Name: microdissection of the rodent eye
Uploaded: 2023-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection of the Rodent Eye at JoVE.com

ABD'deki California Davis Üniversitesi, Hücre Biyolojisi ve İnsan Anatomisi Bölümü'nden Dr. Alaknanda Mishra, Yeni Delhi'deki Ulusal İmmünoloji Enstitüsü'nde bizi bu yöntemde eğitti. Bu çalışma, Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bölümü'nden Yeni Delhi Ulusal İmmünoloji Enstitüsü'ne verilen temel hibe ile desteklenmiştir. PS'ye Biyoteknoloji Bölümü tarafından araştırma bursu verildi.

Bu prosedür, Yeni Delhi Ulusal İmmünoloji Enstitüsü'nün Kurumsal Hayvan Etiği Komitesi tarafından onaylanmıştır. Onayın seri referans numarası IAEC#480/18'dir. Deneyler, Hindistan Hükümeti, Hayvanlar Üzerinde Deneylerin Kontrol ve Denetimi Komitesi, Balıkçılık, Hayvancılık ve Süt Ürünleri Bakanlığı'nın düzenleme yönergelerine uygun olarak, SAF, NII'deki profesyonel bir Veterinerin gözetiminde gerçekleştirilmiştir.
1. Hazırlık
<ol><li>Her ...

<ol>
	<li>Choi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cancer+immunotherapy+using+patient-derived+xenografts+(PDXs)+in+humanized+mice.">Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice.</a> Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li><li>Sutherland, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+of+Highly+Pure+Trabecular+Meshwork+from+Mouse+Eyes+for+Gene+Expression+Analysis.">Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis.</a> J Vis Exp. (136), e57576 (2018).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li><li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).</li><li>Claybon, A., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+mouse+eye+for+a+whole+mount+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2563 (2011).</li><li>Steven, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+induction+and+three-dimensional+two-photon+imaging+of+conjunctiva-associated+lymphoid+tissue.">Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).</li><li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo.">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).</li><li>Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+wholemount+technique:+A+window+to+understanding+the+brain+and+behaviour.">The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour.</a> Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).</li><li>Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatics+and+lymphangiogenesis+in+the+eye.">Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye.</a> Journal of Ophthalmology. 2012, 783163 (2012).</li><li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood-derived+monocytes+show+neuronal+properties+and+integration+in+immune-deficient+rd1+mouse+model+upon+phenotypic+differentiation+and+induction+with+retinal+growth+factors.">Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412 (2020).</li></ol>

Oküler mikrodiseksiyonun, kemirgen gözünün küçük boyutu ve küresel şekli nedeniyle zor bir görev olduğu bulunmuştur ve kemirgen gözü, etkili kullanım için yenilikçi teknikler gerektirir8. 
Mevcut gösterilen yöntemde, enüklee fare göz küresi, etkili ve kolay kullanım için takılı üçüncü göz kapağı ile elde edilir. Üçüncü göz kapağını kullanarak, göz küresi tamamen hareketsiz hale getirilebilir, bu da diseksiyonun kolaylıkla ve m...

Oküler diseksiyon, oftalmik araştırmalarda önemli bir tekniktir ve araştırmacıların hedeflenen çalışmalar için gözün segmentlerine erişmelerine izin vermiştir. Daha önce, oküler araştırmacılar, çalışmaları için hastalıklı bireylerin oküler dokusuna güveniyorlardı. Bununla birlikte, yıllar içinde oftalmik kemirgen modellerinin1 suşlarının sayısının giderek artması, insan oküler dokusuna olan ihtiyacı azaltmıştır. Bu fare suşları, oküler hastalık ve müdahalelerin daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlamıştır. Bununla birlikte, oküler mikro-diseksiyonun yenilikçi tekniklerine de ihtiyaç duymuşlardır. Küçük boyut ve sınırlı operasyon alanı, oküler alt parçalara etkili erişimi ciddi şekilde kısıtlar. Ayrıca, posterior ve anterior vizör kapaklarının homojen hücresel montajı nedeniyle, diseksiyon sonrası hedefe yönelik müdahalelerin yapılması zordur. Lazer2 ve cerrahi mikrodiseksiyon 3,4'ün mevcut mikrodiseksiyon teknikleri, oküler araştırmaların bu gereksinimlerini karşılamada yetersizdir. Lazer mikro-diseksiyonu tek hücreli analizde çok etkilidir, ancak spesifik dokunun lazer prosedürü2'den önce mikro diseke edilmesi gerekir. Teknik, moleküler analiz için küçük ilgi alanlarını önceden disseke edilmiş bir dokudan izole edebilir. Bu nedenle, teknik tüm montajların hazırlanması veya optimum görselleştirme için eksenel olarak paketlenmiş oküler tabakaların izolasyonu için uygun değildir.
Cerrahi yöntem en çok kullanılan tekniktir; Bu yöntem, gözün optik sinir5 yoluyla hareketsiz hale getirilmesini ve daha sonra diseksiyonun yapılmasını içerir. Bu uygulama zordur ve diseksiyon sırasında küresel göz hareket etmeye devam ettiği için herhangi bir kırılgan dokuya zarar verebilir. Retina tabakalarının çeşitli bölümlerini izole etmek için faydalı olmasına rağmen, teknik diseksiyon üzerine dokunun uzamsal yönelimini belirleyemez.
Diseksiyon sırasında, bağlı niktitasyon zarının veya üçüncü göz kapağının varlığını korumak (Şekil 1) benzersiz ve önemli avantajlar sunar. Bu yöntemde öncelikle üçüncü göz kapağı ile göz küresi enüklee edilir. Daha sonra, üçüncü göz kapağı gözüimmobilize etmek için kullanılır 6 (Şekil 2A). Bunu göz küresinin kornea limbusundan delinmesi ve insizyonun giriş noktası olarak kullanılması izler (Şekil 2B,C). Daha sonra vizör kapakları ön ve arka çevre boyunca kesilerek ayrılır (Şekil 2D-G). Arka vizör adaptörünü daha da diseke ederek, nöral retinanın yarı saydam tabakası tanımlanabilir ve nazikçe soyulabilir. Daha sonra elde edilen yarım küre şeklindeki ön ve arka bardaklarda üç veya dört eşit mesafeli kesim yapılır, bu da bu çiçek şeklindeki bardakların bir slayt üzerine düz bir şekilde düşmesine izin verir (Şekil 2H).
Üçüncü göz kapağı, diseksiyon sırasında kolay ve verimli bir şekilde kullanılmasına yardımcı olur, böylece çeşitli oküler tabakalara erişirken ve bütünsel montajlar üretirken dokuya minimum hasar verir. Ayrıca, üçüncü göz kapağının varlığı, görselleştirme sırasında lokalize müdahalelerin bulunmasına ve incelenmesine yardımcı olur.
Prosedürümüz, laboratuarımızda, herhangi bir cinsiyetin P28'inde bir CBA / J veya rd1 fare suşu üzerinde gerçekleştirilmiştir. Prosedür, hayvanın herhangi bir suşu, yaşı veya cinsiyeti üzerinde yapılabilir ve bu özelliklere göre önyargısı yoktur.
Hayvanlar ticari kaynaklardan temin edildi ( bakınız Malzeme Tablosu) ve Ulusal İmmünoloji Enstitüsü'ndeki (NII) Küçük Hayvan Tesisi'nde (SAF) muhafaza edildi. Bireysel havalandırmalı kafeslerde (IVC) tutuldular ve asitleştirilmiş otoklavlanmış suya ve yiyeceğe ad libitum erişimi aldılar. 21-23 ° C'de ve 14 saat / 10 saat açık / karanlık döngüsünde tutuldular.
Aşağıda verilen, bir fare gözünün mikro diseksiyonu için modifiye edilmiş bir cerrahi yöntemdir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetaminophen (Biocetamol)</td>
			<td>EG Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Kit (DEA)</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated analyser</td>
			<td>Tulip, Alto Santracruz, India</td>
			<td>Screen Maaster 3000</td>
			<td>Biochemical analyser for liver functional test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine (Povidon-Iodine Solution)</td>
			<td>Win-Medicare;&#160; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet ( Class I)</td>
			<td>Kartos international; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright Field Microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>LX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBA/J inbred mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No. 000654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime (Taxim)</td>
			<td>AlKem ; India</td>
			<td></td>
			<td>cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Buds</td>
			<td>Pure Swabs Pvt Ltd ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape Sheet</td>
			<td>JSD Surgicals, Delhi, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution, alcoholic</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>HT110132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>Ugo Basile; Italy</td>
			<td>211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Himedia, India</td>
			<td>GRM077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair removing cream (Veet)</td>
			<td>Reckitt Benckiser , India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Mayer&#39;s</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>MHS16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>RM554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase From Sheep Testes</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>H6254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I.V. Cannula (Plusflon)</td>
			<td>Mediplus, India</td>
			<td>Ref 1732411420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD ; US</td>
			<td>REF 303060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane ( Forane)</td>
			<td>Asecia Queenborough</td>
			<td>No B506</td>
			<td>Inhalation Anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketamax)</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Melonex)</td>
			<td>Intas Pharmaceuticals Ltd; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro needle holders straight &#38; 
			curved</td>
			<td>Mercian ;&#160; England</td>
			<td>BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Histo-Line Laboratories, Italy</td>
			<td>MRS3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Thread</td>
			<td>Mighty ; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>GRM 3660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Tears/Eyemist Gel</td>
			<td>Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India</td>
			<td>P3060</td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Major Surgicals; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGOT (ASAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGPT (ALAT) KIT</td>
			<td>Coral Clinical System, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cryotome E Cryostat</td>
			<td>Thermo Electron Corporation ; US</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma ; US</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade No. 22</td>
			<td>La Medcare, India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Board</td>
			<td>Locally made</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical White Tape</td>
			<td>3M India ; India</td>
			<td>1530-1</td>
			<td>Micropore Surgical Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon, Johnson &#38; Johnson, India</td>
			<td>NW 5047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1ml, 26 G)</td>
			<td>Dispo Van; India</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer (Clipper)</td>
			<td>Philips</td>
			<td>NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Machine</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>No specific Catalog Number (Local Procurement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#39;s E Media</td>
			<td>Himedia; India</td>
			<td>AT125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Xylaxin)</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection of the rodent eye

Kemirgen gözünün oküler mikro diseksiyonu, ön ve arka göz kapaklarını elde etmek için enüklee edilmiş göz küresinin bağlı niktitasyon zarı veya üçüncü göz kapağı ile segmentasyonunu içerir. Bu teknikle, kornea dokusu, sinir dokusu, retinal pigment epitel (RPE) dokusu ve lens dahil olmak üzere gözün alt kısımları, belirli bir oküler dokunun bütünlemeleri, kriyo-kesitleme ve / veya tek hücreli süspansiyonları için elde edilebilir. Üçüncü göz kapağının varlığı, herhangi bir lokalize müdahaleyi takiben veya gözün uzamsal topografisi ile ilgili oküler analizi içeren çalışmalarda göz fizyolojisini anlamak için önemli olan gözün oryantasyonunun korunmasına fayda sağladığı için benzersiz ve önemli avantajlar sunar.
Bu yöntemde, göz dışı kasları dikkatlice ve yavaşça keserek ve optik siniri keserek üçüncü göz kapağı ile birlikte yuvadaki göz küresini enüklee ettik. Göz küresi bir mikrobıçak kullanılarak kornea limbusundan delindi. Kesi, giriş noktası olarak kullanıldı ve kesi noktasından mikro makas yerleştirilerek kornea-skleral bileşke boyunca kesime izin verildi. Bardaklar ayrılana kadar çevre boyunca küçük ve sürekli kesimler yapıldı. Bunlar, nöral retina ve RPE katmanlarını elde etmek için Colibri dikiş forseps kullanılarak nöral retinanın yarı saydam tabakasının hafifçe soyulmasıyla daha da diseke edilebilir. Ayrıca, optik sinire ulaşılana kadar periferden optik merkeze dik olarak üç/dört eşit uzaklıkta kesim yapıldı. Bu, yarım küre şeklindeki bardakları çiçek şeklinde açtı, böylece düz düştüler ve kolayca monte edilebildiler. Bu teknik laboratuvarımızda kornea kepçeleri ve retina kesitleri için kullanılmıştır. Üçüncü göz kapağının varlığı, nakil sonrası çeşitli hücre tedavisi müdahalelerinin incelenmesine izin veren nazal-temporal oryantasyonu ve dolayısıyla bu tür çalışmalarda görselleştirme ve doğru temsil için hayati önem taşıyan hedeflenen fizyolojik doğrulamayı tanımlar.

Hastalıklı bir durumda anterior/kornea dokusundaki potansiyel lenf-anjiyogenezi incelemek için rd1 fare gözü/kornea dokusunun tamamı hazırlandı. Üçüncü göz kapağından bağlanan konjonktival doku, kornea lenfatik damarlardan yoksun olduğu için pozitif bir kontrol görevi gördü. Çalışma için kornea dokusu konjonktiva ile diseke edildi ve% 4 PFA ile sabitlendi, ardından permeabilizasyon ve blokaj yapıldı. Doku daha sonra lenfatik endotel belirtecine (LYVE1)9 karşı primer b...

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection of the Rodent Eye at JoVE.com

Microdissection of the Rodent Eye

Bu yazıda kemirgenlerde oküler mikrodiseksiyon için bir protokol sunulmaktadır. İşlem, göz küresinin niktitasyon zarı (yani üçüncü göz kapağı) ile birlikte enükleasyonunu içerir. Bunu daha sonra arka ve ön göz kapaklarının ayrılması izler.

Kemirgen Gözün Mikrodiseksiyonu

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, ...

Daha önceki zamanlarda yapılan oküler araştırmalar çoğunlukla ölen bireylerin oküler dokusuna dayanıyordu. Bununla birlikte, yıllar geçtikçe, birçok oftalmik kemirgen modeli geliştirilmiş ve insan oküler dokusuna olan ihtiyaç azalmıştır. Kemirgen gözündeki küçük boyut ve sınırlı operasyon alanı nedeniyle, oküler alt parçalara etkili erişim ciddi şekilde kısıtlanmıştır.Tipik olarak, bir kemirgenin gözü üzerinde çalışmak için, göz optik sinir yoluyla hareketsiz hale getirilir ve diseksiyon yapılır. Bu uygulama zordur ve diseksiyon sırasında küresel göz hareket etmeye devam ettiği için kırılgan dokuya zarar verebilir. Retina tabakalarının çeşitli bölümlerinin izole edilmesinde faydalı olmasına rağmen, bu teknik dokunun diseksiyonu üzerine dokunun mekansal yönelimini belirleyemez.Ayrıca, posterior ve anterior göz kapağının homojen hücresel montajı nedeniyle diseksiyon sonrası hedefe yönelik bir müdahalenin bulunması zordur. Bu videoda, mikrodiseksiyon için modifiye cerrahi bir yöntem gösterilmiştir. Bağlı niktitasyon zarının veya üçüncü göz kapağının varlığı, benzersiz ve önemli avantajlar sunar.Bu yöntemde önce göz küresi üçüncü göz kapağı ile enüklee edilir, daha sonra gözü hareketsiz hale getirmek için üçüncü göz kapağı kullanılır. Bunu kornea limbusundan göz küresinin delinmesi izler ve kesi giriş noktası olarak kullanılır. Daha sonra, çevre boyunca kesilerek, ön ve arka göz kapakları ayrılır.Arka göz kapağını daha da diseke ederek, nöral retinanın yarı saydam tabakası tanımlanır ve nazikçe soyulur. Nöral ve RPE katmanları böylece daha sonraki işlemler için elde edilir. Üçüncü göz kapağı, göz sonrası enükleasyonun uzamsal yönünü belirlememizi sağlayacaktır.Şimdi ayrıntılı adım adım prosedürü takip edelim. Kemirgen gözlerini% 0.8 tropikamid% 5 fenilefrin oftalmik çözeltileri kullanarak genişletin ve hayvanı işlemden önce 30 dakika boyunca karanlık bir alana yerleştirin. İntraperitoneal olarak beş kat anestezi dozu uygulayarak hayvanı ötenazileştirin.Tipik bir doz, 10 mg ketamin ve bir mg ksilazin içeren 200 mikrolitre PBS'dir. Pedal refleksini inceleyerek uyarana tam yanıt eksikliğini onaylayın. Göze tam erişime izin vermek için fareyi yanal yassılığa yerleştirin.Bir Colibri dikiş forseps, kavisli forseps, 15 derece üç milimetre boyutunda bir mikro bıçak, yaylı mikro makas ve açılı bir yaylı mikro makası prosedür için hazır bulundurun. Göz küresinin etrafına kavisli bir forseps yerleştirin ve gözü yabancı ataşmanlardan kurtarmak için çimdikleyin. Niktitasyon zarı olarak da bilinen üçüncü göz kapağı, nazal teğetin üst köşesine doğru yerleştirilir ve pigmentli sınırları olan küçük bir yarı saydam çıkıntı olarak tanımlanabilir.Ardından, bir yay mikro makası kullanın ve göz küresinin etrafını kesin. Küçük, sürekli kesikler göz küresini skleral ataşmanlardan serbest bırakır. Optik siniri keserek gözü serbest bırakmak için göz küresinin altına kavisli bir yay mikro makası yerleştirin.Enüklee olmuş gözü, PBS tamponu içeren bir Petri kabına, göz küresi PBS'ye batırılacak şekilde yerleştirin. Bazı ekstraoküler kaslar veya dokular göz küresinden uzaklaşmaya başlayacaktır. Yaylı mikro makas kullanarak göz küresini keserek çıkarın.Ardından, tüm hazırlıklar için retinanın daha iyi ayrılmasını sağlamak için optik siniri göz küresinin tabanından çıkarın. Doku kesiti için optik sinirin çıkarılması gerekli değildir. Göz küresini bir ml% 4 paraformaldehit veya PFA içeren 1.5 ml'lik bir tüpe aktarın.Doku fiksasyonu için iki saat boyunca dört santigrat derecede saklayın. Bu adımda dokuyu PFA'da dört santigrat derecede 12 saate kadar bırakarak duraklamak mümkündür. Ancak canlı hücrelerin izolasyonu için fiksasyon adımlarının yapılmaması ve tüm prosedürün süreklilik içinde yapılması gerekmektedir.PFA fiksasyonundan sonra, göz küresini PBS içeren bir Petri kabına aktarın ve sonraki prosedürü gerçekleştirmek için diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Colibri dikiş forsepsleri ile üçüncü göz kapağını sıkıca tutarak göz küresini hareketsiz hale getirin. Limbus kornea skleral kavşağıdır.Bir mikrobıçak kullanarak delerek limbusta küçük bir kesi yapın. Kesi tercihen üçüncü göz kapağının karşısında yapılır. Daha sonra, bu insizyonu bir başlangıç noktası olarak kullanarak, mikro makas ile bu kornea skleral limbus çevresi boyunca küçük ve sürekli kesikler yapın.İlk olarak, kesi noktasından başlayarak üçüncü göz kapağına kadar yarım daire şeklinde bir kesik tamamlayın. Ardından diğer taraftaki yarım daire şeklindeki kesimleri tamamlayın. Son olarak, arka ve ön fincanı ayırmak için üçüncü göz kapağının etrafında bir kesim yapın.Nöral retina ve RPE tabakası ile kornea ön kapağından oluşan posterior fincanı elde etmek için forseps kullanarak lensi posterior fincandan çıkarın. Sabit olmayan dokularla çalışıyorsanız, ön ve arka kaplar artık kornea veya retinal tek hücreli süspansiyon elde etmek için enzimatik olarak sindirilebilir. Dokuları sabitlemek için, bu bardakları dört santigrat derecede 12 saat boyunca 1 ml% 4 PFA içeren 1.5 ml'lik bir tüpe aktarın.Fiksasyon sonrası doku uygun ortama gömülebilir ve kornea veya retina kesitleri elde etmek için kriyoseksiyon veya parafin kesitleme yapılabilir. Arka kabı PBS tamponu içeren Petri kabına tekrar yerleştirin. Pigmentli RPE tabakası üzerindeki opak bir tabaka nöral retinadır.İkinci bir forseps kullanarak nöral retinayı soyun. Dokuya zarar vermemek için çok yumuşak ve hafif bir el hareketi şiddetle tavsiye edilir. Optik sinirde, çıkışta, kavisli yay makası nöral retinanın altına yerleştirilebilir ve nöral retina bağlı kalırsa katmanları tamamen serbest bırakmak için bir kesim yapılabilir.Retina ayrıca yumuşak bir fırça ile hafifçe okşayarak serbest bırakılabilir veya ayrılabilir. Ön ve arka kapları PBS tamponu içeren Petri kabına tekrar yerleştirin. Üçüncü göz kapağının yanında, periferiden optik merkeze dik olarak bir kesim yapmak için açılı bir yaylı mikro makas kullanın.Üçüncü göz kapağını tutun ve ilk kesimin yanında bir kesim yapın. İkinci kesim ile üçüncü göz kapağı arasında benzer bir kesim yapın. Bu tür üç veya dört eşit mesafeli kesim, yarım küre bardaklarını düz düşen ve kolayca monte edilebilen bir çiçek şekline açar.Bardağın ortasına kadar çok derin kesimler yapmayın, çünkü bu yaprak bölümlerinin kolayca parçalanmasına veya ayrılmasına neden olabilir. Sıvı ortam, ön vizör adaptörünün kavisli bir yapıya kavuşmasını sağlar. Ön fincanda üç veya dört eşit mesafeli kesim yapmak için arka bardakta kesikler yapmak için verilen adımları izleyin.Dokular artık daha fazla boyama için hazırdır. Bu şekilde, ön kabın bütünü gösterilmiştir. Kornea dokusu, kornea broşürünün bağlı konjonktival dokusundaki lenfatik damarları ortaya çıkarmak için tarif edildiği gibi mikrodisseke edildi.Bu şekilde, nöral retinanın bütünü gösterilmiştir. Nöral retinanın retinal vaskülatürü İzolektin ile boyanmıştır ve yeşil damarlar olarak görülebilir. Bu yöntemde, farelerin enüklee göz küresi, etkili ve kolay kullanım için takılı üçüncü göz kapağı ile elde edilir.Üçüncü göz kapağı göz küresini tamamen hareketsiz hale getirir ve diseksiyonun kolaylıkla ve minimum hatayla ilerlemesini sağlar. Bu yöntem oküler dokuya özgü kesitleme, tek hücreli analiz ve bütünlük için avantajlıdır. Bununla birlikte, tekrarlayan doku fiksasyonuna duyulan ihtiyaç, dokuyu hücre kültürü veya bu tür canlı hücre ihtiyaçları için dayanılmaz hale getirir.Bu nedenle, canlı hücre izolasyonu için prosedürün süreklilik içinde yapılması gerekir.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Medicine

Unit 1

The Special Senses

SCIENTISTS IN ACTION

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

Anjiyogenez Çalışması Kornea Cep Testi Fare Modeli

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Cerrahi Örnekler kaynaktan İnsan pankreas adacıklarının Lazer Diseksiyon için Geliştirilmiş Protokolü

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

RNA Analizi İnsan Prostat Epitelinin Lazer yakalama mikrodiseksiyon

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Retina Hastalıkları Değerlendirilmesi Nicel Otofloresans

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy (rNAION)

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy rNAION

Nonarteritik Anterior İskemik Optik Nöropati Kemirgen Modeli (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Fare Retinal Sirkülasyonunda Akış Dinamikleri Çalışmak İçin Eritrositler ve Lökositlerin Floresan Boya Etiketlenmesi

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

Delici cisim kaynaklı Iris neovaskülarizasyon Rubeosis Iridis bir fare modeli olarak

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Akciğer tüberkülozu lezyonlar lazer ilaçların kayma miktar yakalamak mikrodiseksiyon sıvı Kromatografi Kütle spektrometresi (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Yeni bir İnsan Organotipik Retina Kültürü Tekniğinin Karakterizasyonu

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy

Optik Koherens Tomografinin Retinopatinin Bir Fare Modeline Uygulanması

Optical coherence tomography (OCT) offers a noninvasive method for the diagnosis of retinopathy. The OCT machine can capture retinal crosssectional images ...