Name: microdissection of the rodent eye
Uploaded: 2023-04-21T12:30:00
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अलकनंदा मिश्रा, सेल बायोलॉजी एंड ह्यूमन एनाटॉमी विभाग, कैलिफोर्निया डेविस विश्वविद्यालय, यूएसए ने हमें नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ इम्यूनोलॉजी, नई दिल्ली में इस पद्धति में प्रशिक्षित किया। इस कार्य को जैव प्रौद्योगिकी विभाग, भारत सरकार से राष्ट्रीय प्रतिरक्षा विज्ञान संस्थान, नई दिल्ली को प्राप्त कोर अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। पीएस को जैव प्रौद्योगिकी विभाग द्वारा एक शोध फैलोशिप प्रदान की गई थी।

इस प्रक्रिया को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ इम्यूनोलॉजी, नई दिल्ली की संस्थागत पशु आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। अनुमोदन की क्रम संदर्भ संख्या IAEC # 480/18 है। एसएएफ, एनआईआई में एक पेशेवर पशु चिकित्सक की ...

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	<li>Choi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cancer+immunotherapy+using+patient-derived+xenografts+(PDXs)+in+humanized+mice.">Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice.</a> Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li><li>Sutherland, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+of+Highly+Pure+Trabecular+Meshwork+from+Mouse+Eyes+for+Gene+Expression+Analysis.">Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis.</a> J Vis Exp. (136), e57576 (2018).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Claybon, A., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+mouse+eye+for+a+whole+mount+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2563 (2011).</li><li>Steven, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+induction+and+three-dimensional+two-photon+imaging+of+conjunctiva-associated+lymphoid+tissue.">Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).</li><li>Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+wholemount+technique:+A+window+to+understanding+the+brain+and+behaviour.">The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour.</a> Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).</li><li>Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatics+and+lymphangiogenesis+in+the+eye.">Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye.</a> Journal of Ophthalmology. 2012, 783163 (2012).</li><li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood-derived+monocytes+show+neuronal+properties+and+integration+in+immune-deficient+rd1+mouse+model+upon+phenotypic+differentiation+and+induction+with+retinal+growth+factors.">Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412 (2020).</li></ol>

कृंतक आंख के छोटे आकार और गोलाकार आकार के कारण ओकुलर माइक्रोडिसेक्शन एक मुश्किल काम पाया गया है, और कृंतक आंख को कुशल हैंडलिंग 8 के लिए नवीनतकनीकों की आवश्यकता होती है। 
वर्तमान प्रद...

नेत्र विच्छेदन नेत्र अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण तकनीक है और जांचकर्ताओं को लक्षित अध्ययन के लिए आंख के खंडों तक पहुंचने की अनुमति दी है। इससे पहले, ओकुलर शोधकर्ताअपने अध्ययन के लिए रोगग्रस्त व्यक्तियों से ओकुलर ऊतक पर भरोसा करते थे। हालांकि, वर्षों से नेत्र कृंतक मॉडल1 के उपभेदों की उत्तरोत्तर बढ़ती संख्या ने मानव ओकुलर ऊतक की आवश्यकता को कम कर दिया है। इन माउस उपभेदों ने ओकुलर रोग और हस्तक्षेप की गहरी समझ की अनुमति दी है। फिर भी, उन्होंने ओकुलर माइक्रो-विच्छेदन की नवीन तकनीकों की आवश्यकता भी उत्पन्न की है। ऑपरेशन का छोटा आकार और सीमित क्षेत्र ओकुलर उप-भागों तक प्रभावी पहुंच को गंभीर रूप से बाधित करता है। इसके अलावा, पीछे और पूर्ववर्ती आंखों के कप की समरूप सेलुलर असेंबली के कारण, विच्छेदन के बाद लक्षित हस्तक्षेप करना मुश्किल है। लेजर2 और सर्जिकल माइक्रोडिसेक्शन 3,4 की वर्तमान सूक्ष्म विच्छेदन तकनीक ओकुलर अनुसंधान की ऐसी आवश्यकताओं को पूरा करने में अपर्याप्त हैं। लेजर माइक्रो-विच्छेदन एकल-कोशिका विश्लेषण में बहुत प्रभावी है, लेकिन लेजर प्रक्रिया2 से पहले विशिष्ट ऊतक को सूक्ष्म-विच्छेदित करने की आवश्यकता होती है। तकनीक आणविक विश्लेषण के लिए पूर्व-विच्छेदित ऊतक से रुचि के छोटे क्षेत्रों को अलग कर सकती है। इस प्रकार, तकनीक संपूर्ण तैयार करने या इष्टतम विज़ुअलाइज़ेशन के लिए अक्षीय रूप से पैक ओकुलर परतों के अलगाव के लिए उपयुक्त नहीं है।
सर्जिकल विधि सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक है; इस विधि में ऑप्टिक तंत्रिका5 के माध्यम से आंख को स्थिर करना और फिर विच्छेदन करना शामिल है। यह अभ्यास कठिन है और किसी भी नाजुक ऊतक को नुकसान पहुंचा सकता है, क्योंकि गोलाकार आंख विच्छेदन के दौरान चलती रहती है। रेटिना परतों के विभिन्न वर्गों को अलग करने के लिए फायदेमंद होने के बावजूद, तकनीक विच्छेदन पर ऊतक के स्थानिक अभिविन्यास को सीमांकित नहीं कर सकती है।
विच्छेदन के दौरान, संलग्न निकोटिटिंग झिल्ली या तीसरी पलक (चित्रा 1) की उपस्थिति को बनाए रखना अद्वितीय और महत्वपूर्ण लाभ प्रस्तुत करता है। इस विधि में, सबसे पहले, नेत्रगोलक को तीसरी पलक के साथ एन्यूक्लिएटेड किया जाता है। फिर, तीसरी पलक का उपयोग आंख6 (चित्रा 2 ए) को गतिहीन करने के लिए किया जाता है। इसके बाद कॉर्नियल लिम्बस के माध्यम से नेत्रगोलक को छेदना और प्रवेश के बिंदु के रूप में चीरा का उपयोग करना (चित्रा 2 बी, सी)। फिर, आंखों के कप को परिधि के साथ पूर्वकाल और पीछे की ओर काटकर अलग किया जाता है (चित्रा 2 डी-जी)। पीछे के आईकप को आगे विच्छेदित करके, तंत्रिका रेटिना की पारभासी परत की पहचान की जा सकती है और धीरे से छील दिया जा सकता है। तीन या चार समान दूरी के कट तब प्राप्त अर्धगोलाकार पूर्ववर्ती और पीछे के कप में किए जाते हैं, जो इन फूलों के आकार के कपों को स्लाइड पर सपाट गिरने की अनुमति देते हैं (चित्रा 2 एच)।
तीसरी पलक विच्छेदन के दौरान आसान और कुशल हैंडलिंग में सहायता करती है, इस प्रकार विभिन्न ओकुलर परतों तक पहुंचने के दौरान और पूरे अंडे का उत्पादन करते समय ऊतक को न्यूनतम नुकसान सुनिश्चित करती है। इसके अलावा, तीसरी पलक की उपस्थिति विज़ुअलाइज़ेशन के दौरान स्थानीय हस्तक्षेप का पता लगाने और जांच करने में मदद करती है।
हमारी प्रयोगशाला में, प्रक्रिया, किसी भी लिंग के पी 28 पर सीबीए / जे या आरडी 1 माउस स्ट्रेन पर की गई है। प्रक्रिया जानवर के किसी भी तनाव, उम्र या लिंग पर की जा सकती है और इन विशेषताओं के अनुसार कोई पूर्वाग्रह नहीं है।
जानवरों को वाणिज्यिक स्रोतों से खरीदा गया था ( सामग्री की तालिका देखें) और राष्ट्रीय प्रतिरक्षा विज्ञान संस्थान (एनआईआई) में लघु पशु सुविधा (एसएएफ) में बनाए रखा गया था। उन्हें अलग-अलग हवादार पिंजरों (आईवीसी) में रखा गया था और एसिडयुक्त ऑटोक्लेव पानी और भोजन तक पहुंच प्राप्त हुई थी। उन्हें 21-23 डिग्री सेल्सियस पर और 14 घंटे / 10 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र के साथ बनाए रखा गया था।
नीचे दिए गए माउस आंख के सूक्ष्म विच्छेदन के लिए एक संशोधित शल्य चिकित्सा विधि है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetaminophen (Biocetamol)</td>
			<td>EG Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Kit (DEA)</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated analyser</td>
			<td>Tulip, Alto Santracruz, India</td>
			<td>Screen Maaster 3000</td>
			<td>Biochemical analyser for liver functional test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine (Povidon-Iodine Solution)</td>
			<td>Win-Medicare;&#160; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet ( Class I)</td>
			<td>Kartos international; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright Field Microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>LX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBA/J inbred mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No. 000654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime (Taxim)</td>
			<td>AlKem ; India</td>
			<td></td>
			<td>cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Buds</td>
			<td>Pure Swabs Pvt Ltd ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape Sheet</td>
			<td>JSD Surgicals, Delhi, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution, alcoholic</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>HT110132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>Ugo Basile; Italy</td>
			<td>211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Himedia, India</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair removing cream (Veet)</td>
			<td>Reckitt Benckiser , India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Mayer&#39;s</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>MHS16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>RM554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase From Sheep Testes</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>H6254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I.V. Cannula (Plusflon)</td>
			<td>Mediplus, India</td>
			<td>Ref 1732411420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD ; US</td>
			<td>REF 303060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane ( Forane)</td>
			<td>Asecia Queenborough</td>
			<td>No B506</td>
			<td>Inhalation Anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketamax)</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Melonex)</td>
			<td>Intas Pharmaceuticals Ltd; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; 
			curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Histo-Line Laboratories, Italy</td>
			<td>MRS3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Thread</td>
			<td>Mighty ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>GRM 3660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Tears/Eyemist Gel</td>
			<td>Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India</td>
			<td>P3060</td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGOT (ASAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGPT (ALAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryotome E Cryostat</td>
			<td>Thermo Electron Corporation ; US</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade No. 22</td>
			<td>La Medcare, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Board</td>
			<td>Locally made</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical White Tape</td>
			<td>3M India ; India</td>
			<td>1530-1</td>
			<td>Micropore Surgical Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon, Johnson &#38; Johnson, India</td>
			<td>NW 5047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1ml, 26 G)</td>
			<td>Dispo Van; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer (Clipper)</td>
			<td>Philips</td>
			<td>NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Machine</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#39;s E Media</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>AT125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Xylaxin)</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection of the rodent eye

कृंतक आंख के ओकुलर माइक्रो-विच्छेदन में पूर्ववर्ती और पीछे के आंख के कप प्राप्त करने के लिए संलग्न छिद्रित झिल्ली, या तीसरी पलक के साथ एन्यूक्लिएटेड नेत्रगोलक का विभाजन शामिल है। इस तकनीक के साथ, कॉर्नियल ऊतक, तंत्रिका ऊतक, रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) ऊतक और लेंस सहित आंख के उप-भागों को एक विशिष्ट ओकुलर ऊतक के पूरे भरण, क्रायो-सेक्शनिंग और / या एकल-कोशिका निलंबन के लिए प्राप्त किया जा सकता है। तीसरी पलक की उपस्थिति अद्वितीय और महत्वपूर्ण फायदे प्रस्तुत करती है, क्योंकि यह आंख के अभिविन्यास के रखरखाव को लाभ पहुंचाती है, जो किसी भी स्थानीय हस्तक्षेप के बाद आंखों के शरीर विज्ञान को समझने या आंख की स्थानिक स्थलाकृति से संबंधित ओकुलर विश्लेषण से जुड़े अध्ययनों में महत्वपूर्ण है।
इस विधि में, हमने ध्यान से और धीरे-धीरे एक्स्ट्राओकुलर मांसपेशियों को काटकर और ऑप्टिक तंत्रिका को अलग करके तीसरी पलक के साथ सॉकेट पर नेत्रगोलक को अलग किया। एक माइक्रोब्लेड का उपयोग करके कॉर्नियल लिम्बस के माध्यम से नेत्रगोलक को छेद दिया गया था। चीरा का उपयोग प्रवेश बिंदु के रूप में किया गया था, जिससे चीरा बिंदु के माध्यम से माइक्रो-कैंची डालकर कॉर्नियल-स्क्लेरल जंक्शन के साथ काटने की अनुमति मिलती थी। परिधि के साथ छोटे और निरंतर कटौती की गई जब तक कि कप अलग नहीं हो गए। तंत्रिका रेटिना और आरपीई परतों को प्राप्त करने के लिए कोलिब्री ट्यूरिंग फोर्सप्स का उपयोग करके तंत्रिका रेटिना की पारभासी परत को धीरे से छीलकर इन्हें और विच्छेदित किया जा सकता है। इसके अलावा, ऑप्टिक तंत्रिका तक पहुंचने तक ऑप्टिक केंद्र के लंबवत परिधि से तीन/चार समान दूरी के कट किए गए थे। इसने अर्धगोलाकार कपों को एक फूलों के आकार में खोल दिया ताकि वे सपाट गिर जाएं और आसानी से चढ़ सकें। इस तकनीक का उपयोग हमारी प्रयोगशाला में कॉर्नियल होलमाउंट और रेटिना सेक्शन के लिए किया गया है। तीसरी पलक की उपस्थिति नाक-अस्थायी अभिविन्यास को चित्रित करती है, जो प्रत्यारोपण के बाद विभिन्न सेल थेरेपी हस्तक्षेपों के अध्ययन की अनुमति देती है और इस प्रकार, ऐसे अध्ययनों में विज़ुअलाइज़ेशन और सटीक प्रतिनिधित्व के लिए महत्वपूर्ण लक्षित शारीरिक सत्यापन।

रोगग्रस्त अवस्था में पूर्ववर्ती/कॉर्नियल ऊतक में संभावित लिम्फ-एंजियोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए आरडी1 माउस आई/कॉर्नियल ऊतक की एक पूरी मात्रा तैयार की गई थी। तीसरी पलक से संलग्न नेत्रश्लेष्मला ऊतक...

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Microdissection of the Rodent Eye

यह पेपर कृन्तकों में ओकुलर माइक्रो-विच्छेदन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इस प्रक्रिया में नेत्रगोलक के न्यूक्लियेशन के साथ-साथ निकोटिटेटिंग झिल्ली (यानी, तीसरी पलक) शामिल है। इसके बाद पीछे और पूर्ववर्ती आंखों के कप को अलग किया जाता है।

कृंतक आंख का सूक्ष्म विच्छेदन

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, ...

पहले के समय में नेत्र संबंधी अनुसंधान ज्यादातर मृत व्यक्तियों से ओकुलर ऊतक पर निर्भर था। हालांकि, वर्षों से, कई नेत्र कृंतक मॉडल विकसित किए गए हैं और मानव ओकुलर ऊतक की आवश्यकता कम हो गई है। कृंतक की आंख में छोटे आकार और संचालन के सीमित क्षेत्र के कारण, ओकुलर उप-भागों तक प्रभावी पहुंच गंभीर रूप से बाधित है।आमतौर पर, कृंतक की आंख पर काम करने के लिए, आंख को ऑप्टिक तंत्रिका के माध्यम से स्थिर किया जाता है और विच्छेदन किया जाता है। यह अभ्यास कठिन है और नाजुक ऊतक को नुकसान पहुंचा सकता है क्योंकि विच्छेदन के दौरान गोलाकार आंख चलती रहती है। रेटिना परतों के विभिन्न वर्गों को अलग करने में फायदेमंद होने के बावजूद, यह तकनीक ऊतक के विच्छेदन पर ऊतक के स्थानिक अभिविन्यास को सीमांकित नहीं कर सकती है।इसके अलावा, पीछे और पूर्ववर्ती आंख कप की समरूप सेलुलर असेंबली के कारण एक लक्षित हस्तक्षेप का पता लगाना मुश्किल है। इस वीडियो में, माइक्रोडिसेक्शन के लिए एक संशोधित सर्जिकल विधि का प्रदर्शन किया गया है। संलग्न निकोटिटिंग झिल्ली, या तीसरी पलक की उपस्थिति, अद्वितीय और महत्वपूर्ण लाभ प्रस्तुत करती है।इस विधि में, पहले नेत्रगोलक को तीसरी पलक से एन्यूक्लिएट किया जाता है, फिर तीसरी पलक का उपयोग आंख को गतिहीन करने के लिए किया जाता है। इसके बाद कॉर्नियल लिम्बस के माध्यम से नेत्रगोलक को छेदा जाता है, और चीरा का उपयोग प्रवेश के बिंदु के रूप में किया जाता है। फिर, परिधि के साथ काटकर, पूर्ववर्ती और पीछे के आंखों के कप अलग हो जाते हैं।पीछे के आंख के कप को आगे विच्छेदित करके, तंत्रिका रेटिना की पारभासी परत की पहचान की जाती है और धीरे से छील दी जाती है। तंत्रिका और आरपीई परतों को इस प्रकार आगे की प्रक्रिया के लिए प्राप्त किया जाता है। तीसरी पलक हमें न्यूक्लियेशन के बाद आंखों के स्थानिक अभिविन्यास का सीमांकन करने में सक्षम करेगी।आइए अब हम विस्तृत चरण-दर-चरण प्रक्रिया का पालन करें। 0.8% ट्रॉपिकामाइड और 5% फेनिलफ्राइन नेत्र समाधान की एक बूंद का उपयोग करके कृंतक आंखों को पतला करें और प्रक्रिया से पहले 30 मिनट के लिए जानवर को अंधेरे क्षेत्र में रखें। एनेस्थीसिया की पांच बार खुराक को इंट्रापरिटोनियल रूप से प्रशासित करके जानवर को यूथेनाइज़ करें।एक विशिष्ट खुराक 200 माइक्रोलीटर पीबीएस है जिसमें 10 मिलीग्राम केटामाइन और एक मिलीग्राम ज़ाइलाज़िन होता है। पेडल रिफ्लेक्स की जांच करके उत्तेजना के प्रति प्रतिक्रिया की पूर्ण कमी की पुष्टि करें। आंख तक पूर्ण पहुंच की अनुमति देने के लिए माउस को पार्श्व रिकंबेंसी में रखें।प्रक्रिया के लिए एक कोलिब्री ट्यूरिंग फोर्स, एक घुमावदार बल, एक माइक्रो-ब्लेड 15 डिग्री तीन मिलीमीटर आकार, स्प्रिंग माइक्रो-कैंची और एक कोण वाली स्प्रिंग माइक्रो-कैंची तैयार रखें। आंखों की पुतली के चारों ओर एक घुमावदार बल रखें और आंख को बाहरी संलग्नकों से मुक्त करने के लिए चुटकी लें। तीसरी पलक, जिसे निकोटिटिंग झिल्ली के रूप में भी जाना जाता है, नाक स्पर्शरेखा के ऊपरी कोने की ओर स्थित है और इसे रंजित सीमाओं के साथ एक मामूली पारभासी प्रोट्यूबरेंस के रूप में पहचाना जा सकता है।इसके बाद, एक स्प्रिंग माइक्रो-कैंची का उपयोग करें और नेत्रगोलक के चारों ओर काट लें। छोटे, निरंतर कटौती नेत्रगोलक को स्क्लेरल संलग्नक से मुक्त करते हैं। ऑप्टिक तंत्रिका को काटकर आंख को मुक्त करने के लिए नेत्रगोलक के नीचे एक घुमावदार स्प्रिंग माइक्रो-कैंची रखें।पीबीएस बफर युक्त पेट्री डिश में एन्यूक्लिएटेड आंख रखें ताकि नेत्रगोलक पीबीएस में डूब जाए। कुछ एक्स्ट्राओकुलर मांसपेशियां या ऊतक नेत्रगोलक से दूर तैरना शुरू कर देंगे। स्प्रिंग माइक्रो-कैंची का उपयोग करके नेत्रगोलक को काटकर उन्हें हटा दें।फिर, आंखों के आधार से ऑप्टिक तंत्रिका को हटा दें ताकि होलमाउंट तैयारी के लिए रेटिना को बेहतर ढंग से अलग किया जा सके। ऊतक विभाजन के लिए ऑप्टिक तंत्रिका को हटाना आवश्यक नहीं है। नेत्रगोलक को 1.5-मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 4% पैराफॉर्मलडिहाइड या पीएफए का एक मिलीलीटर होता है।ऊतक निर्धारण के लिए इसे चार डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए रखें। चार डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे तक पीएफए में ऊतक को छोड़कर इस चरण पर रोकना संभव है। हालांकि, जीवित कोशिकाओं के अलगाव के लिए, निर्धारण चरणों का प्रदर्शन नहीं किया जाना चाहिए और पूरी प्रक्रिया को निरंतरता में किया जाना चाहिए।पीएफए निर्धारण के बाद, नेत्रगोलक को पीबीएस युक्त पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और बाद की प्रक्रिया करने के लिए इसे विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत रखें। कोलिब्री ट्यूरिंग फोर्स के साथ तीसरी पलक को मजबूती से पकड़कर नेत्रगोलक को स्थिर करें। लिम्बस कॉर्नियल स्क्लेरल जंक्शन है।माइक्रोब्लेड का उपयोग करके इसे छेदकर लिम्बस पर एक छोटा सा चीरा लगाएं। चीरा अधिमानतः तीसरी पलक के विपरीत बनाया जाता है। इसके बाद, इस चीरे को एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में उपयोग करते हुए, माइक्रो-कैंची के साथ इस कॉर्नियल स्क्लेरल लिम्बस परिधि के साथ छोटे और निरंतर कट बनाते हैं।सबसे पहले, चीरा बिंदु से शुरू होकर तीसरी पलक तक कट के एक अर्धवृत्त को पूरा करें। फिर दूसरी तरफ कट के शेष अर्धवृत्त को पूरा करें। अंत में, पीछे और पूर्ववर्ती कप को अलग करने के लिए तीसरी पलक के चारों ओर एक कट बनाएं।तंत्रिका रेटिना और आरपीई परत और कॉर्नियल पूर्ववर्ती कप से युक्त पश्चवर्ती कप प्राप्त करने के लिए बल का उपयोग करके लेंस को पीछे के कप से हटा दें। यदि अनिर्धारित ऊतकों के साथ काम कर रहे हैं, तो पूर्वकाल और पीछे के कप को अब कॉर्नियल या रेटिना सिंगल-सेल सस्पेंशन प्राप्त करने के लिए एंजाइमेटिक रूप से पचाया जा सकता है। ऊतकों को ठीक करने के लिए, इन कपों को चार डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 1 मिलीलीटर 4% पीएफए होता है।निर्धारण के बाद, ऊतक को उपयुक्त माध्यम में एम्बेडेड किया जा सकता है और कॉर्नियल या रेटिना अनुभाग प्राप्त करने के लिए क्रायोसेक्शनिंग या पैराफिन सेक्शनिंग की जा सकती है। पीबीएस बफर युक्त पेट्री डिश में पीछे के कप को फिर से पेश करें। पिगमेंटेड आरपीई परत पर एक अपारदर्शी परत तंत्रिका रेटिना है।दूसरे बल का उपयोग करके तंत्रिका रेटिना को छील लें। ऊतक को नुकसान न पहुंचाने के लिए हाथ की एक बहुत ही कोमल और मामूली गति की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। ऑप्टिक तंत्रिका में, बाहर निकलते हैं, घुमावदार स्प्रिंग कैंची को तंत्रिका रेटिना के नीचे डाला जा सकता है, और यदि तंत्रिका रेटिना जुड़ा रहता है तो परतों को पूरी तरह से मुक्त करने के लिए एक कट बनाया जा सकता है।रेटिना को नरम ब्रश के साथ धीरे से सहलाकर मुक्त या अलग भी किया जा सकता है। पीबीएस बफर युक्त पेट्री डिश में पूर्ववर्ती और पीछे के कप को फिर से पेश करें। ऑप्टिक केंद्र की ओर लंबवत रूप से परिधि से तीसरी पलक के बगल में कट बनाने के लिए एक कोण स्प्रिंग माइक्रो-कैंची का उपयोग करें।तीसरी पलक की पकड़ बनाए रखें और पहले कट के बगल में एक कट बनाएं। दूसरे कट और तीसरी पलक के बीच एक समान कट बनाएं। तीन या चार ऐसे समान दूरी के कट अर्धगोलाकार कप को फूल के आकार में खोलते हैं, जो सपाट गिरता है और आसानी से लगाया जा सकता है।कप के केंद्र तक बहुत गहरे कट न करें, क्योंकि इससे पत्ती के खंड आसानी से अलग या अलग हो सकते हैं। तरल माध्यम पूर्ववर्ती आंख कप को एक घुमावदार संरचना प्राप्त करने की अनुमति देता है। पूर्ववर्ती कप पर तीन या चार समान दूरी के कट बनाने के लिए पीछे के कप पर कटौती करने के लिए दिए गए चरणों का पालन करें।ऊतक अब आगे धुंधला होने के लिए तैयार हैं। इस आंकड़े में, पूर्वकाल कप की पूरी मात्रा दिखाई गई है। कॉर्नियल टिशू को माइक्रोविच्छेदन किया गया था जैसा कि कॉर्नियल लीफलेट के संलग्न नेत्रश्लेष्मला ऊतक में लसीका वाहिकाओं को प्रकट करने के लिए वर्णित किया गया था।इस आंकड़े में, तंत्रिका रेटिना की संपूर्ण मात्रा को दिखाया गया है। तंत्रिका रेटिना के रेटिना वाहिका को आइसोलेक्टिन के साथ दाग दिया गया था और हरे रंग की वाहिकाओं के रूप में दिखाई देता है। इस विधि में, प्रभावी और आसान हैंडलिंग के लिए चूहों की एन्यूक्लिएटेड आईबॉल को संलग्न तीसरी पलक के साथ प्राप्त किया जाता है।तीसरी पलक आंख की पुतली को पूरी तरह से स्थिर करती है और विच्छेदन को आसानी और न्यूनतम त्रुटियों के साथ आगे बढ़ने की अनुमति देती है। यह विधि ओकुलर ऊतक-विशिष्ट सेक्शनिंग, एकल-कोशिका विश्लेषण और होलमाउंट के लिए फायदेमंद है। हालांकि, दोहराए जाने वाले ऊतक निर्धारण की आवश्यकता ऊतक को सेल संस्कृति या ऐसी जीवित कोशिका आवश्यकताओं के लिए अव्यवहार्य बनाती है।इसलिए, लाइव सेल अलगाव के लिए प्रक्रिया को निरंतरता में किया जाना चाहिए।

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