Name: a mouse model for the transition of streptococcus pneumoniae from colonizer to pathogen upon viral co-infection recapitulates age-exacerbated illness
Uploaded: 2022-09-28T14:15:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness at JoVE.

نود أن نشكر لينهارد على القراءة النقدية وتحرير هذه المخطوطة. نود أيضا أن نشكر أندرو كاميلي وأنتوني كامباجناري على السلالات البكتيرية وبروس ديفيدسون على السلالات الفيروسية. تم دعم هذا العمل من قبل منحة المعهد الوطني للصحة (R21AG071268-01) إلى JL ومنح المعهد الوطني للصحة (R21AI145370-01A1) ، (R01AG068568-01A1) ، (R21AG071268-01) إلى E.N.B.G.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

تعتمد معظم الدراسات التجريبية الحالية للعدوى المشتركة للمكورات الرئوية / IAV على توصيل البكتيريا إلى رئتي الفئران المصابة مسبقا ب IAV. ساعدت هذه النماذج في تحديد التغيرات في البيئة الرئوية والاستجابة المناعية الجهازية التي تجعل المضيف عرضة للعدوى البكتيرية الثانوية 15،16،17،32،33،34،35،36،37. ومع ذلك ، فشلت هذه النماذج في محاكاة انتقال S. pneumoniae من مستعمر بدون أعراض إلى ممرض قادر على التسبب في التهابات رئوية وجهازية خطيرة. علاوة على ذلك ، فإن هذه النماذج ليست مناسبة لدراسة العوامل المضيفة والتفاعلات بين المضيف والممرض في الجهاز التنفسي العلوي التي تساهم في التعرض للعدوى. اعتمد نموذج سابق لحركة المكورات الرئوية من البلعوم الأنفي إلى الرئة بعد عدوى IAV على العدوى البكتيرية للبلعوم الأنفي تليها العدوى الفيروسية. ومع ذلك ، فقد فشل في إعادة إنتاج العلامات الشديدة للمرض التي لوحظت في المرضى من البشر21. يلخص نموذج عدوى الفئران المعدل الموصوف هنا انتقال العقدية الرئوية من النقل بدون أعراض إلى ممرض يسبب مرضا سريريا شديدا.
الخطوة الحاسمة في هذا النموذج هي إنشاء عدوى S. الرئوية في البلعوم الأنفي. العقدية الرئوية تشكل الأغشية الحيوية وتستعمر البلعوم الأنفي بكفاءات مختلفة21,38. لإثبات العدوى المتسقة ، يلزم ما لا يقل عن 5 × 106 CFU من السلالات البكتيرية المزروعة بالأغشية الحيوية التي تم اختبارها حتى الآن23. يوصى باختبار أي سلالة بكتيرية جديدة بحثا عن عدوى مستقرة بالبلعوم الأنفي قبل الإصابة بالعدوى الفيروسية. بالنسبة للعدوى الفيروسية المشتركة ، وجدت الدراسات السابقة أن العدوى عن طريق الأنف مع IAV مطلوبة لتشتت البكتيريا من البلعوم الأنفي21،22،23. في تلك الدراسات السابقة ، تم استخدام 500 PFU من IAV للتسليم عن طريق الأنف ، بينما في هذه الدراسة ، كان 200 PFU كافيا لزيادة أعداد البكتيريا في البلعوم الأنفي. لا تقتصر عدوى IAV على الشعب الهوائية العليا ويمكن أن تنتشر إلى الرئتين39,40 ، وهو أمر أساسي لجعل البيئة الرئوية أكثر تساهلا للعدوى البكتيرية15,16,41. يمكن تحقيق توصيل IAV إلى الرئتين إما عن طريق التوصيل عن طريق الأنف أو التركيب داخل القصبة الهوائية للفئران المخدرة. وجد العمل السابق مع الفئران BALB / cByJ أن الولادة عن طريق الأنف تؤدي إلى الالتهاب الرئوي الفيروسي21; ومع ذلك ، فإن وصول اللقاح إلى الرئتين بعد التلقيح عن طريق الأنف يكون أكثر تقييدا في الفئران C57BL / 6. في الفئران C57BL / 6 ، يلزم التثبيت داخل القصبة الهوائية للتوصيل المتسق للفيروس23. في هذا النموذج ، يسرع الاستعمار البكتيري السابق من ظهور أعراض المرض بعد العدوى الفيروسية23. نظرا لأن العدوى الفيروسية نفسها يمكن أن تسبب أعراضا مرضية مع اختلاف محتمل في الحركية ، فمن المستحسن أولا اختبار مجموعة من الجرعات لأي سلالة فيروسية جديدة تم اختبارها واختيار جرعة تكشف عن الحركية المتسارعة في المضيفين المصابين بعدوى مشتركة.
توفر الرئتان قراءة مهمة أخرى لتقييم المرض في هذا النموذج. لتقييم عبء مسببات الأمراض وتدفق الخلايا المناعية ، يمكن استخدام رئة من نفس الفأر. ومع ذلك ، نظرا لأن شدة العدوى والالتهاب يمكن أن تختلف بين الفصوص ، فمن المستحسن عدم أخذ فصوص مختلفة من نفس الرئة لإجراء التقييمات المختلفة. بدلا من ذلك ، يمكن فرم جميع الفصوص إلى قطع صغيرة ، وخلطها جيدا معا ، ثم تحليلها بالتساوي للتقييمات المختلفة. وبالمثل ، يمكن استخدام البلعوم الأنفي لتعداد CFU البكتيري أو PFU الفيروسي والاستجابة المناعية. ومع ذلك ، فإن عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من الغسلات والأنسجة منخفض جدا لإجراء قياس التدفق الخلوي دون تجميع العينات من الفئران داخل نفس المجموعة. بدلا من ذلك ، يمكن تقييم الالتهاب في البلعوم الأنفي نسيجيا23.
من السمات الحاسمة لهذا النموذج أنه يلخص المرض السريري الذي يظهر في المرضى. في البشر ، غالبا ما يؤدي الالتهاب الرئوي الثانوي بالمكورات الرئوية بعد عدوى IAV إلى علامات واضحة للمرض ، بما في ذلك السعال وضيق التنفس والحمى وآلام العضلات التي يمكن أن تؤدي إلى دخول المستشفى وفشل الجهاز التنفسي وحتى الوفاة8،15،42،43. يلخص هذا النموذج العلامات الشديدة للأمراض السريرية التي لوحظت في البشر من حيث صعوبة التنفس (تنعكس في درجة التنفس) والشعور بالضيق العام (ينعكس في درجات الموقف والحركة) التي أظهرتها الفئران ، وكذلك الموت في بعض الضوابط الشابة الأصحاء. من المحتمل أن تكون أعراض المرض المتفاقمة في الفئران المصابة بعدوى مشتركة نتيجة لكل من انتشار البكتيريا إلى الرئتين وضعف التصفية الفيروسية في الفئران مع نقل المكورات الرئوية23. يتمثل أحد قيود النموذج في أن حدوث المرض السريري وانتشار البكتيريا من البلعوم الأنفي يختلف بين الفئران ويتأثر بالسلالة البكتيرية وعمر المضيف والنمط الجيني21،22،23. مما يعكس ذلك ، بالنسبة للسلالات الغازية ، يمكن أن يحدث التقدم من العدوى الموضعية (مع عدم وجود تجرثم الدم القابل للاكتشاف) إلى الموت في غضون 24 ساعة. لذلك ، من أجل تقييم حقيقي للانتشار الجهازي ، يجب متابعة تجرثم الدم على فترات أقصر (كل 6-12 ساعة). وبالمثل ، يمكن أن تتغير درجة المرض بسرعة ، لا سيما في أول 72 ساعة بعد الإصابة المشتركة. لذلك ، لتتبع أعراض المرض عن كثب ، ينصح بمراقبة الفئران ثلاث مرات يوميا لمدة 1-3 أيام بعد الإصابة ب IAV.
باختصار ، يكرر هذا النموذج حركة S. pneumoniae من مستعمر بدون أعراض للبلعوم الأنفي إلى ممرض قادر على التسبب في مرض رئوي وجهازي عند الإصابة بعدوى IAV. في هذا النموذج ، يؤدي IAV إلى انتقال S. pneumoniae عن طريق تعديل السلوك البكتيري في البلعوم الأنفي ، وزيادة انتشار البكتيريا إلى الرئة ، وتغيير المناعة المضادة للبكتيريا23. وبالمثل ، فإن النقل البكتيري يضعف الاستجابات المناعية المضادة للفيروسات ويضعف إزالة IAV من الرئتين23. هذا يجعل هذا النموذج مثاليا لتحليل التغيرات في الاستجابات المناعية في العدوى الفردية مقابل العدوى متعددة الميكروبات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مسار المرض بعد العدوى المشتركة يعتمد ، جزئيا ، على سلالة المكورات الرئوية الموجودة في البلعوم الأنفي. لذلك ، فإن النموذج مناسب لتشريح العوامل البكتيرية المطلوبة للاستعمار بدون أعراض مقابل الانتقال الممرض للمكورات العنقودية الرئوية. أخيرا ، يعيد هذا النموذج إنتاج قابلية الشيخوخة للعدوى المشتركة ، وعلى الرغم من أن هذا لم يتم اختباره هنا ، إلا أنه يمكن استخدامه بسهولة لتقييم تأثير خلفية المضيف على مسار المرض. في الختام ، يوفر فصل النقل والمرض إلى خطوات متميزة الفرصة لتحليل المتغيرات الجينية لكل من مسببات الأمراض والمضيف ، مما يسمح بالفحص التفصيلي لتفاعلات المرض المهم مع المضيف في مراحل مختلفة من تطور المرض. من الآن فصاعدا ، يمكن استخدام هذا النموذج لتخصيص خيارات العلاج للمضيفين المعرضين للخطر.

العقدية الرئوية (المكورات الرئوية) هي بكتيريا إيجابية الجرام تتواجد بدون أعراض في البلعوم الأنفي لمعظم الأفراد الأصحاء 1,2. يمكن أن تنتقل المكورات الرئوية ، التي تعززها عوامل غير محددة تماما ، من مستعمرات حميدة للبلعوم الأنفي إلى مسببات الأمراض التي تنتشر إلى أعضاء أخرى مما يؤدي إلى عدوى خطيرة ، بما في ذلك التهاب الأذن الوسطى والالتهاب الرئوي وتجرثم الدم3. يعتمد عرض مرض المكورات الرئوية ، جزئيا ، على الاختلافات الخاصة بالسلالة ، بما في ذلك النمط المصلي ، الذي يعتمد على تكوين السكريات المحفظة. كان هناك أكثر من 100 نمط مصلي تم توصيفها حتى الآن ، وبعضها يرتبط بعدوى أكثر توغلا 4,5. هناك عدة عوامل أخرى تزيد من خطر الإصابة بمرض المكورات الرئوية. أحد هذه العوامل هو العدوى الفيروسية ، حيث يزداد خطر الإصابة بالالتهاب الرئوي بالمكورات الرئوية 100 ضعف بمقدارIAV 6,7. تاريخيا ، S. الرئوية هي واحدة من الأسباب الأكثر شيوعا للالتهاب الرئوي الجرثومي الثانوي بعد الأنفلونزا ويرتبط بنتائج أسوأ8. عامل خطر رئيسي آخر هو التقدم في العمر. في الواقع ، S. الرئوية هو السبب الرئيسي للالتهاب الرئوي الجرثومي المكتسب من المجتمع لدى الأفراد المسنين الذين تزيد أعمارهم عن65 عاما 9,10. يمثل الأفراد المسنون غالبية (>75٪) من الوفيات الناجمة عن الالتهاب الرئوي والإنفلونزا ، مما يشير إلى أن عاملي الخطر - الشيخوخة وعدوى IAV - يؤديان إلى تفاقم قابلية المرض بشكل تآزري11،12،13،14. ومع ذلك ، فإن الآليات التي تدفع بها العدوى الفيروسية انتقال المكورات الرئوية من مستعمر بدون أعراض إلى مسببات الأمراض الغازية وكيف يتم تشكيل ذلك من خلال العوامل المضيفة لا تزال غير محددة بشكل جيد. ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى عدم وجود نموذج حيواني صغير يلخص الانتقال من استعمار المكورات الرئوية بدون أعراض إلى مرض سريري حرج.
تم تصميم دراسات العدوى المشتركة بشكل كلاسيكي في الفئران الملقحة بالمكورات الرئوية مباشرة في الرئتين بعد 7 أيام من الإصابة بالأنفلونزا15,16. هذا يعيد إنتاج القابلية للإصابة بالالتهاب الرئوي الجرثومي الثانوي وهو مثالي لدراسة كيفية إضعاف الاستجابات المناعية المضادة للفيروسات للدفاعات المضادة للبكتيريا17. ومع ذلك ، فقد أظهرت الدراسات الطولية في البشر أن نقل المكورات الرئوية في البلعوم الأنفي ، حيث يمكن للبكتيريا أن تشكل الأغشية الحيوية عديمة الأعراض18 ، يرتبط بشكل موحد بالأمراض الغازية 19,20. العزلات البكتيرية الناتجة عن التهابات الأذن الوسطى والرئة والدم متطابقة وراثيا مع تلك الموجودة في البلعوم الأنفي20. وهكذا ، لدراسة الانتقال من النقل بدون أعراض إلى المرض الغازي بعد عدوى IAV ، تم إنشاء نموذج تم فيه إعطاء الفئران عن طريق الأنف المكورات الرئوية المزروعة بالأغشية الحيوية تليها عدوى IAV للبلعوم الأنفي21,22. أدت العدوى الفيروسية في مجرى الهواء العلوي إلى تغيرات في البيئة المضيفة أدت إلى تشتت المكورات الرئوية من الأغشية الحيوية وانتشارها إلى الشعب الهوائية السفلية21. كانت هذه البكتيريا المشتتة قد نظمت التعبير عن عوامل الفوعة المهمة للعدوى ، وتحويلها من مستعمرين إلى مسببات الأمراض21. تسلط هذه الملاحظات الضوء على التفاعل المعقد بين الفيروس والمضيف والبكتيريا وتثبت أن التغييرات التي تطرأ على المضيف والتي تسببها العدوى الفيروسية لها تأثير مباشر على سلوك المكورات الرئوية ، والذي بدوره يغير مسار العدوى البكتيرية. ومع ذلك ، فشل هذا النموذج في تلخيص العلامات الشديدة للمرض التي لوحظت في البشر ، على الأرجح لأن الفيروس يقتصر على تجويف الأنف ، ولم يتم تلخيص الآثار الجهازية للعدوى الفيروسية على مناعة المضيف وتلف الرئة.
لقد أنشأنا مؤخرا نموذجا يتضمن التفاعل المعقد بين المضيف ومسببات الأمراض ولكنه يحاكي أيضا بشكل أوثق شدة المرض التي لوحظت في البشر23. في هذا النموذج ، تصاب الفئران أولا عن طريق الأنف بالمكورات الرئوية المزروعة بالأغشية الحيوية لإنشاء نقل بدون أعراض ، تليها عدوى IAV لكل من البلعوم الأنفي والرئتين. أدى ذلك إلى انتشار البكتيريا إلى الرئتين ، والتهاب رئوي ، ومرض تطور إلى الفتك في جزء صغير من الفئرانالشابة 23. أظهرت هذه الدراسة السابقة أن كلا من العدوى الفيروسية والبكتيرية غيرت دفاع المضيف: عززت العدوى الفيروسية الانتشار البكتيري ، وأضعف الاستعمار البكتيري السابق قدرة المضيف على التحكم في مستويات IAV الرئوية23. كشف فحص الاستجابة المناعية أن عدوى IAV قللت من النشاط المضاد للبكتيريا للعدلات ، في حين أن الاستعمار البكتيري أضعف استجابة الإنترفيرون من النوع الأول الحاسمة للدفاع المضاد للفيروسات23. الأهم من ذلك ، أن هذا النموذج أعاد إنتاج قابلية الشيخوخة. بالمقارنة مع الفئران الشابة ، أظهرت الفئران المسنة علامات المرض في وقت سابق ، وأظهرت مرضا سريريا أكثر حدة ، واستسلمت للعدوى بشكل متكرر23. يظهر العمل المقدم في هذه المخطوطة أن درجة المرض تعتمد أيضا على السلالة البكتيرية ، لأن سلالات المكورات الرئوية الغازية تظهر انتشارا أكثر كفاءة عند الإصابة بعدوى IAV ، وتظهر علامات أكثر وضوحا للالتهاب الرئوي ، وتؤدي إلى تسارع معدلات المرض مقارنة بالسلالات غير الغازية. وهكذا، فإن نموذج العدوى المشتركة للمكورات الرئوية/داء السيليكون المستقل يسمح بالفحص التفصيلي لكل من العوامل الممرضة والعوامل المضيفة، وهو مناسب تماما لدراسة الاستجابات المناعية للعدوى المتعددة الميكروبات في المراحل المختلفة لتطور المرض.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-Aminobenzoic acid&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1267318</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>650101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-201-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC147440250</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501785325</td>
			<td>Microcyrstalline cellulose&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix Fixation Buffer&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BDB554655</td>
			<td>Fixation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Fortessa</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene Tubing&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>427410</td>
			<td>Tubing for nasal lavage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (1 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Microtainer Capillary Blood Collector and BD Microgard Closure</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-675-185</td>
			<td>Blood collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6233703</td>
			<td>Mix IV stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC230090010</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>#000644</td>
			<td>Mice used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C77-500</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD103 BV 421</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB562771</td>
			<td>Clone: M290 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>50-112-9622</td>
			<td>Clone: M1/70, DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB565592</td>
			<td>Clone: N418 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 AF 488</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>OB153030</td>
			<td>Clone: 145-2C11 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 V450</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>BDB560470</td>
			<td>Clone: RM4.5 DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 APC eF-780</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-9642</td>
			<td>Clone: 30-F11 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 PE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>50-103-70</td>
			<td>Clone: 30-F11 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#945; BV 650</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>BDB563234</td>
			<td>Clone: 53-6.7 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC110290500</td>
			<td>Final supplement to CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-761-107</td>
			<td>Filter sterilzation apparatus&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Tissue Culture Treated T-25 Flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-126-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Clear Multiple Well Plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-201-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;DMEM With L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose; Without Sodium Pyruvate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT10017CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanocobalamin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC405925000</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D39</td>
			<td>National Collection of Type Culture (NCTC)</td>
			<td>NCTC 7466</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Alanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1023114</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Calcium pantothenate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC243301000</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical&#160;</td>
			<td>LS002147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagles Minimum Essential Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4616-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EF3030</td>
			<td>Center for Disease Control and Prevention&#160;</td>
			<td>Available via the isolate bank request</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae strain, request using strain name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F480 PE Cy7</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-9713</td>
			<td>Clone: BMB DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>50 mL round bottom tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td>15 mL round bottom tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;Round-Bottom Polystyrene Test Tubes (5 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-5</td>
			<td>FACS tubes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric Nitrate Nonahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>I110-100</td>
			<td>Mix III stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Delicate Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-951-5</td>
			<td>Instruments used for harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable Inoculating Loops&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-602</td>
			<td>Inoculating loops&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Dissecting Tissue Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-812-38</td>
			<td>Forceps for harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-137</td>
			<td>Micocentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Sterile Syringes for Single Use (10 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC216630500</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI 1640 (ATCC)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A1049101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14025134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;MEM (Temin&#39;s modification) (2x), no phenol red</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-935-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>25-200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AA3643530</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1202414</td>
			<td>Mix II stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen UltraComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-112-9040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1517836</td>
			<td>Mix III stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6027918</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1573814</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAB2147322</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1352022</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1043518</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1038914</td>
			<td>Final supplement to CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cystine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1376218</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC156211000</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O2956-100</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC166150250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>50-112-1524</td>
			<td>Clone: N/A DF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC166170250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP385-100</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6222514</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1031822</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low endotoxin BSA&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A1470-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1323814</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1019922</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC132660250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC138930250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1023014</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1272014</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6C BV 605</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB563011</td>
			<td>Clone: AL-21 DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6G AF 488&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>NC1102120</td>
			<td>Clone: IA8, DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td>MDCK cell line for PFU analuysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate 7-Hydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>60-019-68</td>
			<td>CDM starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M113-500</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Fc Block</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB553142</td>
			<td>Clone: 2.4G2 DF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MWI VETERINARY&#160;PURALUBE VET OINTMENT</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC1886507</td>
			<td>Eye lubricant for infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCI-H292 mucoepidermoid carcinoma cell line&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1848</td>
			<td>H292 lung epithelial cell line for biofilm growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacinamide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>18-604-792</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK 1.1 AF 700</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-4692</td>
			<td>Clone: PK136 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxyrase For Broth 50Ml Bottle 1/Pk</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-200-5299</td>
			<td>To remove oxygen from liquid cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4% in PBS</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>J19932-K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pivetal Isoflurane&#160;</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-8440</td>
			<td>Isoflurane for anesthesia during infection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P285-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal hydrochloride&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC352710250</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxamine dihydrochloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6267906</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC132350250</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0530-500G</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP922I-500</td>
			<td>For FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>Starter stock and final supplement to CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR APC&#160;</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-8889</td>
			<td>Clone: GL-3 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; APC-Cy7</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>BDB560656</td>
			<td>Clone: H57-597 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Blood Agar with Gentamicin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>R01227</td>
			<td>Blood agar plates with the antibiotic gentamicin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Trypsin, TPCK Treated</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PI20233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine hydrochloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC148991000</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIGR4</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>BAA-334</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC157300250</td>
			<td>Mix II stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worthington Biochemical Corporation&#160;Collagenase, Type 2, 1 g</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9693955</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model for the transition of streptococcus pneumoniae from colonizer to pathogen upon viral co-infection recapitulates age-exacerbated illness

العقدية الرئوية (المكورات الرئوية) هي مستعمر بدون أعراض للبلعوم الأنفي في معظم الأفراد ولكن يمكن أن تتطور إلى مسببات الأمراض الرئوية والجهازية عند الإصابة بفيروس الأنفلونزا A (IAV). يعزز التقدم في العمر قابلية المضيف للإصابة بالالتهاب الرئوي الثانوي بالمكورات الرئوية ويرتبط بتفاقم نتائج المرض. العوامل المضيفة التي تقود هذه العمليات ليست محددة بشكل جيد ، ويرجع ذلك جزئيا إلى نقص النماذج الحيوانية التي تعيد إنتاج الانتقال من الاستعمار بدون أعراض إلى المرض السريري الشديد. 
تصف هذه الورقة نموذجا جديدا للفأر يعيد إنشاء انتقال المكورات الرئوية من النقل بدون أعراض إلى المرض عند الإصابة الفيروسية. في هذا النموذج ، يتم تلقيح الفئران أولا عن طريق الأنف بالمكورات الرئوية المزروعة بالأغشية الحيوية لإنشاء نقل بدون أعراض ، تليها عدوى IAV لكل من البلعوم الأنفي والرئتين. وهذا يؤدي إلى انتشار البكتيريا إلى الرئتين ، والتهاب رئوي ، وعلامات واضحة للمرض يمكن أن تتطور إلى الفتك. تعتمد درجة المرض على السلالة البكتيرية والعوامل المضيفة. 
الأهم من ذلك ، أن هذا النموذج يعيد إنتاج قابلية الشيخوخة ، لأنه بالمقارنة مع الفئران الشابة ، تظهر الفئران المسنة مرضا سريريا أكثر حدة وتستسلم للمرض بشكل متكرر. من خلال فصل النقل والمرض إلى خطوات متميزة وتوفير الفرصة لتحليل المتغيرات الجينية لكل من العامل الممرض والمضيف ، يسمح نموذج العدوى المشتركة S. pneumoniae / IAV هذا بالفحص التفصيلي لتفاعلات مرضي مهم مع المضيف في مراحل مختلفة من تطور المرض. يمكن أن يكون هذا النموذج أيضا بمثابة أداة مهمة لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة ضد الالتهاب الرئوي بالمكورات الرئوية الثانوية في المضيفين المعرضين للإصابة.

Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness at JoVE.

A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

تصف هذه الورقة نموذجا جديدا للفأر لانتقال المكورات الرئوية من مستعمر بدون أعراض إلى ممرض مسبب للأمراض أثناء العدوى الفيروسية. يمكن تكييف هذا النموذج بسهولة لدراسة التفاعلات متعددة الميكروبات والمضيف الممرض خلال المراحل المختلفة لتطور المرض وعبر المضيفين المختلفين.

نموذج فأر لانتقال العقدية الرئوية من المستعمر إلى العامل الممرض عند العدوى الفيروسية المشتركة يلخص المرض المتفاقم حسب العمر

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an asymptomatic colonizer of the nasopharynx in most individuals but can progress to a pulmonary and systemic ...

تصف هذه الطريقة نموذجا جديدا للفأر لدراسة انتقال المكورات الرئوية من مستعمر بدون أعراض إلى ممرض مسبب للأمراض أثناء العدوى الفيروسية. إنه يحاكي بشكل وثيق ما يحدث في البشر. يمكن أن يكون هذا النموذج أداة مهمة لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة ضد الالتهاب الرئوي بالمكورات الرئوية الثانوية في المضيفين المعرضين للإصابة.هذا النموذج يعيد إنتاج قابلية الشيخوخة. لذلك ، يمكن استخدامه لفهم جوانب المضيف التي تصبح معيبة مع تقدم العمر والسماح لنا بتخصيص خيارات العلاج للمضيفين المسنين الضعفاء. يمثل نمو الأغشية الحيوية للمكورات الرئوية تحديا لأن السلالات المختلفة تستغرق فترات زمنية مختلفة.نصيحتي هي محاولة زراعة الأغشية الحيوية قبل تنفيذ الدراسة على الحيوانات. بمجرد أن تصبح خلايا H292 متقاربة بنسبة 100٪ ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. ثم أضف 250 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد لكل بئر لإصلاح الخلايا واحتضانها لمدة ساعة واحدة على الجليد أو طوال الليل عند أربع درجات مئوية.سلالة Strake streptococcus pneumoniae ذات أهمية على صفيحة أجار الدم وتحضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، قم بتلقيح البكتيريا من اللوحة إلى وسائط جديدة محددة كيميائيا أو CDM plus Oxyrase عن طريق غسل البكتيريا من اللوحة عن طريق إضافة ملليلتر واحد من CDM plus Oxyrase ورفع المستعمرات البكتيرية برفق باستخدام جانب طرف ماصة واحد ملليلتر ، مع الحرص على عدم كشط الآجار. تمييع الثقافة البكتيرية في CDM بالإضافة إلى Oxyrase إلى OD 600 بدءا من 0.05.ثم تنمو البكتيريا في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر مغطى بشكل فضفاض عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى يتم الوصول إلى OD من 0.2. الدوامة التالية أنبوب الثقافة البكتيرية. بذر 0.5 ملليلتر من المزرعة على خلايا H292 الثابتة وإضافة 0.5 ملليلتر أخرى من CDM بالإضافة إلى وسط Oxyrase لكل بئر.أضف CDM بالإضافة إلى Oxyrase إلى آبار التحكم الخالية من البكتيريا. احتضان اللوحة لمدة 48 ساعة عند 34 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. كل 12 ساعة ، بعد البذر الأولي ، استبدل برفق 0.5 ملليلتر من الوسط بآلية التنمية النظيفة الطازجة بالإضافة إلى Oxyrase.احرص على عدم تعطيل تكوين الأغشية الحيوية. تحقق من الجزء السفلي من اللوحة بحثا عن الأغشية الحيوية وابحث عن زيادة الغيوم مع مرور الوقت بسبب نمو الأغشية الحيوية. بعد 48 ساعة ، قم بإزالة المادة الطافية وغسل الغشاء الحيوي مرتين باستخدام ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني.ثم أعد تعليق الغشاء الحيوي في ملليلتر واحد من آلية التنمية النظيفة الطازجة والماصة لأعلى ولأسفل بقوة لرفع الغشاء الحيوي. لكل سلالة بكتيرية ، قم بتجميع الثقافة من جميع الآبار في أنبوب 50 ملليلتر. تخلط جيدا عن طريق إمالة الأنبوب المغطى بإحكام برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات.بعد ذلك ، أضف 40٪ من الجلسرين و CDM بأحجام متساوية لتحقيق تعليق بكتيري بتركيز نهائي يبلغ 20٪ جلسرين. قسمة ملليلتر واحد في أنبوب طرد مركزي صغير ، وتجميد فلاش على الثلج الجاف ، وتوفير في ناقص 80 درجة مئوية. قم بإذابة الأغشية الحيوية المزروعة على الجليد وقم بتدويرها عند 1،700 جم لمدة خمس دقائق.قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها بعناية دون تعطيل الحبيبات. ثم اغسل الحبيبات عن طريق تعليقها في ملليلتر واحد من PBS وقم بتدويرها مرة أخرى. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات بالحجم المطلوب للوصول إلى التركيز المطلوب.قم بتلقيح الفأر الأسود C57 المكون من ستة ذكور داخل الأنف بخمس مرات 10 إلى وحدات تشكيل المستعمرة السادسة أو CFU عن طريق سحب خمسة ميكرولترات من اللقاح المخفف في كل ناريس. بعد التلقيح ، أمسك الماوس بإحكام ، وثبت الرأس حتى يتم استنشاق الحجم. بمجرد ذوبان الفيروس ، قم بتخفيف الفيروس في برنامج تلفزيوني إلى التركيز المطلوب.ضع مادة تشحيم العيون على عيون الفأر قبل التخدير. تصيب الفأر المخدر على الفور ب 50 ميكرولترا من 20 وحدة تشكيل البلاك ، أو PFU ، من فيروس الأنفلونزا A أو IAV داخل القصبة الهوائية باستخدام ملاقط حادة لسحب اللسان من الفم وسحب حجم السائل أسفل القصبة الهوائية. بعد الشفاء ، تلقيح 10 ميكرولتر من 200 PFU من IAV باستخدام طريقة التلقيح الموضحة سابقا.لجمع الرئة ، باستخدام مقص التشريح ، قم بقطع جوانب القفص الصدري المكشوف واسحب الأضلاع برفق نحو رأس الفأر لكشف القلب. أدخل إبرة قياس 25 متصلة بحقنة سعة 10 ملليلتر مملوءة مسبقا ب PBS في البطين الأيمن وابدأ في التعتيم ببطء. ابحث عن تبييض الرئتين كمؤشر على التروية الناجحة.احمر ببطء لتجنب كسر الأنسجة الرئوية. ارفع القلب بالملقط وقم بعمل قطع لفصل الرئتين والقلب. بمجرد الانفصال ، التقط جميع فصوص الرئة بالملقط واشطفها في طبق به برنامج تلفزيوني معقم لإزالة أي دم متبقي.في طبق بتري ، يفرم الرئة إلى قطع صغيرة ويخلط جيدا. قم بإزالة نصف مزيج الرئة لتحديد CFU البكتيري أو PFU الفيروسي ووضعه في أنبوب دائري القاع 15 ملليلتر مملوء مسبقا ب 0.5 ملليلتر من PBS للتجانس. قم بإزالة النصف الآخر من الرئة لقياس التدفق الخلوي ووضعه في لوحة 24 بئرا معالجة بزراعة الأنسجة مع كل بئر مملوء مسبقا ب 0.5 ملليلتر من RP10.اتركيه في درجة حرارة الغرفة حتى المعالجة. لتجانس الأنسجة التي تم جمعها ، قم بتنظيف مسبار الخالط عن طريق وضعه في 70٪ من الإيثانول وتشغيل الخالط بقوة 60٪ لمدة 30 ثانية. كرر هذه الخطوة في الماء المعقم لمدة 10 ثوان.تجانس كل الأنسجة لمدة دقيقة واحدة. لتعداد الأرقام البكتيرية ، التخفيفات التسلسلية لوحة على لوحات أجار الدم. لحساب إجمالي CFU ، استخدم 10 ميكرولتر للوحة ولاحظ الحجم النهائي بالملليلتر لكل عينة.صفيحة عينات البلعوم الأنفي على ألواح أجار الدم تستكمل بثلاثة ميكروغرام لكل ملليلتر جنتاميسين لتحديد نمو S الرئوية مع تثبيط نمو الكائنات الحية الدقيقة الأخرى. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون. لقياس التدفق الخلوي ، أضف 500 ميكرولتر من محلول الهضم إلى كل بئر من صفيحة 24 بئرا تحتوي على عينة من الرئة.احتضان اللوحة لمدة 45 دقيقة إلى ساعة واحدة. بعد ذلك ، باستخدام ماصة صغيرة P-1000 ، حرك الرئتين المهضومتين وضعهما على الفلتر. ثم استخدم مكبس حقنة ثلاثة ملليلتر لهرس العينة.يؤدي نمو الأغشية الحيوية للقاح S.pneumoniae إلى نقل متسق للمكورات الرئوية يقتصر على البلعوم الأنفي مع تجنب الانتشار المنهجي. كان عرض المرض في الفئران المصابة بعدوى S pneumoniae IAV يعتمد على السلالة البكتيرية. في حين لم يكن هناك فرق كبير في أعداد البكتيريا من البلعوم الأنفي بين أي من السلالات ، S الرئوية ، TIGR4 ، و D39 ، ولكن ليس EF3030 انتشرت إلى الرئتين لمدة 48 ساعة بعد الإصابة IAV.40٪ من الفئران المصابة ب S pneumoniae TIGR4 أظهرت انتشارا بكتيريا إلى الرئتين ونصفها أصبح جراثيما. أظهرت الفئران المصابة ب S pneumoniae D39 انتشارا بنسبة 100٪ إلى الرئتين ونصف ذلك عانى من تجرثم الدم. في تتبع البقاء على قيد الحياة بشكل عام ، بغض النظر عن السلالة البكتيرية ، كان معدل بقاء الفئران المصابة بالعدوى المشتركة أقل بكثير من الفئران التي تم تحديها بشكل فردي مع S pneumoniae.تم استخدام هذا النموذج أيضا لتقييم وجود خلايا مناعية مختلفة في الرئتين بعد عدوى IAV. أثارت السلالات البكتيرية D39 و TIGR4 زيادة كبيرة فوق خط الأساس في تدفق الخلايا المناعية الالتهابية من الدورة الدموية ، مثل العدلات والوحيدات ، في حين أن EF3030 لم تفعل ذلك. أثارت عدوى IAV وحدها زيادة كبيرة فوق خط الأساس في تدفق الخلايا المناعية مثل الخلايا القاتلة الطبيعية وخلايا جاما دلتا التائية.تم إضعاف هذه الاستجابات المضادة للفيروسات بشكل كبير في الفئران المصابة عن طريق الأنف ب S pneumoniae قبل التحدي الفيروسي. في الفئران المصابة منفردة ، لم يختلف التتر الفيروسي بين الأفواج الصغيرة والمسنين. أظهرت الفئران المسنة علامات مرض مبكرة وأكثر حدة بشكل ملحوظ وماتت بشكل أسرع ، في غضون 24 ساعة ، في حين نجت الضوابط الصغيرة من العدوى بشكل أفضل.يسمح لنا فصل النقل والمرض إلى خطوات متميزة بفحص كل من الاستجابة المناعية والعوامل البكتيرية و / أو الفيروسية المهمة في المراحل المختلفة من تطور المرض. نأمل أن يتم تكييف هذا النموذج من قبل مختبرات أخرى لدراسة التفاعلات الأخرى متعددة الميكروبات وتفاعلات مسببات الأمراض المضيفة خلال المراحل المختلفة من تطور المرض وعبر المضيفين المختلفين.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

باستخدام التصوير Bioluminescent بالتحقيق في التآزر بين العقدية الرئوية والأنفلونزا من الفيروسات في الفئران الرضع

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

تعيش خلية من التصوير<emالعصوية الرقيقة> و العقدية الرئوية الآلي باستخدام الميكروسكوب مرور الزمن

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

استخدام نموذج لوصف EpiAirway طويل الأجل المضيف الممرض التفاعلات

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

ال<em&gt; الليمونية rodentium</em&gt; نموذج الفأر: دراسة العوامل الممرضة والمضيفة المساهمات في التهاب القولون المعدية

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

توصيف الاستجابات الالتهابية خلال الاستعمار داخل الشرج مع الالتهاب الرئوي العقدي

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

رصد التغيرات في غشاء التقاطب، غشاء النزاهة، وبين الخلايا ايون التركيزات في<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; استخدام الأصباغ نيون

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

المحفظة المصلي من<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; باستخدام تفاعل الانتباج

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

نموذج الفأر لالتهاب الناجم عن مسببات الأمراض المزمنة في مواقع المحلية والجهازية

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

المحفظة المصلي من<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; من جانب تراص اللاتكس

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لقياس الاستجابات المناعية لمكافحة الملاريا في سياق الفيروس المسبب للإيدز

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...