Name: microdissection of the rodent eye
Uploaded: 2023-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection of the Rodent Eye at JoVE.com

Dr. Alaknanda Mishra, Institutt for cellebiologi og menneskelig anatomi, University of California Davis, USA, trente oss i denne metoden ved National Institute of Immunology, New Delhi. Dette arbeidet ble støttet av kjernebevilgningen mottatt fra Institutt for bioteknologi, Indias regjering til National Institute of Immunology, New Delhi. P.S. ble stipendiat ved Institutt for bioteknologi.

Denne prosedyren ble godkjent av Institutional Animal Ethics Committee ved National Institute of Immunology, New Delhi. Seriereferansenummeret for godkjenningen er IAEC#480/18. Forsøkene ble utført i samsvar med forskriftens retningslinjer fra Komiteen for kontroll og tilsyn med dyreforsøk, Fiskeri-, husdyrholds- og meieridepartementet, Indias regjering, under tilsyn av en profesjonell veterinær ved SAF, NII.
1. Forberedelse
<ol><li>Utvid gnagerøynene ved hjelp av en dr...

<ol>
	<li>Choi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cancer+immunotherapy+using+patient-derived+xenografts+(PDXs)+in+humanized+mice.">Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice.</a> Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li><li>Sutherland, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+of+Highly+Pure+Trabecular+Meshwork+from+Mouse+Eyes+for+Gene+Expression+Analysis.">Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis.</a> J Vis Exp. (136), e57576 (2018).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Claybon, A., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+mouse+eye+for+a+whole+mount+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2563 (2011).</li><li>Steven, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+induction+and+three-dimensional+two-photon+imaging+of+conjunctiva-associated+lymphoid+tissue.">Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).</li><li>Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+wholemount+technique:+A+window+to+understanding+the+brain+and+behaviour.">The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour.</a> Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).</li><li>Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatics+and+lymphangiogenesis+in+the+eye.">Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye.</a> Journal of Ophthalmology. 2012, 783163 (2012).</li><li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood-derived+monocytes+show+neuronal+properties+and+integration+in+immune-deficient+rd1+mouse+model+upon+phenotypic+differentiation+and+induction+with+retinal+growth+factors.">Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412 (2020).</li></ol>

Okulær mikrodisseksjon har vist seg å være en vanskelig oppgave på grunn av den lille størrelsen og sfæriske formen på gnagerøyet, og gnagerøyet krever innovative teknikker for effektiv håndtering8. 
I den nåværende demonstrerte metoden oppnås det enucleated musens øyeboll med det tredje øyelokket festet for effektiv og enkel håndtering. Ved hjelp av det tredje øyelokket kan øyebollet immobiliseres helt, noe som gjør at disseksjonen kan fortsette med ...

Okulær disseksjon er en viktig teknikk i oftalmisk forskning og har gitt etterforskere tilgang til øyets segmenter for målrettede studier. Tidligere stolte okulære forskere på det okulære vevet fra syke individer for sine studier. Imidlertid har det gradvis økende antall stammer av oftalmiske gnagermodeller1 gjennom årene redusert behovet for humant okulært vev. Disse musestammene har tillatt en dypere forståelse av okulær sykdom og inngrep. Likevel har de også generert et behov for innovative teknikker for okulær mikrodisseksjon. Den lille størrelsen og det begrensede operasjonsområdet begrenser i stor grad effektiv tilgang til de okulære underdelene. Videre, på grunn av den homogene cellulære monteringen av bakre og fremre øyekopper, er det vanskelig å gjennomføre målrettede inngrep etter disseksjon. De nåværende mikrodisseksjonsteknikkene for laser2 og kirurgisk mikrodisseksjon 3,4 er utilstrekkelige for å oppfylle slike krav til okulær forskning. Lasermikrodisseksjon er svært effektiv i enkeltcelleanalyse, men det spesifikke vevet må mikrodissekeres før laserprosedyren2. Teknikken kan isolere små regioner av interesse fra et forhåndsdissekert vev for molekylær analyse. Dermed er teknikken ikke egnet for å forberede helmonteringer eller for isolering av aksialt pakkede okulære lag for optimal visualisering.
Den kirurgiske metoden er den mest brukte teknikken; Denne metoden innebærer immobilisering av øyet via synsnerven5 og deretter utføre disseksjonen. Denne praksisen er vanskelig og kan skade skjøre vev, da det sfæriske øyet fortsetter å bevege seg under disseksjon. Til tross for at det er gunstig for å isolere de forskjellige delene av retinallagene, kan teknikken ikke avgrense vevets romlige orientering ved disseksjon.
Under disseksjon gir opprettholdelse av tilstedeværelsen av den vedlagte niktiteringsmembranen eller det tredje øyelokket (figur 1) unike og betydelige fordeler. I denne metoden blir øyebollet først enucleated med det tredje øyelokket. Deretter brukes det tredje øyelokket til å immobilisere øyet6 (figur 2A). Dette etterfølges av å stikke hull i øyeeplet gjennom hornhinnen limbus og bruke snittet som inngangspunkt (figur 2B,C). Deretter skilles øyekoppene ved å skjære langs omkretsen anteriort og bakover (figur 2D-G). Ved å dissekere den bakre øyekoppen ytterligere, kan det gjennomsiktige laget av nevrale netthinnen identifiseres og forsiktig avskalles. Tre eller fire like fjerne kutt blir deretter laget i de oppnådde halvkuleformede fremre og bakre koppene, noe som gjør at disse blomsterformede koppene faller flatt på et lysbilde (figur 2H).
Det tredje øyelokket hjelper til med enkel og effektiv håndtering under disseksjonen, og sikrer dermed minimal skade på vevet mens du får tilgang til de forskjellige okulære lagene og når du produserer helmonteringer. Videre bidrar tilstedeværelsen av det tredje øyelokket til å lokalisere og undersøke lokaliserte inngrep under visualisering.
Prosedyren, i vårt laboratorium, har blitt utført på en CBA / J eller en rd1 musestamme ved P28 av noe kjønn. Prosedyren kan utføres på hvilken som helst stamme, alder eller kjønn av dyr og har ingen skjevhet i henhold til disse egenskapene.
Dyrene ble anskaffet fra kommersielle kilder (se materialfortegnelse) og vedlikeholdt ved Small Animal Facility (SAF) ved National Institute of Immunology (NII). De ble holdt i individuelle ventilerte bur (IVC) og fikk ad libitum-tilgang til forsuret autoklavert vann og mat. De ble opprettholdt ved 21-23 °C og med en lys/mørk syklus på 14 timer.
Nedenfor er en modifisert kirurgisk metode for mikrodisseksjon av et museøye.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetaminophen (Biocetamol)</td>
			<td>EG Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Kit (DEA)</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated analyser</td>
			<td>Tulip, Alto Santracruz, India</td>
			<td>Screen Maaster 3000</td>
			<td>Biochemical analyser for liver functional test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine (Povidon-Iodine Solution)</td>
			<td>Win-Medicare;&#160; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet ( Class I)</td>
			<td>Kartos international; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright Field Microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>LX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBA/J inbred mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No. 000654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime (Taxim)</td>
			<td>AlKem ; India</td>
			<td></td>
			<td>cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Buds</td>
			<td>Pure Swabs Pvt Ltd ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape Sheet</td>
			<td>JSD Surgicals, Delhi, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution, alcoholic</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>HT110132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>Ugo Basile; Italy</td>
			<td>211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Himedia, India</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair removing cream (Veet)</td>
			<td>Reckitt Benckiser , India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Mayer&#39;s</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>MHS16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>RM554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase From Sheep Testes</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>H6254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I.V. Cannula (Plusflon)</td>
			<td>Mediplus, India</td>
			<td>Ref 1732411420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD ; US</td>
			<td>REF 303060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane ( Forane)</td>
			<td>Asecia Queenborough</td>
			<td>No B506</td>
			<td>Inhalation Anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketamax)</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Melonex)</td>
			<td>Intas Pharmaceuticals Ltd; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; 
			curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Histo-Line Laboratories, Italy</td>
			<td>MRS3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Thread</td>
			<td>Mighty ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>GRM 3660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Tears/Eyemist Gel</td>
			<td>Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India</td>
			<td>P3060</td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGOT (ASAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGPT (ALAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryotome E Cryostat</td>
			<td>Thermo Electron Corporation ; US</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade No. 22</td>
			<td>La Medcare, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Board</td>
			<td>Locally made</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical White Tape</td>
			<td>3M India ; India</td>
			<td>1530-1</td>
			<td>Micropore Surgical Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon, Johnson &#38; Johnson, India</td>
			<td>NW 5047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1ml, 26 G)</td>
			<td>Dispo Van; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer (Clipper)</td>
			<td>Philips</td>
			<td>NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Machine</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#39;s E Media</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>AT125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Xylaxin)</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection of the rodent eye

Den okulære mikrodisseksjonen av gnagerøyet involverer segmentering av det enucleated øyebollet med den vedlagte niktiterende membranen, eller tredje øyelokk, for å oppnå de fremre og bakre øyekoppene. Med denne teknikken kan underdelene av øyet, inkludert hornhinnen, nevralvev, retinalpigmentepitelial (RPE) vev og linse, oppnås for helmonteringer, kryoseksjonering og / eller enkeltcellesuspensjoner av et spesifikt okulært vev. Tilstedeværelsen av det tredje øyelokket gir unike og betydelige fordeler, da det fordeler vedlikeholdet av øyets orientering, noe som er viktig for å forstå øyefysiologi etter lokalisert inngrep eller i studier som involverer okulær analyse relatert til øyets romlige topografi.
I denne metoden enucleated vi øyebollet ved stikkontakten sammen med det tredje øyelokket ved forsiktig og sakte å kutte gjennom de ekstraokulære musklene og kutte optisk nerve. Øyeeplet ble gjennomboret gjennom hornhinnen limbus ved hjelp av et mikroblad. Snittet ble brukt som inngangspunkt, noe som gjorde det mulig å kutte langs hornhinnen-skleralkrysset ved å sette inn mikrosaks gjennom snittpunktet. Små og kontinuerlige kutt langs omkretsen ble gjort til koppene skilte seg. Disse kan dissekeres videre ved forsiktig å skrelle det gjennomsiktige laget av nevrale netthinnen ved hjelp av Colibri suturtang for å oppnå nevral retina og RPE-lag. Videre ble det gjort tre/fire ekvivalente kutt fra periferien vinkelrett på synssenteret inntil synsnerven var nådd. Dette åpnet de halvkuleformede koppene i en floretform slik at de falt flatt og lett kunne monteres. Denne teknikken har blitt brukt i vårt laboratorium for hornhinne wholemounts og retinal seksjoner. Tilstedeværelsen av det tredje øyelokket avgrenser nasal-temporal orientering, noe som muliggjør studier av ulike celleterapiintervensjoner etter transplantasjon og dermed den målrettede fysiologiske valideringen som er avgjørende for visualisering og nøyaktig representasjon i slike studier.

En hel mengde rd1 museøye/hornhinnevev ble forberedt for å studere potensiell lymfeangiogenese i fremre/hornhinnevev i syk tilstand. Det vedlagte konjunktivvevet fra det tredje øyelokket virket som en positiv kontroll, siden hornhinnen mangler lymfekar. For studien ble hornhinnen vev dissekert med konjunktivene og ble fiksert med 4% PFA, etterfulgt av permeabilisering og blokkering. Vevet ble deretter farget med et primært antistoff mot lymfatisk endotelmarkør (LYVE1)9. Dette ble etterfulgt a...

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection of the Rodent Eye at JoVE.com

Microdissection of the Rodent Eye

Denne artikkelen presenterer en protokoll for okulær mikrodisseksjon hos gnagere. Prosessen innebærer enukleasjon av øyebollet sammen med niktiterende membran (dvs. det tredje øyelokket). Dette følges deretter av separasjonen av de bakre og fremre øyekoppene.

Mikrodisseksjon av gnagerøyet

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, ...

Okulær forskning i tidligere tider stod for det meste på det okulære vevet fra avdøde individer. Imidlertid har mange oftalmiske gnagermodeller blitt utviklet gjennom årene, og behovet for menneskelig okulært vev har blitt redusert. På grunn av den lille størrelsen og det begrensede operasjonsområdet i gnagerøyet, er den effektive tilgangen til de okulære underdelene sterkt begrenset.Vanligvis, for å operere på en gnager øye, er øyet immobilisert via synsnerven og disseksjonen utføres. Denne praksisen er vanskelig og kan skade det skjøre vevet ettersom det sfæriske øyet fortsetter å bevege seg under disseksjonen. Til tross for å være gunstig for å isolere de forskjellige delene av retinale lag, kan denne teknikken ikke avgrense vevets romlige orientering ved disseksjon av vevet.Videre er en målrettet intervensjon vanskelig å lokalisere postdisseksjon på grunn av den homogene cellulære monteringen av bakre og fremre øyekopp. I denne videoen demonstreres en modifisert kirurgisk metode for mikrodisseksjon. Tilstedeværelsen av den vedlagte niktiterende membranen, eller det tredje øyelokket, gir unike og betydelige fordeler.I denne metoden blir øyebollet først enucleated med det tredje øyelokket, deretter brukes det tredje øyelokket til å immobilisere øyet. Det etterfølges av piercing øyebollet gjennom hornhinnen limbus, og snittet brukes som inngangspunkt. Deretter, ved å kutte langs omkretsen, skilles fremre og bakre øyekopper.Ved å dissekere den bakre øyekoppen ytterligere, identifiseres det gjennomsiktige laget av nevrale netthinnen og skrelles forsiktig av. De nevrale og RPE-lagene oppnås dermed for videre behandling. Det tredje øyelokket vil gjøre det mulig for oss å avgrense den romlige orienteringen til øyet etter enukleasjon.La oss nå følge detaljert trinnvis prosedyre. Utvid gnagerøynene ved hjelp av en dråpe på 0,8% tropikamid og 5% fenylefrin oftalmiske løsninger og legg dyret i et mørkt område i 30 minutter før prosedyren. Avlive dyret ved intraperitonealt administrering av fem ganger doser anestesi.En typisk dose er 200 mikroliter PBS inneholdende 10 mg ketamin og en mg xylazin. Bekreft fullstendig mangel på respons på stimulans ved å undersøke pedalrefleksen. Plasser musen i lateral liggende for å gi full tilgang til øyet.Hold en Colibri suturtang, en buet tang, et mikroblad 15 grader tre millimeter størrelse, vårmikrosaks og en vinklet fjærmikrosaks klar for prosedyren. Plasser en buet tang rundt øyebollet og klem for å frigjøre øyet fra fremmede vedlegg. Det tredje øyelokket, også kjent som niktiteringsmembranen, ligger mot det øvre hjørnet av nesetangenten og kan identifiseres som en mindre gjennomsiktig fremspring med pigmenterte grenser.Deretter bruker du en vårmikrosaks og kutter rundt øyebollet. Små, kontinuerlige kutt frigjør øyebollet fra sklerale vedlegg. Plasser en buet fjærmikrosaks under øyebollet for å frigjøre øyet ved å kutte optisk nerve.Plasser det nukleerte øyet i en petriskål som inneholder PBS-buffer slik at øyeeplet er nedsenket i PBS. Noen ekstraokulære muskler eller vev vil begynne å flyte bort fra øyebollet. Fjern dem ved å kutte dem av øyebollet ved hjelp av vårens mikrosaks.Fjern deretter optisk nerve fra bunnen av øyebollet for å tillate bedre separasjon av retina for helmonterte preparater. Det er ikke nødvendig å fjerne optisk nerve for vevsseksjonering. Overfør øyebollet til et 1,5 ml rør inneholdende en ml 4% paraformaldehyd eller PFA.Hold det i to timer ved fire grader Celsius for vevfiksering. Det er mulig å ta en pause på dette trinnet ved å la vevet ligge i PFA i opptil 12 timer ved fire grader Celsius. For isolering av levende celler bør imidlertid ikke fikseringstrinnene utføres, og hele prosedyren må utføres i kontinuum.Etter PFA-fiksering, overfør øyebollet til en petriskål som inneholder PBS og legg det under et dissekerende mikroskop for å utføre den påfølgende prosedyren. Immobiliser øyeeplet ved å holde det tredje øyelokket godt nede med Colibri suturtang. Limbus er hornhinnen scleral krysset.Lag et lite snitt på limbus ved å stikke hull på det ved hjelp av et mikroblad. Snittet gjøres fortrinnsvis overfor det tredje øyelokket. Deretter bruker du dette snittet som utgangspunkt, med mikrosaksen, gjør små og kontinuerlige kutt langs denne hornhinnen skleral limbusomkrets.Først fullfører du en halvcirkel med kutt fra snittpunktet til det tredje øyelokket. Fullfør deretter den gjenværende halvcirkelen av kutt på den andre siden. Til slutt, gjør et kutt rundt det tredje øyelokket for å skille bakre og fremre kopp.Fjern linsen fra den bakre koppen ved hjelp av tang for å oppnå den bakre koppen som består av nevrale retina og RPE-lag og hornhinnen fremre kopp. Hvis du arbeider med ufiksert vev, kan de fremre og bakre koppene nå fordøyes enzymatisk for å oppnå hornhinne eller retinal enkeltcellesuspensjon. For å fikse vevet, overfør disse koppene til et 1,5 ml rør inneholdende 1 ml 4% PFA i 12 timer ved fire grader Celsius.Etter fiksering kan vevet være innebygd i passende medium, og kryoseksjonering eller parafinseksjonering kan gjøres for å oppnå hornhinne- eller retinalseksjoner. Sett den bakre koppen tilbake i petriskålen som inneholder PBS-buffer. Et ugjennomsiktig lag på det pigmenterte RPE-laget er nevrale netthinnen.Fjern den nevrale netthinnen med en ny tang. En veldig forsiktig og liten bevegelse av hånden anbefales på det sterkeste for ikke å skade vevet. Ved optisk nerve, utgang, kan den buede fjærsaksen settes inn under nevrale netthinnen, og et kutt kan gjøres for å frigjøre lagene helt hvis nevrale retina forblir festet.Netthinnen kan også frigjøres eller løsnes ved å stryke den forsiktig med en myk børste. Gjeninnfør de fremre og bakre koppene i petriskålen som inneholder PBS-buffer. Bruk en vinklet fjærmikrosaks for å lage et kutt ved siden av det tredje øyelokket fra periferien vinkelrett mot det optiske senteret.Oppretthold et grep om det tredje øyelokket og gjør et kutt ved siden av det første kuttet. Lag et lignende kutt mellom det andre kuttet og det tredje øyelokket. Tre eller fire slike like fjerne kutt åpner halvkuleformede kopper i en blomsterform, som faller flatt og lett kan monteres.Ikke gjør veldig dype kutt før midten av koppen, da dette kan gjøre at bladseksjonene faller fra hverandre eller skiller seg lett. Det flytende mediet gjør at den fremre øyekoppen kan oppnå en buet struktur. Følg de samme trinnene som gitt for å gjøre kutt på bakre kopp for å gjøre tre eller fire like langt kutt på den fremre koppen.Vevet er nå klart for videre farging. I denne figuren er helemonteringen av fremre kopp vist. Hornhinnevevet ble mikrodissekert som beskrevet for å avdekke lymfekarene i det vedlagte konjunktivvevet i hornhinnebladet.I denne figuren vises hele monteringen av nevrale netthinnen. Netthinnevaskulaturen i den nevrale netthinnen ble farget med isolektin og er synlig som grønne kar. I denne metoden oppnås musens enucleated eyeball med det vedlagte tredje øyelokket for effektiv og enkel håndtering.Det tredje øyelokket immobiliserer øyebollet helt og lar disseksjonen fortsette med enkle og minimale feil. Denne metoden er fordelaktig for okulær vevsspesifikk seksjonering, enkeltcelleanalyse og helheter. Imidlertid gjør behovet for repeterende vevsfiksering vevet unviable for cellekultur eller slike levende cellebehov.Derfor må prosedyren utføres i kontinuum for isolasjon av levende celler.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Medicine

Unit 1

The Special Senses

SCIENTISTS IN ACTION

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Forbedret protokoll For Laser mikrodisseksjon Of Human bukspyttkjertelen holmer Fra Kirurgiske prøver

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

Laser-fangst mikrodisseksjon of Human prostata Epitel for RNA-analyse

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Kvantitativ Fundus autofluorescence for Evaluering av retinal sykdommer

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy (rNAION)

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy rNAION

Den gnager Model of Nonarteritic iskemisk fremre optikusnevropati (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Fluorescerende fargemerking av erytrocytter og leukocytter for å studere strømdynamikken i musens retinalsirkulasjon

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

Punktering-indusert Iris Neovascularization som en musemodell av Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Romlig kvantifisering av narkotika i lunge tuberkulose lesjoner av Laser fange Microdissection væske kromatografi massespektrometri (MFM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Karakterisering av en ny human organotypisk retinal kulturteknikk

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy

Anvendelse av optisk koherenstomografi til en musemodell av retinopati

Optical coherence tomography (OCT) offers a noninvasive method for the diagnosis of retinopathy. The OCT machine can capture retinal crosssectional images ...