Name: microdissection of the rodent eye
Uploaded: 2023-04-21T12:30:00
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A Dra. Alaknanda Mishra, Departamento de Biologia Celular e Anatomia Humana, Universidade da Califórnia em Davis, EUA, nos treinou neste método no Instituto Nacional de Imunologia, Nova Delhi. Este trabalho foi apoiado pela subvenção principal recebida do Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia para o Instituto Nacional de Imunologia, Nova Deli. P.S. recebeu uma bolsa de pesquisa do Departamento de Biotecnologia.

Este procedimento foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal Institucional do Instituto Nacional de Imunologia, Nova Delhi. O número de referência de série da homologação é IAEC#480/18. Os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes de regulamentação do Comitê de Controle e Supervisão de Experimentos em Animais, Ministério das Pescas, Pecuária e Laticínios, Governo da Índia, sob a supervisão de um Veterinário profissional no SAF, NII.
1. Preparação</strong...

<ol>
	<li>Choi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cancer+immunotherapy+using+patient-derived+xenografts+(PDXs)+in+humanized+mice.">Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice.</a> Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li><li>Sutherland, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+of+Highly+Pure+Trabecular+Meshwork+from+Mouse+Eyes+for+Gene+Expression+Analysis.">Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis.</a> J Vis Exp. (136), e57576 (2018).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Claybon, A., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+mouse+eye+for+a+whole+mount+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2563 (2011).</li><li>Steven, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+induction+and+three-dimensional+two-photon+imaging+of+conjunctiva-associated+lymphoid+tissue.">Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).</li><li>Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+wholemount+technique:+A+window+to+understanding+the+brain+and+behaviour.">The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour.</a> Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).</li><li>Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatics+and+lymphangiogenesis+in+the+eye.">Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye.</a> Journal of Ophthalmology. 2012, 783163 (2012).</li><li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood-derived+monocytes+show+neuronal+properties+and+integration+in+immune-deficient+rd1+mouse+model+upon+phenotypic+differentiation+and+induction+with+retinal+growth+factors.">Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412 (2020).</li></ol>

A microdissecção ocular tem sido considerada uma tarefa difícil devido ao pequeno tamanho e forma esférica do olho do roedor, e o olho do roedor requer técnicas inovadoras para o manuseio eficiente8. 
No método demonstrado atualmente, o globo ocular de rato enucleado é obtido com a terceira pálpebra presa para um manuseio eficaz e fácil. Usando a terceira pálpebra, o globo ocular pode ser imobilizado completamente, o que permite que a dissecção prossiga com ...

A dissecção ocular é uma técnica importante na pesquisa oftálmica e tem permitido que os investigadores acessem os segmentos do olho para estudos direcionados. Anteriormente, os pesquisadores oculares confiavam no tecido ocular de indivíduos doentes para seus estudos. No entanto, o número progressivamente crescente de cepas de roedores oftálmicos modelos1 ao longo dos anos diminuiu a necessidade de tecido ocular humano. Essas cepas de camundongos permitiram uma compreensão mais profunda das doenças oculares e intervenções. No entanto, eles também geraram a necessidade de técnicas inovadoras de microdissecção ocular. O pequeno tamanho e a área limitada de operação restringem severamente o acesso efetivo às subpartes oculares. Além disso, devido à montagem celular homogênea dos copos oculares posterior e anterior, é difícil realizar intervenções direcionadas pós-dissecção. As técnicas atuais de microdissecção do laser2 e da microdissecção cirúrgica 3,4 são inadequadas para atender a tais exigências da pesquisa ocular. A microdissecção a laser é muito eficaz na análise de célula única, mas o tecido específico precisa ser microdissecado antes do procedimento a laser2. A técnica pode isolar pequenas regiões de interesse de um tecido pré-dissecado para análise molecular. Assim, a técnica não é adequada para a preparação de montagens inteiras ou para o isolamento de camadas oculares axialmente compactadas para uma visualização ideal.
O método cirúrgico é a técnica mais utilizada; este método envolve imobilizar o olho através do nervo óptico5 e, em seguida, realizar a dissecção. Esta prática é árdua e pode danificar qualquer tecido frágil, pois o olho esférico continua a se mover durante a dissecção. Apesar de ser benéfica para isolar as várias seções das camadas da retina, a técnica não pode demarcar a orientação espacial do tecido após a dissecção.
Durante a dissecção, a manutenção da presença da membrana nictitante aderida ou da terceira pálpebra (Figura 1) apresenta vantagens únicas e significativas. Neste método, primeiro, o globo ocular é enucleado com a terceira pálpebra. Em seguida, a terceira pálpebra é utilizada para imobilizar o olho6 (Figura 2A). Segue-se a perfuração do globo ocular através do limbo corneano e a incisão como ponto de entrada (Figura 2B,C). Em seguida, os óculos são separados por corte ao longo da circunferência anterior e posteriormente (Figura 2D-G). Ao dissecar ainda mais o óculo posterior, a camada translúcida da retina neural pode ser identificada e suavemente descascada. Em seguida, são feitos três ou quatro cortes equidistantes nos copos hemisféricos anterior e posterior obtidos, que permitem que esses copos em forma de flor caiam sobre uma lâmina (Figura 2H).
A terceira pálpebra auxilia no manuseio fácil e eficiente durante a dissecção, garantindo assim danos mínimos ao tecido ao acessar as várias camadas oculares e ao produzir montagens inteiras. Além disso, a presença da terceira pálpebra ajuda a localizar e examinar intervenções localizadas durante a visualização.
O procedimento, em nosso laboratório, foi realizado em uma cepa de camundongo CBA/J ou rd1 em P28 de qualquer sexo. O procedimento pode ser realizado em qualquer cepa, idade ou sexo do animal e não tem viés de acordo com essas características.
Os animais foram adquiridos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais) e mantidos no Small Animal Facility (SAF) do Instituto Nacional de Imunologia (NII). Eles foram mantidos em gaiolas ventiladas individuais (VCI) e receberam acesso ad libitum a água e alimentos autoclavados acidificados. Foram mantidos a 21-23 °C e com ciclo claro/escuro de 14 h/10 h.
Dado abaixo é um método cirúrgico modificado para a micro-dissecção de um olho de rato.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetaminophen (Biocetamol)</td>
			<td>EG Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Kit (DEA)</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated analyser</td>
			<td>Tulip, Alto Santracruz, India</td>
			<td>Screen Maaster 3000</td>
			<td>Biochemical analyser for liver functional test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine (Povidon-Iodine Solution)</td>
			<td>Win-Medicare;&#160; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet ( Class I)</td>
			<td>Kartos international; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright Field Microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>LX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBA/J inbred mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No. 000654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime (Taxim)</td>
			<td>AlKem ; India</td>
			<td></td>
			<td>cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Buds</td>
			<td>Pure Swabs Pvt Ltd ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape Sheet</td>
			<td>JSD Surgicals, Delhi, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution, alcoholic</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>HT110132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>Ugo Basile; Italy</td>
			<td>211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Himedia, India</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair removing cream (Veet)</td>
			<td>Reckitt Benckiser , India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Mayer&#39;s</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>MHS16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>RM554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase From Sheep Testes</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>H6254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I.V. Cannula (Plusflon)</td>
			<td>Mediplus, India</td>
			<td>Ref 1732411420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD ; US</td>
			<td>REF 303060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane ( Forane)</td>
			<td>Asecia Queenborough</td>
			<td>No B506</td>
			<td>Inhalation Anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketamax)</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Melonex)</td>
			<td>Intas Pharmaceuticals Ltd; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; 
			curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Histo-Line Laboratories, Italy</td>
			<td>MRS3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Thread</td>
			<td>Mighty ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>GRM 3660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Tears/Eyemist Gel</td>
			<td>Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India</td>
			<td>P3060</td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGOT (ASAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGPT (ALAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryotome E Cryostat</td>
			<td>Thermo Electron Corporation ; US</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade No. 22</td>
			<td>La Medcare, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Board</td>
			<td>Locally made</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical White Tape</td>
			<td>3M India ; India</td>
			<td>1530-1</td>
			<td>Micropore Surgical Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon, Johnson &#38; Johnson, India</td>
			<td>NW 5047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1ml, 26 G)</td>
			<td>Dispo Van; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer (Clipper)</td>
			<td>Philips</td>
			<td>NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Machine</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#39;s E Media</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>AT125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Xylaxin)</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection of the rodent eye

A microdissecção ocular do olho de roedor envolve a segmentação do globo ocular enucleado com a membrana nictitante anexada, ou terceira pálpebra, para obter os óculos anterior e posterior. Com esta técnica, as subpartes do olho, incluindo o tecido da córnea, tecido neural, tecido epitelial pigmentar da retina (PSE) e lente, podem ser obtidas para montagens inteiras, crio-seccionamento e / ou suspensões unicelulares de um tecido ocular específico. A presença da terceira pálpebra apresenta vantagens únicas e significativas, pois beneficia a manutenção da orientação do olho, o que é importante para a compreensão da fisiologia ocular após qualquer intervenção localizada ou em estudos envolvendo análise ocular relacionada à topografia espacial do olho.
Neste método, enucleamos o globo ocular na órbita juntamente com a terceira pálpebra, cortando cuidadosa e lentamente os músculos extraoculares e cortando o nervo óptico. O globo ocular foi perfurado através do limbo corneano usando uma microlâmina. A incisão foi utilizada como ponto de entrada, permitindo o corte ao longo da junção córnea-escleral por meio da inserção de microtesouras através do ponto de incisão. Pequenos e contínuos cortes ao longo da circunferência foram feitos até que os copos se separassem. Estes poderiam ser ainda mais dissecados descascando suavemente a camada translúcida da retina neural usando pinça de sutura de Colibri para obter as camadas de retina neural e RPE. Além disso, três/quatro cortes equidistantes foram feitos da periferia perpendicularmente ao centro óptico até que o nervo óptico fosse atingido. Isso abriu os copos hemisféricos em forma de flor para que eles caíssem e pudessem ser facilmente montados. Esta técnica tem sido usada em nosso laboratório para montagens inteiras da córnea e seções da retina. A presença da terceira pálpebra delineia a orientação nasal-temporal, o que permite o estudo de diversas intervenções de terapia celular pós-transplante e, assim, a validação fisiológica direcionada vital para visualização e representação precisa em tais estudos.

Uma montagem inteira de tecido olho/córnea de camundongo rd1 foi preparada para estudar a potencial linfangiogênese no tecido anterior/corneano em um estado doente. O tecido conjuntival aderido da terceira pálpebra atuou como um controle positivo, uma vez que a córnea carece de vasos linfáticos. Para o estudo, o tecido corneano foi dissecado com a conjuntiva e fixado com PFA a 4%, seguido de permeabilização e bloqueio. O tecido foi então corado com um anticorpo primário contra o marcador endotelial linfático (L...

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Microdissection of the Rodent Eye

Este trabalho apresenta um protocolo para microdissecção ocular em roedores. O processo envolve a enucleação do globo ocular junto com a membrana nictitante (ou seja, a terceira pálpebra). Isto é seguido pela separação dos copos oculares posterior e anterior.

Microdissecção do olho de roedores

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, ...

A pesquisa ocular nos primeiros tempos dependia principalmente do tecido ocular de indivíduos falecidos. No entanto, ao longo dos anos, muitos modelos oftálmicos de roedores foram desenvolvidos e a necessidade de tecido ocular humano diminuiu. Devido ao pequeno tamanho e à área limitada de operações no olho do roedor, o acesso efetivo às subpartes oculares é severamente restrito.Normalmente, para operar o olho de um roedor, o olho é imobilizado através do nervo óptico e a dissecção é realizada. Esta prática é árdua e pode danificar o tecido frágil à medida que o olho esférico continua a se mover durante a dissecção. Apesar de ser benéfica no isolamento das várias seções das camadas da retina, esta técnica não pode demarcar a orientação espacial do tecido após a dissecção do tecido.Além disso, uma intervenção direcionada é difícil de localizar após a dissecção devido à montagem celular homogênea do copo ocular posterior e anterior. Neste vídeo, um método cirúrgico modificado para microdissecção é demonstrado. A presença da membrana nictitante anexada, ou a terceira pálpebra, apresenta vantagens únicas e significativas.Neste método, primeiro o globo ocular é enucleado com a terceira pálpebra, em seguida, a terceira pálpebra é usada para imobilizar o olho. É seguido por piercing do globo ocular através do limbo da córnea, e a incisão é usada como ponto de entrada. Em seguida, cortando ao longo da circunferência, os copos oculares anterior e posterior são separados.Ao dissecar ainda mais o copo ocular posterior, a camada translúcida da retina neural é identificada e suavemente descascada. As camadas neurais e RPE são assim obtidas para processamento posterior. A terceira pálpebra nos permitirá demarcar a orientação espacial do olho pós-enucleação.Vamos agora seguir o procedimento passo-a-passo detalhado. Dilate os olhos dos roedores usando uma gota de soluções oftálmicas de 0,8% de tropicamida e 5% de fenilefrina e coloque o animal em uma área escura por 30 minutos antes do procedimento. Eutanasiar o animal administrando por via intraperitoneal cinco vezes doses de anestesia.Uma dose típica é de 200 microlitros PBS contendo 10 mg de cetamina e um mg de xilazina. Confirme a completa falta de resposta ao estímulo examinando o reflexo do pedal. Coloque o rato em decúbito lateral para permitir o acesso completo ao olho.Mantenha uma pinça de sutura Colibri, uma pinça curva, uma microlâmina de 15 graus de tamanho de três milímetros, microtesoura de mola e uma microtesoura de mola angular pronta para o procedimento. Coloque uma pinça curva ao redor do globo ocular e aperte para libertar o olho de anexos estranhos. A terceira pálpebra, também conhecida como membrana nictitante, está localizada no canto superior da tangente nasal e pode ser identificada como uma protuberância translúcida menor com limites pigmentados.Em seguida, use uma microtesoura de mola e corte ao redor do globo ocular. Cortes pequenos e contínuos liberam o globo ocular dos anexos esclerais. Coloque uma microtesoura de mola curva sob o globo ocular para liberar o olho, cortando o nervo óptico.Coloque o olho enucleado em uma placa de Petri contendo tampão PBS de tal forma que o globo ocular esteja submerso em PBS. Alguns músculos ou tecidos extraoculares começarão a flutuar para longe do globo ocular. Removê-los, cortando-os do globo ocular usando micro-tesouras de mola.Em seguida, remova o nervo óptico da base do globo ocular para permitir uma melhor separação da retina para preparações completas. Não é necessário remover o nervo óptico para a secção do tecido. Transfira o globo ocular para um tubo de 1,5 ml contendo um ml de paraformaldeído a 4% ou PFA.Mantenha-o por duas horas a quatro graus Celsius para fixação do tecido. É possível fazer uma pausa nesta etapa, deixando o tecido em PFA por até 12 horas a quatro graus Celsius. No entanto, para o isolamento de células vivas, as etapas de fixação não devem ser realizadas e todo o procedimento precisa ser realizado em contínuo.Após a fixação do PFA, transfira o globo ocular para uma placa de Petri contendo PBS e coloque-o sob um microscópio de dissecação para realizar o procedimento subsequente. Imobilize o globo ocular segurando a terceira pálpebra firmemente com pinça de sutura de Colibri. O limbo é a junção escleral da córnea.Faça uma pequena incisão no limbo, perfurando-o usando uma microlâmina. A incisão é feita preferencialmente oposta à terceira pálpebra. Em seguida, usando esta incisão como ponto de partida, com a microtesoura fazer pequenos e contínuos cortes ao longo desta circunferência do limbo escleral corneano.Primeiro, complete um semicírculo de cortes a partir do ponto de incisão até a terceira pálpebra. Em seguida, complete o semicírculo restante de cortes do outro lado. Finalmente, faça um corte ao redor da terceira pálpebra para separar o copo posterior e o anterior.Remova o cristalino do copo posterior usando fórceps para obter o copo posterior composto pela retina neural e camada de EPR e o copo anterior da córnea. Se trabalhar com tecidos não fixos, os copos anterior e posterior agora podem ser digeridos enzimaticamente para obter suspensão unicelular da córnea ou da retina. Para fixar os tecidos, transfira esses copos para um tubo de 1,5 ml contendo 1 ml de PFA a 4% por 12 horas a quatro graus Celsius.Após a fixação, o tecido pode ser incorporado em meio apropriado e criossecção ou seccionamento de parafina pode ser feito para obter cortes de córnea ou retina. Reintroduza o copo posterior na placa de Petri contendo tampão PBS. Uma camada opaca na camada de PSE pigmentada é a retina neural.Descasque a retina neural usando uma segunda pinça. Um movimento muito suave e leve da mão é altamente recomendado para não danificar o tecido. Na saída do nervo óptico, a tesoura de mola curva pode ser inserida sob a retina neural, e um corte pode ser feito para liberar completamente as camadas se a retina neural permanecer ligada.A retina também pode ser liberada ou destacada, acariciando-a suavemente com uma escova macia. Reintroduzir os copos anterior e posterior na placa de Petri contendo tampão PBS. Use uma mola angular micro-tesoura para fazer um corte ao lado da terceira pálpebra da periferia perpendicularmente em direção ao centro óptico.Mantenha um aperto da terceira pálpebra e faça um corte ao lado do primeiro corte. Faça um corte semelhante entre o segundo corte e a terceira pálpebra. Três ou quatro desses cortes equidistantes abrem os copos hemisféricos em forma de flor, que cai plana e pode ser facilmente montada.Não faça cortes muito profundos até o centro do copo, pois isso pode fazer com que as seções das folhas se desintegrem ou se separem facilmente. O meio líquido permite que o copo do olho anterior atinja uma estrutura curva. Siga os mesmos passos dados para fazer cortes no copo posterior para fazer três ou quatro cortes equidistantes no copo anterior.Os tecidos estão agora prontos para novas colorações. Nesta figura, todo o monte de copo anterior é mostrado. O tecido corneano foi microdissecado conforme descrito para revelar os vasos linfáticos no tecido conjuntival anexado do folheto corneano.Nesta figura, todo o monte de retina neural é mostrado. A vasculatura retiniana da retina neural foi corada com isopectina e é visível como vasos verdes. Neste método, o globo ocular enucleado dos ratos é obtido com a terceira pálpebra anexada para um manuseio eficaz e fácil.A terceira pálpebra imobiliza completamente o globo ocular e permite que a dissecção prossiga com facilidade e erros mínimos. Este método é vantajoso para seccionamento específico de tecido ocular, análise de célula única e montagens inteiras. No entanto, a necessidade de fixação tecidual repetitiva torna o tecido inviável para a cultura de células ou tais necessidades de células vivas.Assim, o procedimento precisa ser realizado em continuum para o isolamento de células vivas.

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Etiquetagem de corantes fluorescentes de eritrócitos e leucócitos para estudar a dinâmica do fluxo na circulação da retina do mouse

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

Induzida por punção neovascularização de Iris como um modelo do rato da Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Spatial quantificação de drogas em lesões de tuberculose pulmonar por Laser capturar Microdissection líquido cromatografia de espectrometria de massa (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Caracterização de uma nova técnica de cultura de retina organotipípica humana

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy

Aplicação da Tomografia de Coerência Óptica a um Modelo de Retinopatia de Rato

Optical coherence tomography (OCT) offers a noninvasive method for the diagnosis of retinopathy. The OCT machine can capture retinal crosssectional images ...