Name: microdissection of the rodent eye
Uploaded: 2023-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection of the Rodent Eye at JoVE.com

ד"ר אלקננדה מישרה, המחלקה לביולוגיה של התא ואנטומיה אנושית, אוניברסיטת קליפורניה דייוויס, ארה"ב, הכשירה אותנו בשיטה זו במכון הלאומי לאימונולוגיה, ניו דלהי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק הליבה שהתקבל מהמחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו למכון הלאומי לאימונולוגיה, ניו דלהי. נ.ב. זכתה במלגת מחקר מטעם המחלקה לביוטכנולוגיה.

הליך זה אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בעלי חיים של המכון הלאומי לאימונולוגיה, ניו דלהי. מספר האסמכתא הסידורי של האישור הוא IAEC#480/18. הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות הרגולציה של הוועדה לבקרה ופיקוח על ניסויים בבעלי חיים, משרד הדיג, גידול בעלי חיים וחלב, ממשלת הודו, בפיקוח וטרינר מקצועי ב-SAF, ה...

<ol>
	<li>Choi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cancer+immunotherapy+using+patient-derived+xenografts+(PDXs)+in+humanized+mice.">Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice.</a> Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li><li>Sutherland, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+of+Highly+Pure+Trabecular+Meshwork+from+Mouse+Eyes+for+Gene+Expression+Analysis.">Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis.</a> J Vis Exp. (136), e57576 (2018).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Claybon, A., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+mouse+eye+for+a+whole+mount+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2563 (2011).</li><li>Steven, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+induction+and+three-dimensional+two-photon+imaging+of+conjunctiva-associated+lymphoid+tissue.">Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).</li><li>Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+wholemount+technique:+A+window+to+understanding+the+brain+and+behaviour.">The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour.</a> Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).</li><li>Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatics+and+lymphangiogenesis+in+the+eye.">Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye.</a> Journal of Ophthalmology. 2012, 783163 (2012).</li><li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood-derived+monocytes+show+neuronal+properties+and+integration+in+immune-deficient+rd1+mouse+model+upon+phenotypic+differentiation+and+induction+with+retinal+growth+factors.">Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412 (2020).</li></ol>

מיקרודיסקציה של העין נמצאה כמשימה קשה בשל גודלה הקטן וצורתה הכדורית של עין המכרסם, ועין המכרסם דורשת טכניקות חדשניות לטיפול יעיל8. 
בשיטה המודגמת הנוכחית, גלגל העין של העכבר מתקבל עם העפעף השלישי מחובר לטיפול יעיל וקל. באמצעות העפעף השלישי, גלגל העין יכול להיות ...

דיסקציה עינית היא טכניקה חשובה במחקר העיניים ואפשרה לחוקרים לגשת למקטעי העין למחקרים ממוקדים. בעבר, חוקרי עיניים הסתמכו על רקמת העין של אנשים חולים עבור המחקרים שלהם. עם זאת, המספר ההולך וגדל של זנים של מודלים מכרסמים אופתלמיים1 לאורך השנים הפחית את הצורך ברקמת עין אנושית. זני עכברים אלה אפשרו הבנה עמוקה יותר של מחלות עיניים והתערבויות. עם זאת, הם גם יצרו צורך בטכניקות חדשניות של מיקרו-דיסקציה עינית. הגודל הקטן ושטח הפעולה המוגבל מגבילים מאוד את הגישה היעילה לחלקי העין. יתר על כן, בשל הרכבה תאית הומוגנית של המשקפיים האחוריים והקדמיים, קשה לבצע התערבויות ממוקדות לאחר דיסקציה. טכניקות המיקרו-דיסקציה הנוכחיות של לייזר2 ומיקרודיסקציה כירורגית 3,4 אינן מספקות בעמידה בדרישות כאלה של מחקר עיני. מיקרו-דיסקציה בלייזר יעילה מאוד באנליזה של תא בודד, אך יש לנתח את הרקמה הספציפית לפני הליך הלייזר2. הטכניקה יכולה לבודד אזורים קטנים של עניין מרקמה שנותחה מראש לצורך אנליזה מולקולרית. לפיכך, הטכניקה אינה מתאימה להכנת wholemounts או לבידוד של שכבות עיניים ארוזות אקסיאלית עבור הדמיה אופטימלית.
השיטה הכירורגית היא הטכניקה הנפוצה ביותר; שיטה זו כוללת השתקת העין דרך עצב הראייה5 ולאחר מכן ביצוע הדיסקציה. תרגול זה הוא מפרך ויכול לפגוע בכל רקמה שברירית, כמו העין הכדורית ממשיכה לנוע במהלך דיסקציה. למרות היותה מועילה לבידוד החלקים השונים של שכבות הרשתית, הטכניקה אינה יכולה לתחום את הכיוון המרחבי של הרקמה בעת הדיסקציה.
במהלך הדיסקציה, שמירה על נוכחות הממברנה המחוברת או העפעף השלישי (איור 1) מציגה יתרונות ייחודיים ומשמעותיים. בשיטה זו, ראשית, גלגל העין הוא enucleated עם העפעף השלישי. לאחר מכן, העפעף השלישי משמש לשיתוק העין6 (איור 2A). לאחר מכן חודרים את גלגל העין דרך לימבוס הקרנית ומשתמשים בחתך כנקודת הכניסה (איור 2B,C). לאחר מכן, המשקפיים מופרדים על-ידי חיתוך לאורך ההיקף הקדמי והאחורי (איור 2D-G). על ידי ניתוח נוסף של העין האחורית, ניתן לזהות את השכבה השקופה של הרשתית העצבית ולקלף אותה בעדינות. לאחר מכן שלושה או ארבעה חתכים במרחקים שווים בגביעים הקדמיים והאחוריים המתקבלים, אשר מאפשרים לגביעים בצורת פרח ליפול שטוחים על מגלשה (איור 2H).
העפעף השלישי מסייע לטיפול קל ויעיל במהלך הדיסקציה, ובכך מבטיח נזק מינימלי לרקמה בעת גישה לשכבות העין השונות ובעת ייצור שלמים. יתר על כן, נוכחותו של העפעף השלישי מסייעת לאתר ולבחון התערבויות מקומיות במהלך הדמיה.
ההליך, במעבדה שלנו, בוצע על CBA/J או זן עכבר rd1 ב P28 מכל מין. ההליך יכול להתבצע על כל זן, גיל או מין של בעל חיים ואין לו הטיה על פי מאפיינים אלה.
בעלי החיים נרכשו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים) ותוחזקו במתקן לחיות קטנות (SAF) במכון הלאומי לאימונולוגיה (NII). הם הוחזקו בכלובים מאווררים נפרדים (IVC) וקיבלו גישה אד ליביטום , למים ומזון חומציים. הם נשמרו ב 21-23 ° C ועם מחזור אור / חושך של 14 שעות / 10 שעות.
להלן שיטה כירורגית שונה למיקרו-דיסקציה של עין עכבר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetaminophen (Biocetamol)</td>
			<td>EG Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Kit (DEA)</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated analyser</td>
			<td>Tulip, Alto Santracruz, India</td>
			<td>Screen Maaster 3000</td>
			<td>Biochemical analyser for liver functional test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine (Povidon-Iodine Solution)</td>
			<td>Win-Medicare;&#160; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet ( Class I)</td>
			<td>Kartos international; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright Field Microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>LX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBA/J inbred mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No. 000654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime (Taxim)</td>
			<td>AlKem ; India</td>
			<td></td>
			<td>cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Buds</td>
			<td>Pure Swabs Pvt Ltd ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape Sheet</td>
			<td>JSD Surgicals, Delhi, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution, alcoholic</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>HT110132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>Ugo Basile; Italy</td>
			<td>211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Himedia, India</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair removing cream (Veet)</td>
			<td>Reckitt Benckiser , India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Mayer&#39;s</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>MHS16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>RM554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase From Sheep Testes</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>H6254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I.V. Cannula (Plusflon)</td>
			<td>Mediplus, India</td>
			<td>Ref 1732411420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD ; US</td>
			<td>REF 303060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane ( Forane)</td>
			<td>Asecia Queenborough</td>
			<td>No B506</td>
			<td>Inhalation Anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketamax)</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Melonex)</td>
			<td>Intas Pharmaceuticals Ltd; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; 
			curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Histo-Line Laboratories, Italy</td>
			<td>MRS3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Thread</td>
			<td>Mighty ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>GRM 3660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Tears/Eyemist Gel</td>
			<td>Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India</td>
			<td>P3060</td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGOT (ASAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGPT (ALAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryotome E Cryostat</td>
			<td>Thermo Electron Corporation ; US</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade No. 22</td>
			<td>La Medcare, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Board</td>
			<td>Locally made</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical White Tape</td>
			<td>3M India ; India</td>
			<td>1530-1</td>
			<td>Micropore Surgical Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon, Johnson &#38; Johnson, India</td>
			<td>NW 5047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1ml, 26 G)</td>
			<td>Dispo Van; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer (Clipper)</td>
			<td>Philips</td>
			<td>NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Machine</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#39;s E Media</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>AT125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Xylaxin)</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection of the rodent eye

המיקרו-דיסקציה העינית של עין המכרסם כוללת פילוח של גלגל העין המצוי עם הממברנה המצורפת, או העפעף השלישי, כדי להשיג את המשקפיים הקדמיים והאחוריים. בטכניקה זו, ניתן להשיג את חלקי המשנה של העין, כולל רקמת הקרנית, הרקמה העצבית, רקמת אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) והעדשה, עבור סיטומות, חתך קריו, ו / או מתלים חד תאי של רקמת עין ספציפית. נוכחותו של העפעף השלישי טומנת בחובה יתרונות ייחודיים ומשמעותיים, שכן היא מועילה לשמירה על כיוון העין, החשוב להבנת הפיזיולוגיה של העין לאחר התערבות מקומית כלשהי או במחקרים הכוללים אנליזה עינית הנוגעת לטופוגרפיה המרחבית של העין.
בשיטה זו חינכנו את גלגל העין בשקע יחד עם העפעף השלישי על ידי חיתוך זהיר ואיטי של השרירים החוץ-עיניים וקטיעת עצב הראייה. גלגל העין נוקב דרך לימבוס הקרנית באמצעות מיקרובלייד. החתך שימש כנקודת הכניסה, ואיפשר חיתוך לאורך צומת הקרנית-סקלרלית על ידי החדרת מיקרו-מספריים דרך נקודת החתך. חתכים קטנים ורצופים לאורך ההיקף נעשו עד שהכוסות נפרדו. ניתן לנתח אותם עוד יותר על ידי קילוף עדין של השכבה השקופה של הרשתית העצבית באמצעות מלקחיים לתפירת קוליברי כדי להשיג את שכבות הרשתית העצבית וה- RPE. יתר על כן, שלושה/ארבעה חתכים במרחקים שווים נעשו מהפריפריה בניצב למרכז הראייה עד להגעה לעצב הראייה. פעולה זו פתחה את הגביעים ההמיספריים לצורת פרח כך שהם נפלו שטוחים וניתן היה להרכיב אותם בקלות. טכניקה זו שימשה במעבדה שלנו עבור wholemounts הקרנית וקטעי הרשתית. נוכחותו של העפעף השלישי מסמנת את האוריינטציה האף-טמפורלית, המאפשרת לימוד התערבויות שונות של תרפיה תאית לאחר ההשתלה, ומכאן התיקוף הפיזיולוגי הממוקד החיוני להדמיה ולייצוג מדויק במחקרים כאלה.

רקמת עין/קרנית עכבר RD1 הוכנה כדי לחקור אנגיוגנזה לימפוגרפית פוטנציאלית ברקמה הקדמית/הקרנית במצב חולה. רקמת הלחמית המחוברת מהעפעף השלישי פעלה כבקרה חיובית, שכן הקרנית חסרה כלי לימפה. לצורך המחקר, רקמת הקרנית נותחה עם הלחמית ותוקנה עם 4% PFA, ולאחר מכן חלחול וחסימה. לאחר מכן הרקמה הוכתמה בנוגדן...

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection of the Rodent Eye at JoVE.com

Microdissection of the Rodent Eye

מאמר זה מציג פרוטוקול למיקרו-דיסקציה עינית במכרסמים. התהליך כולל את האינקולציה של גלגל העין יחד עם הממברנה הניקטיבית (כלומר, העפעף השלישי). לאחר מכן מתבצעת הפרדה של המשקפיים האחוריים והקדמיים.

מיקרודיסקציה של עין המכרסם

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, ...

מחקר העיניים בזמנים קדומים הסתמך בעיקר על רקמת העין של אנשים שנפטרו. עם זאת, במהלך השנים פותחו מודלים רבים של מכרסמים אופתלמיים והצורך ברקמת עין אנושית פחת. בשל גודלו הקטן ושטח הפעילות המצומצם בעין המכרסם, הגישה היעילה לחלקי העין מוגבלת מאוד.בדרך כלל, כדי לנתח עין של מכרסם, העין משותקת דרך עצב הראייה והדיסקציה מבוצעת. תרגול זה הוא מפרך ועלול לפגוע ברקמה השברירית כאשר העין הכדורית ממשיכה לנוע במהלך הדיסקציה. למרות היותה מועילה בבידוד החלקים השונים של שכבות הרשתית, טכניקה זו אינה יכולה לתחום את הכיוון המרחבי של הרקמה בעת נתיחת הרקמה.יתר על כן, התערבות ממוקדת קשה לאתר לאחר דיסקציה בשל הרכבה תאית הומוגנית של העין האחורית והקדמית. בסרטון זה מודגמת שיטה כירורגית שונה למיקרודיסקציה. הימצאותו של קרום הניקוט המצורף, או העפעף השלישי, מציגה יתרונות ייחודיים ומשמעותיים.בשיטה זו, תחילה גלגל העין הוא enucleated עם העפעף השלישי, ולאחר מכן העפעף השלישי משמש כדי לשתק את העין. זה ואחריו פירסינג גלגל העין דרך לימבוס הקרנית, ואת החתך משמש כנקודת הכניסה. לאחר מכן, על ידי חיתוך לאורך ההיקף, כוסות העין הקדמית והאחורית מופרדות.על ידי ניתוח נוסף של העין האחורית, השכבה השקופה של הרשתית העצבית מזוהה ומקולפת בעדינות. השכבות העצביות וה-RPE מתקבלות אפוא לעיבוד נוסף. העפעף השלישי יאפשר לנו לתחום את הכיוון המרחבי של עמוד העין.הבה נעקוב כעת אחר הליך מפורט שלב אחר שלב. להרחיב את העיניים מכרסם באמצעות טיפה של 0.8% tropicamide ו 5% phenylephrine פתרונות אופתלמיים ומניחים את החיה באזור כהה במשך 30 דקות לפני ההליך. להרדים את החיה על ידי מתן תוך צפקי חמש פעמים מנות של הרדמה.מינון טיפוסי הוא 200 מיקרוליטר PBS המכיל 10 מ"ג קטמין ואחד מ"ג קסילזין. אשר חוסר תגובה מוחלט לגירוי על ידי בחינת רפלקס הדוושה. הניחו את העכבר בשכיבה צידית כדי לאפשר גישה מלאה לעין.שמור על מלקחיים לתפירת קוליברי, מלקחיים מעוקלים, מיקרו-להב בגודל 15 מעלות שלושה מילימטר, מיקרו-מספריים קפיציים ומיקרו-מספריים קפיציים זוויתיים מוכנים להליך. מניחים מלקחיים מעוקלים סביב גלגל העין וצובטים כדי לשחרר את העין מחיבורים חיצוניים. העפעף השלישי, הידוע גם בשם הממברנה הניקטיבית, ממוקם לכיוון הפינה העליונה של משיק האף וניתן לזהותו כבליטה שקופה מינורית עם גבולות פיגמנטיים.לאחר מכן, להשתמש מיקרו מספריים קפיץ לחתוך סביב גלגל העין. חתכים קטנים ומתמשכים משחררים את גלגל העין מחיבורים סקלרליים. מניחים מיקרו-מספריים קפיציים מעוקלים מתחת לגלגל העין כדי לשחרר את העין על ידי חיתוך עצב הראייה.הניחו את העין המוחדרת בצלוחית פטרי המכילה חיץ PBS כך שגלגל העין יהיה שקוע ב-PBS. חלק מהשרירים או הרקמות החוץ-עיניות יתחילו לצוף הרחק מגלגל העין. הסר אותם על ידי חיתוך אותם גלגל העין באמצעות מיקרו מספריים קפיץ.לאחר מכן, הסר את עצב הראייה מבסיס גלגל העין כדי לאפשר הפרדה טובה יותר של הרשתית עבור ההכנות wholemount. אין צורך להסיר את עצב הראייה עבור חתך רקמות. מעבירים את גלגל העין לצינורית של 1.5 מ"ל המכילה מ"ל אחד של 4% פאראפורמלדהיד או PFA.שמור אותו במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס לקיבוע רקמות. ניתן לעצור בשלב זה על ידי השארת הרקמה ב- PFA עד 12 שעות בארבע מעלות צלזיוס. עם זאת, עבור בידוד של תאים חיים, שלבי הקיבוע לא צריך להתבצע ואת ההליך כולו צריך להתבצע ברצף.לאחר קיבוע PFA, העבירו את גלגל העין לצלחת פטרי המכילה PBS והניחו אותו תחת מיקרוסקופ מנתח כדי לבצע את ההליך הבא. לשתק את גלגל העין על ידי החזקת העפעף השלישי בחוזקה עם מלקחיים תופרים קוליברי. הלימבוס הוא צומת סקלרל הקרנית.בצע חתך קטן בלימבוס על ידי פירסינג באמצעות מיקרולהב. החתך נעשה רצוי מול העפעף השלישי. לאחר מכן, באמצעות חתך זה כנקודת התחלה, עם מספריים מיקרו לבצע חתכים קטנים ומתמשכים לאורך היקף זה לימבוס סקלרלי הקרנית.ראשית, השלימו חצי עיגול של חתכים החל מנקודת החתך ועד לעפעף השלישי. לאחר מכן השלימו את חצי העיגול הנותר של החתכים בצד השני. לבסוף, בצע חתך סביב העפעף השלישי כדי להפריד בין הגביע האחורי והקדמי.הסר את העדשה מהגביע האחורי באמצעות מלקחיים כדי לקבל את הגביע האחורי המורכב מהרשתית העצבית ושכבת RPE ואת הגביע הקדמי של הקרנית. אם עובדים עם רקמות לא מקובעות, ניתן כעת לעכל אנזימטית את הגביעים הקדמיים והאחוריים כדי לקבל תרחיף חד תאי בקרנית או ברשתית. לקיבוע הרקמות, העבירו כוסות אלה לצינור של 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של 4% PFA למשך 12 שעות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר הקיבוע, ניתן להטביע את הרקמה במדיום המתאים וניתן לבצע קריוסקציה או חתך פרפין כדי להשיג חתכים בקרנית או ברשתית. הכניסו מחדש את הכוס האחורית לצלחת הפטרי המכילה חיץ PBS. שכבה אטומה על שכבת RPE פיגמנטית היא הרשתית העצבית.יש לקלף את הרשתית העצבית באמצעות מלקחיים שנייה. תנועה עדינה וקלה מאוד של היד מומלצת מאוד כדי לא לפגוע ברקמה. בעצב הראייה, יציאה, ניתן להחדיר את מספריים הקפיץ המעוקלים מתחת לרשתית העצבית, וניתן לבצע חתך כדי לשחרר לחלוטין את השכבות אם הרשתית העצבית נשארת מחוברת.ניתן גם לשחרר או לנתק את הרשתית על ידי ליטוף עדין עם מברשת רכה. הכניסו מחדש את הכוסות הקדמיות והאחוריות לצלחת פטרי המכילה חיץ PBS. השתמש במיקרו-מספריים קפיציים זוויתיים כדי לבצע חתך ליד העפעף השלישי מהפריפריה בניצב לכיוון מרכז הראייה.שמרו על אחיזה בעפעף השלישי ובצעו חתך ליד החתך הראשון. בצע חתך דומה בין החתך השני לעפעף השלישי. שלושה או ארבעה חתכים כאלה במרחקים שווים פותחים את הגביעים החצי ספריים לצורת פרח, שנופלת שטוחה וניתנת להרכבה בקלות.אין לבצע חתכים עמוקים מאוד עד למרכז הכוס, שכן זה עלול לגרום לחלקי העלה להתפרק או להיפרד בקלות. התווך הנוזלי מאפשר לגביע העין הקדמי להשיג מבנה מעוקל. בצע את אותם השלבים שניתנו לביצוע חתכים על הכוס האחורית כדי לבצע שלושה או ארבעה חתכים במרחק שווה על הכוס הקדמית.הרקמות מוכנות כעת להכתמה נוספת. באיור זה, wholemount של קדמית מוצג. רקמת הקרנית עברה מיקרודיסקציה כמתואר כדי לחשוף את כלי הלימפה ברקמת הלחמית המחוברת של עלון הקרנית.באיור זה, wholemount של הרשתית העצבית מוצג. כלי הדם ברשתית של הרשתית העצבית הוכתמו באיזולקטין ונראים ככלי דם ירוקים. בשיטה זו, גלגל העין של העכברים מתקבל עם העפעף השלישי המחובר לטיפול יעיל וקל.העפעף השלישי משתק את גלגל העין לחלוטין ומאפשר לדיסקציה להתקדם בקלות ובמינימום טעויות. שיטה זו מועילה עבור חתך ספציפי לרקמת העין, אנליזה של תא בודד וסיטונים. עם זאת, הצורך בקיבוע רקמה חוזר הופך את הרקמה לבלתי בת קיימא עבור תרבית תאים או צרכים כאלה של תאים חיים.לפיכך, יש לבצע את ההליך ברצף לבידוד תאים חיים.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Medicine

Unit 1

The Special Senses

SCIENTISTS IN ACTION

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

במודל עכבר של Assay את הקרנית Pocket לחקר אנגיוגנזה

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

פרוטוקול משופר עבור microdissection הליזר של איי לבלב אנושיים מדוגמאות כירורגים

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

Microdissection לייזר לכידתו של אדם הערמונית האפיתל לניתוח RNA

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

כמותי הפונדוס autofluorescence עבור הערכת מחלות רשתית

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy (rNAION)

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy rNAION

המודל המכרסם של Nonarteritic Anterior Ischemic Optic נוירופתיה (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

פלואורסצנטי Dye תיוג של Erythrocytes ו leukocytes ללימוד דינמיקה זרימה של זרימת עכבר הרשתית

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

ניקוב-Induced כורוידאלית איריס כמודל העכבר של Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

כימות המרחבי של תרופות נגעים שחפת הריאה על ידי לייזר ללכוד Microdissection נוזלי כרומטוגרפיה ספקטרומטר מסה (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

אפיון טכניקה חדשנית של תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy

יישום טומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית למודל עכבר של רטינופתיה

Optical coherence tomography (OCT) offers a noninvasive method for the diagnosis of retinopathy. The OCT machine can capture retinal crosssectional images ...