Name: microdissection of the rodent eye
Uploaded: 2023-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection of the Rodent Eye at JoVE.com

Dr. Alaknanda Mishra, Institutionen för cellbiologi och mänsklig anatomi, University of California Davis, USA, utbildade oss i denna metod vid National Institute of Immunology, New Delhi. Detta arbete stöddes av kärnbidraget från Institutionen för bioteknik, Indiens regering till National Institute of Immunology, New Delhi. P.S. beviljades ett forskarstipendium av institutionen för bioteknik.

Detta förfarande godkändes av den institutionella djuretiska kommittén vid National Institute of Immunology, New Delhi. Serienumret för godkännandet är IAEC#480/18. Experimenten utfördes i enlighet med regleringsriktlinjerna från kommittén för kontroll och övervakning av djurförsök, ministeriet för fiske, djurhållning och mejeri, Indiens regering, under överinseende av en professionell veterinär vid SAF, NII.
1. Förberedelse
<ol><li>Vidga gnagarögonen med ...

<ol>
	<li>Choi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cancer+immunotherapy+using+patient-derived+xenografts+(PDXs)+in+humanized+mice.">Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice.</a> Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li><li>Sutherland, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+of+Highly+Pure+Trabecular+Meshwork+from+Mouse+Eyes+for+Gene+Expression+Analysis.">Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis.</a> J Vis Exp. (136), e57576 (2018).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Claybon, A., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+mouse+eye+for+a+whole+mount+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2563 (2011).</li><li>Steven, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+induction+and+three-dimensional+two-photon+imaging+of+conjunctiva-associated+lymphoid+tissue.">Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).</li><li>Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+wholemount+technique:+A+window+to+understanding+the+brain+and+behaviour.">The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour.</a> Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).</li><li>Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatics+and+lymphangiogenesis+in+the+eye.">Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye.</a> Journal of Ophthalmology. 2012, 783163 (2012).</li><li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood-derived+monocytes+show+neuronal+properties+and+integration+in+immune-deficient+rd1+mouse+model+upon+phenotypic+differentiation+and+induction+with+retinal+growth+factors.">Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412 (2020).</li></ol>

Okulär mikrodissektion har visat sig vara en svår uppgift på grund av gnagarögats lilla storlek och sfäriska form, och gnagarögat kräver innovativa tekniker för effektiv hantering8. 
I den nuvarande demonstrerade metoden erhålls den enukleerade musögongloben med det tredje ögonlocket fäst för effektiv och enkel hantering. Med hjälp av det tredje ögonlocket kan ögongloben immobiliseras helt, vilket gör att dissektionen kan fortsätta med lätthet och med...

Okulär dissektion är en viktig teknik inom oftalmisk forskning och har gjort det möjligt för utredare att få tillgång till ögonsegmenten för riktade studier. Tidigare förlitade sig okulära forskare på ögonvävnaden från sjuka individer för sina studier. Det successivt växande antalet stammar av oftalmiska gnagarmodeller1 genom åren har dock minskat behovet av mänsklig ögonvävnad. Dessa musstammar har möjliggjort en djupare förståelse av ögonsjukdom och interventioner. Ändå har de också skapat ett behov av innovativa tekniker för okulär mikrodissektion. Den lilla storleken och det begränsade verksamhetsområdet begränsar allvarligt effektiv åtkomst till de okulära underdelarna. På grund av den homogena cellulära sammansättningen av de bakre och främre ögonmusslorna är det dessutom svårt att genomföra riktade ingrepp efter dissektion. De nuvarande mikrodissektionsteknikerna för laser2 och kirurgisk mikrodissektion 3,4 är otillräckliga för att uppfylla sådana krav på okulär forskning. Lasermikrodissektion är mycket effektiv vid encellsanalys, men den specifika vävnaden måste mikrodissekeras före laserproceduren2. Tekniken kan isolera små intressanta områden från en fördissekerad vävnad för molekylanalys. Således är tekniken inte lämplig för att förbereda helmonterade eller för isolering av axiellt packade okulära skikt för optimal visualisering.
Den kirurgiska metoden är den mest använda tekniken; Denna metod innebär immobilisering av ögat via synnerven5 och sedan utföra dissektionen. Denna övning är svår och kan skada all ömtålig vävnad, eftersom det sfäriska ögat fortsätter att röra sig under dissektion. Trots att den är fördelaktig för att isolera de olika sektionerna av näthinneskikten, kan tekniken inte avgränsa vävnadens rumsliga orientering vid dissektion.
Under dissektion ger upprätthållandet av närvaron av det bifogade nictiterande membranet eller det tredje ögonlocket (figur 1) unika och signifikanta fördelar. I denna metod är ögongloben först enukleerad med det tredje ögonlocket. Sedan används det tredje ögonlocket för att immobilisera ögat6 (figur 2A). Detta följs av att genomborra ögongloben genom hornhinnans limbus och använda snittet som ingångspunkt (figur 2B, C). Därefter separeras ögonmusslorna genom att skära längs omkretsen framåt och bakåt (figur 2D-G). Genom att dissekera den bakre ögonmusslan ytterligare kan det genomskinliga skiktet i den neurala näthinnan identifieras och försiktigt skalas av. Tre eller fyra lika avlägsna snitt görs sedan i de erhållna halvklotformiga främre och bakre kopparna, vilket gör att dessa blomformade koppar kan falla platt på en bild (figur 2H).
Det tredje ögonlocket hjälper till med enkel och effektiv hantering under dissektionen, vilket säkerställer minimal skada på vävnaden vid åtkomst till de olika okulära skikten och vid produktion av helfästen. Vidare hjälper närvaron av det tredje ögonlocket att lokalisera och undersöka lokaliserade ingrepp under visualisering.
Proceduren, i vårt labb, har utförts på en CBA / J eller en rd1 musstam vid P28 av vilket kön som helst. Förfarandet kan utföras på vilken stam, ålder eller kön som helst av djur och har ingen bias enligt dessa egenskaper.
Djuren anskaffades från kommersiella källor (se materialförteckning) och hölls vid Small Animal Facility (SAF) vid National Institute of Immunology (NII). De hölls i individuella ventilerade burar (IVC) och fick ad libitum tillgång till surgjort autoklaverat vatten och mat. De hölls vid 21-23 °C och med en 14 h/10 h ljus/mörk cykel.
Nedan ges en modifierad kirurgisk metod för mikrodissektion av ett musöga.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetaminophen (Biocetamol)</td>
			<td>EG Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Kit (DEA)</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated analyser</td>
			<td>Tulip, Alto Santracruz, India</td>
			<td>Screen Maaster 3000</td>
			<td>Biochemical analyser for liver functional test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine (Povidon-Iodine Solution)</td>
			<td>Win-Medicare;&#160; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet ( Class I)</td>
			<td>Kartos international; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright Field Microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>LX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBA/J inbred mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No. 000654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime (Taxim)</td>
			<td>AlKem ; India</td>
			<td></td>
			<td>cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Buds</td>
			<td>Pure Swabs Pvt Ltd ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape Sheet</td>
			<td>JSD Surgicals, Delhi, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution, alcoholic</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>HT110132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>Ugo Basile; Italy</td>
			<td>211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Himedia, India</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair removing cream (Veet)</td>
			<td>Reckitt Benckiser , India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Mayer&#39;s</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>MHS16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>RM554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase From Sheep Testes</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>H6254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I.V. Cannula (Plusflon)</td>
			<td>Mediplus, India</td>
			<td>Ref 1732411420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD ; US</td>
			<td>REF 303060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane ( Forane)</td>
			<td>Asecia Queenborough</td>
			<td>No B506</td>
			<td>Inhalation Anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketamax)</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Melonex)</td>
			<td>Intas Pharmaceuticals Ltd; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; 
			curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Histo-Line Laboratories, Italy</td>
			<td>MRS3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Thread</td>
			<td>Mighty ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>GRM 3660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Tears/Eyemist Gel</td>
			<td>Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India</td>
			<td>P3060</td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGOT (ASAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGPT (ALAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryotome E Cryostat</td>
			<td>Thermo Electron Corporation ; US</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade No. 22</td>
			<td>La Medcare, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Board</td>
			<td>Locally made</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical White Tape</td>
			<td>3M India ; India</td>
			<td>1530-1</td>
			<td>Micropore Surgical Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon, Johnson &#38; Johnson, India</td>
			<td>NW 5047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1ml, 26 G)</td>
			<td>Dispo Van; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer (Clipper)</td>
			<td>Philips</td>
			<td>NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Machine</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#39;s E Media</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>AT125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Xylaxin)</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection of the rodent eye

Den okulära mikrodissektionen av gnagarögat innefattar segmentering av den enukleerade ögongloben med det bifogade nictiterande membranet, eller tredje ögonlocket, för att erhålla de främre och bakre ögonmusslorna. Med denna teknik kan underdelarna av ögat, inklusive hornhinnans vävnad, nervvävnad, retinal pigmentepitelvävnad (RPE) och lins, erhållas för helmontering, kryosnitt och / eller encellssuspensioner av en specifik okulär vävnad. Närvaron av det tredje ögonlocket ger unika och signifikanta fördelar, eftersom det gynnar upprätthållandet av ögats orientering, vilket är viktigt för att förstå ögonfysiologi efter lokaliserad intervention eller i studier som involverar okulär analys relaterad till ögats rumsliga topografi.
I denna metod utlöste vi ögongloben vid uttaget tillsammans med det tredje ögonlocket genom att försiktigt och långsamt skära igenom de extraokulära musklerna och skära av synnerven. Ögongloben genomborrades genom hornhinnans limbus med hjälp av ett mikroblad. Snittet användes som ingångspunkt, vilket möjliggjorde skärning längs hornhinnan-sklerala korsningen genom att sätta in mikrosax genom snittpunkten. Små och kontinuerliga snitt längs omkretsen gjordes tills kopparna separerades. Dessa kan dissekeras ytterligare genom att försiktigt skala det genomskinliga lagret av den neurala näthinnan med hjälp av Colibri suturing pincett för att erhålla neurala näthinnan och RPE-skikten. Vidare gjordes tre/fyra lika avlägsna snitt från periferin vinkelrätt mot det optiska centrumet tills synnerven nåddes. Detta öppnade de halvklotformade kopparna i en florettform så att de föll platt och lätt kunde monteras. Denna teknik har använts i vårt laboratorium för hornhinnans helfästen och näthinnesektioner. Närvaron av det tredje ögonlocket avgränsar den nasal-temporala orienteringen, vilket möjliggör studier av olika cellterapiinterventioner efter transplantation och därmed den riktade fysiologiska valideringen som är avgörande för visualisering och korrekt representation i sådana studier.

Ett helt berg av rd1 musöga/hornhinnevävnad förbereddes för att studera potentiell lymfangiogenes i den främre/hornhinnevävnaden i ett sjukt tillstånd. Den bifogade konjunktivalvävnaden från det tredje ögonlocket fungerade som en positiv kontroll, eftersom hornhinnan saknar lymfkärl. För studien dissekerades hornhinnevävnaden med bindhinnan och fixerades med 4% PFA, följt av permeabilisering och blockering. Vävnaden färgades sedan med en primär antikropp mot den lymfatiska endotelmarkören (LYVE1)<sup cl...

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection of the Rodent Eye at JoVE.com

Microdissection of the Rodent Eye

Detta dokument presenterar ett protokoll för okulär mikrodissektion hos gnagare. Processen innefattar enukleation av ögongloben tillsammans med det nictiterande membranet (dvs det tredje ögonlocket). Detta följs sedan av separationen av de bakre och främre ögonkopparna.

Mikrodissektion av gnagareögat

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, ...

Okulär forskning i tidigare tider förlitade sig mest på ögonvävnaden från avlidna individer. Men genom åren har många oftalmiska gnagarmodeller utvecklats och behovet av mänsklig okulär vävnad har minskat. På grund av den lilla storleken och det begränsade operationsområdet i gnagarens öga är den effektiva åtkomsten till de okulära underdelarna allvarligt begränsad.Typiskt, för att operera på en gnagares öga, immobiliseras ögat via synnerven och dissektionen utförs. Denna övning är svår och kan skada den ömtåliga vävnaden när det sfäriska ögat fortsätter att röra sig under dissektionen. Trots att den är fördelaktig för att isolera de olika sektionerna av retinala skikt, kan denna teknik inte avgränsa vävnadens rumsliga orientering vid dissektion av vävnaden.Vidare är en riktad intervention svår att lokalisera efter dissektion på grund av den homogena cellulära sammansättningen av den bakre och främre ögonkoppen. I denna video demonstreras en modifierad kirurgisk metod för mikrodissektion. Närvaron av det bifogade nictiterande membranet, eller det tredje ögonlocket, ger unika och betydande fördelar.I denna metod är först ögongloben enukleerad med det tredje ögonlocket, sedan används det tredje ögonlocket för att immobilisera ögat. Det följs av piercing av ögongloben genom hornhinnans limbus, och snittet används som ingångspunkt. Sedan, genom att skära längs omkretsen, separeras främre och bakre ögonkoppar.Genom att dissekera den bakre ögonkoppen ytterligare identifieras det genomskinliga skiktet i den neurala näthinnan och skalas försiktigt av. De neurala och RPE-skikten erhålls således för vidare bearbetning. Det tredje ögonlocket gör det möjligt för oss att avgränsa den rumsliga orienteringen av ögat efter enukleation.Låt oss nu följa detaljerade steg-för-steg-förfaranden. Utvidga gnagarögonen med en droppe 0,8% tropikamid och 5% fenylefrin oftalmiska lösningar och placera djuret i ett mörkt område i 30 minuter före proceduren. Eutanisera djuret genom intraperitonealt administrering fem gånger doser anestesi.En typisk dos är 200 mikroliter PBS innehållande 10 mg ketamin och en mg xylazin. Bekräfta fullständig brist på svar på stimulans genom att undersöka pedalreflexen. Placera musen i liggande läge för att ge fullständig åtkomst till ögat.Håll en Colibri suturtång, en böjd pincett, ett mikroblad 15 grader tre millimeter storlek, fjädermikrosax och en vinklad fjädermikrosax redo för proceduren. Placera en krökt pincett runt ögongloben och nyp för att frigöra ögat från främmande fästen. Det tredje ögonlocket, även känt som det nictiterande membranet, ligger mot det övre hörnet av nästangenten och kan identifieras som en mindre genomskinlig utskjutning med pigmenterade gränser.Använd sedan en fjädermikrosax och skär runt ögongloben. Små, kontinuerliga snitt frigör ögongloben från sklerala fästen. Placera en böjd fjädermikrosax under ögongloben för att frigöra ögat genom att klippa synnerven.Placera det enukleerade ögat i en petriskål som innehåller PBS-buffert så att ögongloben är nedsänkt i PBS. Vissa extraokulära muskler eller vävnader börjar flyta bort från ögongloben. Ta bort dem genom att klippa av dem från ögongloben med fjädermikrosax.Ta sedan bort synnerven från basen av ögongloben för att möjliggöra bättre separation av näthinnan för helmonteringspreparat. Det är inte nödvändigt att ta bort synnerven för vävnadssnittning. Överför ögongloben till ett 1,5 ml rör som innehåller en ml 4% paraformaldehyd eller PFA.Håll den i två timmar vid fyra grader Celsius för vävnadsfixering. Det är möjligt att pausa i detta steg genom att lämna vävnaden i PFA i upp till 12 timmar vid fyra grader Celsius. För isolering av levande celler bör emellertid fixeringsstegen inte utföras och hela proceduren måste utföras i kontinuum.Efter PFA-fixering, överför ögongloben till en petriskål som innehåller PBS och placera den under ett dissekerande mikroskop för att utföra den efterföljande proceduren. Immobilisera ögongloben genom att hålla ner det tredje ögonlocket ordentligt med Colibri suturingpincett. Limbus är hornhinnans sklerala korsning.Gör ett litet snitt vid limbus genom att genomborra det med ett mikroblad. Snittet görs företrädesvis mittemot det tredje ögonlocket. Därefter, med hjälp av detta snitt som utgångspunkt, med mikrosaxen gör små och kontinuerliga snitt längs denna hornhinnesklerala limbusomkrets.Slutför först en halvcirkel av snitt från snittpunkten till det tredje ögonlocket. Slutför sedan den återstående halvcirkeln av snitt på andra sidan. Slutligen gör du ett snitt runt det tredje ögonlocket för att separera den bakre och den främre koppen.Ta bort linsen från den bakre koppen med hjälp av pincett för att erhålla den bakre koppen bestående av neural näthinna och RPE-skikt och hornhinnans främre kopp. Om du arbetar med ofixerade vävnader kan de främre och bakre kopparna nu enzymatiskt smältas för att erhålla hornhinnan eller retinal encellssuspension. För fixering av vävnaderna, överför dessa koppar till ett 1,5 ml rör innehållande 1 ml 4% PFA i 12 timmar vid fyra grader Celsius.Efter fixering kan vävnaden bäddas in i lämpligt medium och kryosektion eller paraffinsnitt kan göras för att erhålla hornhinne- eller näthinnesnitt. Sätt tillbaka den bakre koppen i petriskålen som innehåller PBS-buffert. Ett ogenomskinligt skikt på det pigmenterade RPE-skiktet är den neurala näthinnan.Skala av den neurala näthinnan med en andra pincett. En mycket mild och lätt handrörelse rekommenderas starkt för att inte skada vävnaden. Vid synnerven, utgång, kan den böjda fjädersaxen sättas in under nervnäthinnan, och ett snitt kan göras för att helt frigöra skikten om neurala näthinnan förblir fäst.Näthinnan kan också frigöras eller lossas genom att försiktigt stryka den med en mjuk borste. Återinför de främre och bakre kopparna i petriskålen som innehåller PBS-buffert. Använd en vinklad fjädermikrosax för att göra ett snitt bredvid det tredje ögonlocket från periferin vinkelrätt mot det optiska centrumet.Håll ett grepp om det tredje ögonlocket och gör ett snitt bredvid det första snittet. Gör ett liknande snitt mellan det andra snittet och det tredje ögonlocket. Tre eller fyra sådana lika avlägsna snitt öppnar de halvklotformade kopparna i en blomform, som faller platt och lätt kan monteras.Gör inte mycket djupa snitt förrän i mitten av koppen, eftersom det kan göra att bladsektionerna faller isär eller separeras lätt. Det flytande mediet tillåter den främre ögonkoppen att uppnå en krökt struktur. Följ samma steg som ges för att göra snitt på den bakre koppen för att göra tre eller fyra lika långt snitt på den främre koppen.Vävnaderna är nu redo för ytterligare färgning. I denna figur visas helamonter av främre kopp. Hornhinnans vävnad mikrodissekerades enligt beskrivningen för att avslöja lymfkärlen i den bifogade konjunktivalvävnaden i hornhinnans broschyr.I denna figur visas helamount av neural näthinna. Den retinala vaskulaturen i den neurala näthinnan färgades med isolektin och är synlig som gröna kärl. I denna metod erhålls mössens enukleerade ögonglob med det bifogade tredje ögonlocket för effektiv och enkel hantering.Det tredje ögonlocket immobiliserar ögongloben helt och låter dissektionen fortsätta med lätthet och minimala fel. Denna metod är fördelaktig för okulär vävnadsspecifik snittning, encellsanalys och helmonteringar. Behovet av repetitiv vävnadsfixering gör emellertid vävnaden oanvändbar för cellodling eller sådana levande cellbehov.Därför måste proceduren utföras i kontinuum för levande cellisolering.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Medicine

Unit 1

The Special Senses

SCIENTISTS IN ACTION

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

En musmodell av hornhinnan Pocket-analys för Angiogenes Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Förbättrad protokoll för laser mikrodissektion av humana pankreasöar från kirurgiska prover

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

Laser-capture Microdissection av humant prostata epitel för RNA-analys

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Kvantitativ Fundus autofluorescens för utvärdering av retinala sjukdomar

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy (rNAION)

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy rNAION

Den Gnagarmodell av Nonarteritic främre ischemisk optikusneuropati (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Fluorescerande färgämnesmärkning av erytrocyter och leukocyter för att studera flödesdynamiken i muskelspiralcirkulationen

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

Punktering-inducerad Iris kärlnybildning som en musmodell av Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Rumsliga kvantifiering av droger i lungtuberkulos lesioner av Laser fånga lokalt flytande kromatografi masspektrometri (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Karakterisering av en ny mänsklig organotypisk retinal kulturteknik

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy

Tillämpning av optisk koherenstomografi på en musmodell av retinopati

Optical coherence tomography (OCT) offers a noninvasive method for the diagnosis of retinopathy. The OCT machine can capture retinal crosssectional images ...