Name: microdissection of the rodent eye
Uploaded: 2023-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection of the Rodent Eye at JoVE.com

Доктор Алакнанда Мишра, кафедра клеточной биологии и анатомии человека, Калифорнийский университет в Дэвисе, США, обучила нас этому методу в Национальном институте иммунологии в Нью-Дели. Эта работа была поддержана основным грантом, полученным от Департамента биотехнологии правительства Индии Национальному институту иммунологии в Нью-Дели. P.S. получил научную стипендию от Департамента биотехнологии.

Эта процедура была одобрена Институциональным комитетом по этике животных Национального института иммунологии в Нью-Дели. Серийный номер официального утверждения - IAEC#480/18. Эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по контролю и надзору за эксперимен...

<ol>
	<li>Choi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cancer+immunotherapy+using+patient-derived+xenografts+(PDXs)+in+humanized+mice.">Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice.</a> Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li><li>Sutherland, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+of+Highly+Pure+Trabecular+Meshwork+from+Mouse+Eyes+for+Gene+Expression+Analysis.">Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis.</a> J Vis Exp. (136), e57576 (2018).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Claybon, A., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+mouse+eye+for+a+whole+mount+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2563 (2011).</li><li>Steven, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+induction+and+three-dimensional+two-photon+imaging+of+conjunctiva-associated+lymphoid+tissue.">Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).</li><li>Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+wholemount+technique:+A+window+to+understanding+the+brain+and+behaviour.">The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour.</a> Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).</li><li>Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatics+and+lymphangiogenesis+in+the+eye.">Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye.</a> Journal of Ophthalmology. 2012, 783163 (2012).</li><li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood-derived+monocytes+show+neuronal+properties+and+integration+in+immune-deficient+rd1+mouse+model+upon+phenotypic+differentiation+and+induction+with+retinal+growth+factors.">Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412 (2020).</li></ol>

Было обнаружено, что микродиссекция глаза глаза является сложной задачей из-за небольшого размера и сферической формы глаза грызуна, а глаз грызуна требует инновационных методов для эффективного обращения8. 
В демонстрируемом способе энуклеированное глазн...

Вскрытие глаза является важным методом в офтальмологических исследованиях и позволило исследователям получить доступ к сегментам глаза для целевых исследований. Ранее офтальмологи полагались на глазную ткань больных людей для своих исследований. Однако постепенно растущее число штаммов офтальмологических моделей грызунов1 с годами уменьшило потребность в глазной ткани человека. Эти штаммы мышей позволили глубже понять глазные заболевания и вмешательства. Тем не менее, они также породили потребность в инновационных методах микродиссекции глаза. Малый размер и ограниченная область операции серьезно ограничивают эффективный доступ к подразделению глаза. Кроме того, из-за однородной клеточной сборки задних и передних глазных чашек трудно проводить целенаправленные вмешательства после рассечения. Современные методы микродиссекции лазера2 и хирургической микродиссекции 3,4 недостаточны для удовлетворения таких требований глазных исследований. Лазерная микродиссекция очень эффективна при анализе отдельных клеток, но конкретная ткань должна быть микрорассечена перед лазерной процедурой2. Этот метод может изолировать небольшие области, представляющие интерес, из предварительно рассеченной ткани для молекулярного анализа. Таким образом, этот метод не подходит для подготовки цельных креплений или для изоляции окулярных слоев в осевой части для оптимальной визуализации.
Хирургический метод является наиболее широко используемым методом; Этот метод включает в себя иммобилизацию глаза через зрительный нерв5 с последующим вскрытием. Эта практика трудна и может повредить любую хрупкую ткань, так как сферический глаз продолжает двигаться во время рассечения. Несмотря на то, что он полезен для изоляции различных участков слоев сетчатки, этот метод не может разграничить пространственную ориентацию ткани при рассечении.
Во время диссекции сохранение присутствия прикрепленной мигательной мембраны или третьего века (рис. 1) представляет собой уникальные и значительные преимущества. В этом методе сначала глазное яблоко энуклеируется третьим веком. Затем третье веко используется для иммобилизации глаза6 (рис. 2А). Затем следует прокалывание глазного яблока через лимб роговицы и использование разреза в качестве точки входа (рис. 2B, C). Затем наглазники разделяют, разрезая по окружности спереди и сзади (рис. 2D-G). Рассекая заднюю чашку глаза, можно идентифицировать полупрозрачный слой нервной сетчатки и аккуратно отслаивать. Затем в полученных полусферических передних и задних чашечках делаются три или четыре равноудаленных разреза, которые позволяют этим чашечкам в форме цветка падать плашмя на предметное стекло (рис. 2H).
Третье веко способствует простому и эффективному обращению во время рассечения, тем самым обеспечивая минимальное повреждение тканей при доступе к различным глазным слоям и при производстве цельных креплений. Кроме того, наличие третьего века помогает обнаружить и изучить локализованные вмешательства во время визуализации.
Процедура в нашей лаборатории была выполнена на штамме мыши CBA / J или rd1 на P28 любого пола. Процедура может быть выполнена на любом штамме, возрасте или поле животного и не имеет смещения в соответствии с этими характеристиками.
Животные были закуплены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов) и содержались в Центре мелких животных (SAF) в Национальном институте иммунологии (NII). Они содержались в индивидуальных вентилируемых клетках (IVC) и получали свободный доступ к подкисленной автоклавной воде и пище. Они поддерживались при температуре 21-23 °C и с циклом светлый/темный 14 ч / 10 ч.
Ниже приведен модифицированный хирургический метод микрорассечения мышиного глаза.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetaminophen (Biocetamol)</td>
			<td>EG Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Kit (DEA)</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated analyser</td>
			<td>Tulip, Alto Santracruz, India</td>
			<td>Screen Maaster 3000</td>
			<td>Biochemical analyser for liver functional test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine (Povidon-Iodine Solution)</td>
			<td>Win-Medicare;&#160; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet ( Class I)</td>
			<td>Kartos international; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright Field Microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>LX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBA/J inbred mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No. 000654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime (Taxim)</td>
			<td>AlKem ; India</td>
			<td></td>
			<td>cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Buds</td>
			<td>Pure Swabs Pvt Ltd ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape Sheet</td>
			<td>JSD Surgicals, Delhi, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution, alcoholic</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>HT110132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>Ugo Basile; Italy</td>
			<td>211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Himedia, India</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair removing cream (Veet)</td>
			<td>Reckitt Benckiser , India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Mayer&#39;s</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>MHS16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>RM554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase From Sheep Testes</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>H6254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I.V. Cannula (Plusflon)</td>
			<td>Mediplus, India</td>
			<td>Ref 1732411420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD ; US</td>
			<td>REF 303060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane ( Forane)</td>
			<td>Asecia Queenborough</td>
			<td>No B506</td>
			<td>Inhalation Anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketamax)</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Melonex)</td>
			<td>Intas Pharmaceuticals Ltd; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; 
			curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Histo-Line Laboratories, Italy</td>
			<td>MRS3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Thread</td>
			<td>Mighty ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>GRM 3660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Tears/Eyemist Gel</td>
			<td>Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India</td>
			<td>P3060</td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGOT (ASAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGPT (ALAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryotome E Cryostat</td>
			<td>Thermo Electron Corporation ; US</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade No. 22</td>
			<td>La Medcare, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Board</td>
			<td>Locally made</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical White Tape</td>
			<td>3M India ; India</td>
			<td>1530-1</td>
			<td>Micropore Surgical Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon, Johnson &#38; Johnson, India</td>
			<td>NW 5047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1ml, 26 G)</td>
			<td>Dispo Van; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer (Clipper)</td>
			<td>Philips</td>
			<td>NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Machine</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#39;s E Media</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>AT125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Xylaxin)</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection of the rodent eye

Глазное микрорассечение глаза грызуна включает сегментацию энуклеированного глазного яблока с прикрепленной мигательной мембраной или третьим веком для получения переднего и заднего наглазников. С помощью этого метода подчасти глаза, включая ткань роговицы, нервную ткань, ткань пигментного эпителия сетчатки (RPE) и хрусталик, могут быть получены для цельных суспензий, криосекций и/или одноклеточных суспензий конкретной ткани глаза. Наличие третьего века представляет собой уникальные и значительные преимущества, поскольку оно способствует поддержанию ориентации глаза, что важно для понимания физиологии глаза после любого локализованного вмешательства или в исследованиях, включающих глазной анализ, связанный с пространственной топографией глаза.
В этом методе мы энуклеировали глазное яблоко в глазнице вместе с третьим веком, осторожно и медленно разрезая экстраокулярные мышцы и разрывая зрительный нерв. Глазное яблоко было проткнуто через лимб роговицы с помощью микролезвия. Разрез был использован в качестве точки входа, что позволило разрезать вдоль роговицы-склерального соединения путем введения микроножниц через точку разреза. Небольшие и непрерывные надрезы по окружности делались до тех пор, пока чашечки не разошлись. Они могут быть дополнительно рассечены путем осторожного отслаивания полупрозрачного слоя нервной сетчатки с помощью щипцов для наложения швов Colibri для получения слоев нервной сетчатки и RPE. Далее от периферии перпендикулярно к зрительному центру делали три/четыре равноудаленных разреза до тех пор, пока не был достигнут зрительный нерв. Это открыло полусферические чашечки в форме цветка, так что они упали плашмя и могли быть легко установлены. Этот метод был использован в нашей лаборатории для целых срезов роговицы и сетчатки. Наличие третьего века очерчивает носово-временную ориентацию, что позволяет изучать различные вмешательства клеточной терапии после трансплантации и, таким образом, целенаправленную физиологическую валидацию, жизненно важную для визуализации и точного представления в таких исследованиях.

Для изучения потенциального лимфатического ангиогенеза в ткани переднего / роговицы мышей rd1 был подготовлен целый массив ткани мыши/роговицы мышей в болезненном состоянии. Прикрепленная конъюнктивальная ткань от третьего века действовала как положительный контроль, так как в рогови...

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection of the Rodent Eye at JoVE.com

Microdissection of the Rodent Eye

В данной работе представлен протокол микродиссекции глаза у грызунов. Процесс включает энуклеацию глазного яблока вместе с мигательной мембраной (т.е. третьим веком). Затем следует разделение заднего и переднего наглазников.

Микродиссекция глаза грызуна

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, ...

Офтальмологические исследования в прежние времена в основном основывались на глазной ткани умерших людей. Однако за прошедшие годы было разработано множество офтальмологических моделей грызунов, и потребность в глазной ткани человека уменьшилась. Из-за небольшого размера и ограниченной площади операций в глазу грызуна эффективный доступ к подразделению глаза сильно ограничен.Как правило, чтобы прооперировать глаз грызуна, глаз иммобилизуют через зрительный нерв и проводят рассечение. Эта практика трудна и может повредить хрупкую ткань, поскольку сферический глаз продолжает двигаться во время рассечения. Несмотря на то, что он полезен для изоляции различных участков слоев сетчатки, этот метод не может разграничить пространственную ориентацию ткани при рассечении ткани.Кроме того, целенаправленное вмешательство трудно обнаружить после рассечения из-за однородной клеточной сборки задней и передней глазной чашечки. В этом видео демонстрируется модифицированный хирургический метод микродиссекции. Наличие прикрепленной мигательной мембраны, или третьего века, представляет собой уникальные и значительные преимущества.В этом методе сначала глазное яблоко энуклеируется третьим веком, затем третье веко используется для иммобилизации глаза. Затем следует прокалывание глазного яблока через лимб роговицы, и разрез используется в качестве точки входа. Затем, разрезая по окружности, разделяют переднюю и заднюю наглазники.При дальнейшем рассечении задней чашки глаза выявляется полупрозрачный слой нервной сетчатки и аккуратно отслаивается. Таким образом, нейронный слой и слой RPE получают для дальнейшей обработки. Третье веко позволит нам разграничить пространственную ориентацию глаза после энуклеации.Давайте теперь выполним подробную пошаговую процедуру. Расширьте глаза грызунов с помощью капель 0,8% тропикамида и 5% офтальмологических растворов фенилэфрина и поместите животное в темное место на 30 минут перед процедурой. Усыпить животное путем внутрибрюшинного введения пятикратных доз анестезии.Типичная доза составляет 200 микролитров PBS, содержащих 10 мг кетамина и один мг ксилазина. Подтвердите полное отсутствие реакции на раздражитель, изучив педальный рефлекс. Поместите мышь в боковое лежачее положение, чтобы обеспечить полный доступ к глазу.Подготовьте к процедуре щипцы для наложения швов Colibri, изогнутые щипцы, микролезвие размером 15 градусов три миллиметра, пружинные микроножницы и угловые пружинные микроножницы. Поместите изогнутые щипцы вокруг глазного яблока и зажмите, чтобы освободить глаз от посторонних прикреплений. Третье веко, также известное как мигательная мембрана, расположено по направлению к верхнему углу касательной носа и может быть идентифицировано как незначительный полупрозрачный выступ с пигментированными границами.Далее воспользуйтесь пружинными микроножницами и обрежьте вокруг глазного яблока. Небольшие, непрерывные разрезы освобождают глазное яблоко от склеральных прикреплений. Поместите изогнутые пружинные микроножницы под глазное яблоко, чтобы освободить глаз, разрезав зрительный нерв.Поместите энуклеированный глаз в чашку Петри, содержащую буфер PBS, таким образом, чтобы глазное яблоко было погружено в PBS. Некоторые экстраокулярные мышцы или ткани начнут отплывать от глазного яблока. Удалите их, отрезав от глазного яблока с помощью пружинных микроножниц.Затем удалите зрительный нерв от основания глазного яблока, чтобы обеспечить лучшее разделение сетчатки для целых препаратов. Нет необходимости удалять зрительный нерв для рассечения тканей. Перенесите глазное яблоко в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую один мл 4% параформальдегида или PFA.Держите его в течение двух часов при четырех градусах Цельсия для фиксации тканей. На этом этапе можно сделать паузу, оставив ткань в PFA на срок до 12 часов при четырех градусах Цельсия. Однако для выделения живых клеток этапы фиксации не следует выполнять, и вся процедура должна выполняться в континууме.После фиксации PFA перенесите глазное яблоко в чашку Петри, содержащую PBS, и поместите ее под препарирующий микроскоп для выполнения последующей процедуры. Обездвижьте глазное яблоко, крепко удерживая третье веко щипцами для наложения швов Colibri. Лимб - это склеральное соединение роговицы.Сделайте небольшой разрез на лимбе, проткнув его с помощью микролезвия. Разрез делается желательно напротив третьего века. Затем, используя этот разрез в качестве отправной точки, микроножницами сделайте небольшие и непрерывные надрезы вдоль окружности лимба склеры роговицы.Сначала сделайте полукруг разрезов, начиная с точки разреза до третьего века. Затем завершите оставшийся полукруг надрезов с другой стороны. Наконец, сделайте разрез вокруг третьего века, чтобы разделить заднюю и переднюю чашечку.Извлеките хрусталик из задней чашки с помощью щипцов, чтобы получить заднюю чашку, состоящую из невральной сетчатки и слоя RPE, а также передней чашки роговицы. При работе с нефиксированными тканями передняя и задняя чашечки теперь могут ферментативно перевариваться для получения одноклеточной суспензии роговицы или сетчатки. Для фиксации тканей перенесите эти чашки в тюбик объемом 1,5 мл, содержащий 1 мл 4% PFA, в течение 12 часов при четырех градусах Цельсия.После фиксации ткань может быть помещена в соответствующую среду, и криосекция или парафиновое сечение могут быть выполнены для получения срезов роговицы или сетчатки. Снова введите заднюю чашку в чашку Петри, содержащую буфер PBS. Непрозрачный слой на пигментированном слое RPE представляет собой нервную сетчатку.Отклеить нервную сетчатку с помощью вторых щипцов. Настоятельно рекомендуется очень мягкое и легкое движение руки, чтобы не повредить ткани. На выходе зрительного нерва изогнутые пружинные ножницы могут быть вставлены под нервную сетчатку, и можно сделать разрез, чтобы полностью освободить слои, если нервная сетчатка остается прикрепленной.Сетчатку также можно освободить или отсоединить, нежно поглаживая ее мягкой щеткой. Повторно вводят переднюю и заднюю чашки в чашку Петри, содержащую буфер PBS. Используйте угловые пружинные микроножницы, чтобы сделать разрез рядом с третьим веком от периферии перпендикулярно к зрительному центру.Удерживайте третье веко и сделайте разрез рядом с первым срезом. Сделайте аналогичный разрез между вторым срезом и третьим веком. Три или четыре таких равноудаленных среза открывают полушаровидные чашечки в форме цветка, который падает плашмя и может быть легко установлен.Не делайте очень глубоких надрезов до центра чашки, так как это может привести к тому, что срезы листьев легко развалятся или отделятся. Жидкая среда позволяет передней чашке глаза приобретать изогнутую структуру. Выполните те же действия, что и для разрезов на задней чашке, чтобы сделать три или четыре равноудаленных надреза на передней чашке.Теперь ткани готовы к дальнейшему окрашиванию. На этом рисунке показано все крепление передней чашечки. Ткань роговицы была микрорассечена, как описано, чтобы выявить лимфатические сосуды в прикрепленной конъюнктивальной ткани листка роговицы.На этом рисунке показана вся горсть нервной сетчатки. Сосудистая сеть нервной сетчатки была окрашена изолектином и видна в виде зеленых сосудов. В этом методе энуклеированное глазное яблоко мышей получают с прикрепленным третьим веком для эффективного и легкого обращения.Третье веко полностью обездвиживает глазное яблоко и позволяет проводить вскрытие с легкостью и минимальными ошибками. Этот метод полезен для секционирования тканей глаза, анализа отдельных клеток и целых маунтов. Однако необходимость повторяющейся фиксации ткани делает ткань нежизнеспособной для культивирования клеток или таких потребностей в живых клетках.Следовательно, процедура должна выполняться в континууме для выделения живых клеток.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Medicine

Unit 1

The Special Senses

SCIENTISTS IN ACTION

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

Мышь Модель Пробирной Роговица Карман для ангиогенеза исследование

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Улучшенный протокол для лазерных микродиссекции человека панкреатических островков от хирургических образцах

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

Лазерная захвата микродиссекция человеческого эпителия простаты для анализа РНК

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Количественный Fundus автофлюоресценции для оценки заболеваний сетчатки

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy (rNAION)

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy rNAION

Грызун Модель Nonarteritic ишемическая оптическая нейропатия передняя (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Флуоресцентная маркировка красителей эритроцитов и лейкоцитов для изучения динамики потока в циркуляции сетчатки мышей

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

Пункция индуцированной неоваскуляризации Iris как модель мыши Рубеоз Радужки

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Пространственная количественного определения наркотиков в поражении туберкулезом легких лазером захватить Microdissection жидкость хроматографии масс-спектрометрия (LCM-LC/МС)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Характеристика новой техники органотипической культуры сетчатки человека

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy

Применение оптической когерентной томографии к мышиной модели ретинопатии

Optical coherence tomography (OCT) offers a noninvasive method for the diagnosis of retinopathy. The OCT machine can capture retinal crosssectional images ...