ist nicht notwendig, den Sehnerv für die Gewebeschnitte zu entfernen. Übertragen Sie den Augapfel in ein 1,5-ml-Röhrchen, das einen ml 4% Paraformaldehyd oder PFA enthält.Bewahren Sie es zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf, um das Gewebe zu fixieren. Es ist möglich, bei diesem Schritt eine Pause einzulegen, indem das Gewebe bis zu 12 Stunden bei vier Grad Celsius in PFA belassen wird. Für die Isolierung lebender Zellen sollten die Fixierungsschritte jedoch nicht durchgeführt werden und der gesamte Vorgang muss im Kontinuum durchgeführt werden.Übertragen Sie den Augapfel nach der PFA-Fixierung in eine Petrischale, die PBS enthält, und legen Sie ihn unter ein Präpariermikroskop, um den nachfolgenden Eingriff durchzuführen. Immobilisieren Sie den Augapfel, indem Sie das dritte Augenlid mit einer Colibri-Nahzange festhalten. Der Limbus ist die Hornhaut-Sklera-Verbindung.Machen Sie einen kleinen Einschnitt am Limbus, indem Sie ihn mit einer Mikroklinge durchstechen. Der Schnitt erfolgt vorzugsweise gegenüber dem dritten Augenlid. Als nächstes nehmen Sie diesen Schnitt als Ausgangspunkt und machen Sie mit der Mikroschere kleine und kontinuierliche Schnitte entlang dieses Hornhaut-Sklera-Limbus-Umfangs.Vervollständigen Sie zuerst einen Halbkreis von Schnitten, beginnend mit dem Einschnitt bis zum dritten Augenlid. Vervollständigen Sie dann den verbleibenden Halbkreis der Schnitte auf der anderen Seite. Machen Sie zum Schluss einen Schnitt um das dritte Augenlid, um die hintere und die vordere Schale zu trennen.Entfernen Sie die Linse mit einer Pinzette aus dem hinteren Becher, um den hinteren Becher zu erhalten, der aus der neuralen Netzhaut und der RPE-Schicht und dem vorderen Hornhautpfanne besteht. Wenn mit nicht fixiertem Gewebe gearbeitet wird, können die vorderen und hinteren Cups nun enzymatisch verdaut werden, um eine einzellige Hornhaut- oder Netzhautsuspension zu erhalten. Um die Gewebe zu fixieren, geben Sie diese Becher 12 Stunden lang bei vier Grad Celsius in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml 4%PFA.Nach der Fixierung kann das Gewebe in ein geeignetes Medium eingebettet werden, und es kann eine Kryosektion oder Paraffinschnitte durchgeführt werden, um Hornhaut- oder Netzhautschnitte zu erhalten. Setzen Sie den hinteren Becher wieder in die Petrischale ein, die PBS-Puffer enthält. Eine undurchsichtige Schicht auf der pigmentierten RPE-Schicht ist die neurale Netzhaut.Ziehen Sie die Netzhaut mit einer zweiten Pinzette ab. Eine sehr sanfte und leichte Handbewegung wird dringend empfohlen, um das Gewebe nicht zu beschädigen. Am Ausgang des Sehnervs kann die gebogene Federschere unter die Netzhaut der Neuralnetzhaut eingeführt werden, und es kann ein Schnitt gemacht werden, um die Schichten vollständig zu befreien, wenn die Netzhaut anhaftet.Die Netzhaut kann auch durch sanftes Streicheln mit einer weichen Bürste befreit oder abgelöst werden. Führen Sie die vorderen und hinteren Becher wieder in die Petrischale ein, die PBS-Puffer enthält. Verwenden Sie eine abgewinkelte Feder-Mikroschere, um neben dem dritten Augenlid von der Peripherie senkrecht zum optischen Zentrum einen Schnitt zu machen.Halten Sie das dritte Augenlid fest und machen Sie einen Schnitt neben dem ersten Schnitt. Machen Sie einen ähnlichen Schnitt zwischen dem zweiten Schnitt und dem dritten Augenlid. Drei oder vier solcher äquidistanten Schnitte öffnen die halbkugelförmigen Becher zu einer Blütenform, die flach fällt und leicht montiert werden kann.Machen Sie keine sehr tiefen Schnitte bis zur Mitte der Tasse, da dies dazu führen kann, dass die Blattabschnitte auseinanderfallen oder sich leicht trennen. Das flüssige Medium ermöglicht es der vorderen Augenmuschel, eine gekrümmte Struktur zu erreichen. Befolgen Sie die gleichen Schritte wie beim Ausführen von Schnitten an der hinteren Pfanne, um drei oder vier gleich weit entfernte Schnitte an der vorderen Pfanne vorzunehmen.Das Gewebe ist nun bereit für die weitere Färbung. In dieser Abbildung ist die gesamte Halterung des vorderen Bechers dargestellt. Das Hornhautgewebe wurde wie beschrieben mikroseziert, um die Lymphgefäße im anhaftenden Bindehautgewebe des Hornhautsegels freizulegen.In dieser Abbildung ist der gesamte Berg der neuralen Netzhaut dargestellt. Das retinale Gefäßsystem der neuralen Netzhaut wurde mit Isolectin gefärbt und ist als grüne Gefäße sichtbar. Bei dieser Methode wird der enukleierte Augapfel der Mäuse mit dem angebrachten dritten Augenlid für eine effektive und einfache Handhabung erhalten.Das dritte Augenlid immobilisiert den Augapfel vollständig und ermöglicht eine einfache und fehlerfreie Dissektion. Diese Methode ist vorteilhaft für okuläre gewebespezifische Schnitte, Einzelzellanalysen und Wholemounts. Die Notwendigkeit einer wiederholten Gewebefixierung macht das Gewebe jedoch für Zellkulturen oder solche lebenden Zellnotwendigkeiten unbrauchbar.Daher muss das Verfahren im Kontinuum für die Isolierung lebender Zellen durchgeführt werden.

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Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

Laser-Mikrodissektion für Menschen Prostataepithel für die RNA-Analyse

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Quantitative Fundus-Autofluoreszenz für die Beurteilung von Netzhauterkrankungen

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy (rNAION)

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy rNAION

Das Nagetier-Modell der nonarteritic anteriore ischämische Optikusneuropathie (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Fluoreszenzfarbstoff-Markierung von Erythrozyten und Leukozyten zum Studieren der Flußdynamik bei der Maus-Retinal-Zirkulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

Punktion-induzierte Iris Neovaskularisation als einem Mausmodell der Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Räumliche Quantifizierung von Drogen in der Lungentuberkulose Läsionen durch Laser Capture Microdissection Flüssigkeit Gaschromatographie-Massenspektrometrie (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Charakterisierung einer neuartigen humanen organotypischen Netzhautkulturtechnik

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy

Anwendung der optischen Kohärenztomographie auf ein Mausmodell der Retinopathie

Optical coherence tomography (OCT) offers a noninvasive method for the diagnosis of retinopathy. The OCT machine can capture retinal crosssectional images ...