Name: a mouse model for the transition of streptococcus pneumoniae from colonizer to pathogen upon viral co-infection recapitulates age-exacerbated illness
Uploaded: 2022-09-28T14:15:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness at JoVE.

我们要感谢尼克·伦哈德对这份手稿的批判性阅读和编辑。我们还要感谢Andrew Camilli和Anthony Campagnari的细菌菌株和Bruce Davidson的病毒菌株。这项工作得到了国家卫生研究院对J.L.的拨款（R21AG071268-01）和国家卫生研究院对E.N.B.G.的资助（R21AI145370-01A1），（R01AG068568-01A1），（R21AG071268-01）的支持。

作者没有利益冲突需要披露。

大多数现有的肺炎链球菌/IAV混合感染实验研究依赖于细菌递送到感染IAV的小鼠肺部。这些模型有助于识别肺部环境和全身免疫反应的变化，使宿主容易发生继发性细菌感染15，16，17，32，33，34，35，36，37。然而，这些模型未能模拟肺炎链球菌从无症状定植者转变为能够引起严重肺部和全身感染的病原体。此外，这些模型不适合研究上呼吸道中导致感染易感性的宿主因素和宿主-病原体相互作用。IAV感染后肺炎球菌从鼻咽移动到肺部的先前模型依赖于鼻咽细菌感染，然后是病毒感染。然而，它未能重现在人类患者中观察到的严重疾病迹象21。这里描述的改良鼠感染模型概括了肺炎链球菌从无症状携带到导致严重临床疾病的病原体的转变。
该模型的一个关键步骤是确定鼻咽部的肺炎链球菌感染。肺炎链球菌形成生物膜并以不同的效率定植鼻咽21，38。为了建立一致的感染，至少需要5 × 106 CFU的生物膜生长细菌菌株迄今为止测试23。建议在病毒感染之前检测任何新的细菌菌株是否稳定感染鼻咽。对于病毒合并感染，先前的研究发现，鼻内IAV感染是鼻咽细菌从鼻咽21，22，23传播所必需的。在之前的研究中，使用500 PFU的IAV用于鼻内输送，而在本研究中，200 PFU足以增加鼻咽中的细菌数量。IAV感染不仅限于上呼吸道，还可以扩散到肺部39，40，这是使肺部环境更易于细菌感染的关键15，16，41。IAV向肺部的递送可以通过鼻内递送或麻醉小鼠的气管内安装来实现。先前对BALB / cByJ小鼠的研究发现鼻内递送导致病毒性肺炎21;然而，在C57BL / 6小鼠中，鼻内接种后接种物进入肺部的途径受到更多限制。在C57BL / 6小鼠中，需要气管内安装以一致地传递病毒23。在该模型中，先前的细菌定植加速了病毒感染后疾病症状的呈现23。由于病毒感染本身可引起疾病症状，动力学可能发生变化，因此建议首先测试任何新病毒株的剂量范围，并选择揭示混合感染宿主中加速动力学的剂量。
在该模型中，肺为疾病评估提供了另一个关键读数。为了评估病原体负荷和免疫细胞内流，可以使用来自同一只小鼠的肺。但是，由于不同肺叶之间的感染和炎症严重程度可能不同，因此建议不要将同一肺的不同肺叶用于各种评估。相反，所有的裂片都可以切成小块，混合在一起，然后平均解析出来以进行不同的评估。同样，鼻咽可用于细菌CFU或病毒PFU的计数和免疫应答。然而，从洗涤液和组织中获得的细胞数量太少，无法在不汇集来自同一组小鼠的样品的情况下进行流式细胞术。或者，可以组织学评估鼻咽部炎症23。
该模型的一个关键特征是它概括了患者身上看到的临床疾病。在人类中，IAV 感染后的继发性肺炎球菌肺炎通常会导致明显的疾病体征，包括咳嗽、呼吸困难、发烧和肌肉酸痛，可导致住院、呼吸衰竭甚至死亡8，15，42，43。该模型概括了在人类中观察到的临床疾病的严重迹象，包括小鼠表现出的呼吸困难（反映在呼吸评分）和整体不适（反映在姿势和运动评分中），以及一些健康的年轻对照组的死亡。合并感染小鼠的疾病症状加重可能是细菌传播到肺部和肺炎球菌携带小鼠病毒清除受损的结果23。该模型的局限性在于，临床疾病和鼻咽细菌传播的发生率因小鼠而异，并受细菌菌株、宿主年龄和基因型21、22、23 的影响。反映这一点，对于侵袭性菌株，从局部感染（没有检测到的菌血症）到死亡的进展可以在24小时内发生。因此，为了真正评估全身传播，应在较短的时间间隔内（每6-12小时）随访菌血症。同样，疾病评分可以迅速变化，特别是在合并感染后的前 72 小时内。因此，为了密切跟踪疾病症状，建议在IAV感染后第1-3天每天监测小鼠三次。
总之，该模型复制了 肺炎链球菌 从鼻咽的无症状定植者到能够在IAV感染时引起肺部和全身疾病的病原体的移动。在该模型中，IAV通过改变鼻咽中的细菌行为，增加细菌向肺部的传播以及改变抗菌免疫力 来触发肺炎链球菌 的转变23。同样，细菌携带会减弱抗病毒免疫反应并损害肺部的IAV清除率23。这使得该模型非常适合分析单一感染与多种微生物感染中免疫反应的变化。此外，合并感染后的病程部分取决于鼻咽部存在的肺炎球菌菌株。因此，该模型适用于剖析 肺炎链球菌 无症状定植与致病性转化所需的细菌因素。最后，该模型再现了衰老对合并感染的易感性，尽管此处未对其进行测试，但它可以很容易地用于评估宿主背景对疾病过程的影响。总之，将携带和疾病分成不同的步骤提供了分析病原体和宿主的遗传变异的机会，从而可以详细检查重要病理剂在疾病进展不同阶段与宿主的相互作用。展望未来，该模型可用于为易受攻击的宿主量身定制治疗方案。

肺炎链球菌（肺炎球菌）是革兰氏阳性细菌，无症状地存在于大多数健康个体的鼻咽中1，2。在尚未完全确定的因素的促进下，肺炎球菌可以从鼻咽的良性定植者转变为扩散到其他器官的病原体，从而导致严重感染，包括中耳炎、肺炎和菌血症3。肺炎球菌疾病的表现部分取决于菌株特异性差异，包括基于荚膜多糖组成的血清型。到目前为止，已经有100多种血清型被鉴定，其中一些与更具侵袭性的感染有关4，5。其他几个因素会增加肺炎球菌疾病的风险。其中一个因素是病毒感染，其中肺炎球菌肺炎的风险增加 100 倍 IAV6，7。从历史上看，肺炎链球菌是流感后继发性细菌性肺炎的最常见原因之一，并且与更差的结果有关8。另一个主要危险因素是高龄。事实上，肺炎链球菌是65岁以上老年人社区获得性细菌性肺炎的主要原因9，10。老年人占肺炎和流感死亡的大多数（>75%），表明衰老和IAV感染这两个危险因素协同恶化疾病易感性11，12，13，14。然而，病毒感染促使肺炎球菌从无症状定植者转变为侵袭性病原体的机制以及宿主因素如何塑造的机制仍然不清楚。这主要是由于缺乏一个小动物模型来概括从无症状肺炎球菌定植到危重临床疾病的转变。
在流感感染后 7 天直接将肺炎球菌接种到肺部的小鼠中，经典地模拟了合并感染研究15，16。这再现了对继发性细菌性肺炎的易感性，是研究抗病毒免疫反应如何损害抗菌防御的理想选择17。然而，对人类的纵向研究表明，鼻咽部肺炎球菌携带，细菌可以形成无症状的生物膜18，与侵袭性疾病19，20一致相关。来自中耳、肺和血液感染的细菌分离株在基因上与鼻咽20 中发现的细菌分离株相同。因此，为了研究IAV感染后从无症状携带到侵袭性疾病的转变，建立了一个模型，其中小鼠鼻内施用生物膜生长的肺炎球菌，然后鼻咽部IAV感染21，22。上呼吸道的病毒感染导致宿主环境发生变化，导致肺炎球菌从生物膜中扩散并扩散到下呼吸道21。这些分散的细菌上调了对感染很重要的毒力因子的表达，将它们从定植者转化为病原体21。这些观察结果突出了病毒、宿主和细菌之间的复杂相互作用，并表明病毒感染引发的宿主变化对肺炎球菌行为有直接影响，这反过来又改变了细菌感染的过程。然而，该模型未能概括在人类中观察到的严重疾病迹象，可能是因为病毒仅限于鼻腔，并且病毒感染对宿主免疫和肺损伤的全身影响没有被概括。
我们最近建立了一个模型，该模型结合了宿主和病原体之间的复杂相互作用，但也更贴近地模仿了在人类中观察到的疾病严重程度23。在该模型中，小鼠首先鼻内感染生物膜生长的肺炎球菌以建立无症状携带，然后鼻咽和肺部的IAV感染。这导致细菌传播到肺部，肺部炎症和疾病在一小部分年轻小鼠中发展为致死率23。先前的研究表明，病毒和细菌感染都改变了宿主的防御：病毒感染促进了细菌传播，先前的细菌定植损害了宿主控制肺部IAV水平的能力23。检查免疫反应显示，IAV感染降低了中性粒细胞的抗菌活性，而细菌定植削弱了对抗病毒防御至关重要的I型干扰素反应23。重要的是，该模型再现了衰老的易感性。与年轻小鼠相比，老年小鼠表现出更早的疾病迹象，表现出更严重的临床疾病，并且更频繁地死于感染23。本手稿中介绍的工作表明，疾病程度也取决于细菌菌株，因为与非侵入性菌株相比，侵袭性肺炎球菌菌株在IAV感染时显示出更有效的传播，显示出更明显的肺部炎症迹象，并导致疾病发病率加快。因此，这种 肺炎链球菌/IAV混合感染模型允许详细检查病原体和宿主因素，并且非常适合研究疾病进展不同阶段对多种微生物感染的免疫反应。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-Aminobenzoic acid&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1267318</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>650101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-201-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC147440250</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501785325</td>
			<td>Microcyrstalline cellulose&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix Fixation Buffer&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BDB554655</td>
			<td>Fixation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Fortessa</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene Tubing&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>427410</td>
			<td>Tubing for nasal lavage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (1 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Microtainer Capillary Blood Collector and BD Microgard Closure</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-675-185</td>
			<td>Blood collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6233703</td>
			<td>Mix IV stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC230090010</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>#000644</td>
			<td>Mice used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C77-500</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD103 BV 421</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB562771</td>
			<td>Clone: M290 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>50-112-9622</td>
			<td>Clone: M1/70, DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB565592</td>
			<td>Clone: N418 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 AF 488</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>OB153030</td>
			<td>Clone: 145-2C11 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 V450</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>BDB560470</td>
			<td>Clone: RM4.5 DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 APC eF-780</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-9642</td>
			<td>Clone: 30-F11 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 PE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>50-103-70</td>
			<td>Clone: 30-F11 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#945; BV 650</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>BDB563234</td>
			<td>Clone: 53-6.7 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC110290500</td>
			<td>Final supplement to CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-761-107</td>
			<td>Filter sterilzation apparatus&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Tissue Culture Treated T-25 Flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-126-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Clear Multiple Well Plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-201-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;DMEM With L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose; Without Sodium Pyruvate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT10017CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanocobalamin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC405925000</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D39</td>
			<td>National Collection of Type Culture (NCTC)</td>
			<td>NCTC 7466</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Alanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1023114</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Calcium pantothenate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC243301000</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical&#160;</td>
			<td>LS002147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagles Minimum Essential Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4616-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EF3030</td>
			<td>Center for Disease Control and Prevention&#160;</td>
			<td>Available via the isolate bank request</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae strain, request using strain name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F480 PE Cy7</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-9713</td>
			<td>Clone: BMB DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>50 mL round bottom tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td>15 mL round bottom tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;Round-Bottom Polystyrene Test Tubes (5 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-5</td>
			<td>FACS tubes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric Nitrate Nonahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>I110-100</td>
			<td>Mix III stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Delicate Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-951-5</td>
			<td>Instruments used for harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable Inoculating Loops&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-602</td>
			<td>Inoculating loops&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Dissecting Tissue Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-812-38</td>
			<td>Forceps for harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-137</td>
			<td>Micocentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Sterile Syringes for Single Use (10 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC216630500</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI 1640 (ATCC)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A1049101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14025134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;MEM (Temin&#39;s modification) (2x), no phenol red</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-935-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>25-200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AA3643530</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1202414</td>
			<td>Mix II stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen UltraComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-112-9040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1517836</td>
			<td>Mix III stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6027918</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1573814</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAB2147322</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1352022</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1043518</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1038914</td>
			<td>Final supplement to CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cystine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1376218</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC156211000</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O2956-100</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC166150250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>50-112-1524</td>
			<td>Clone: N/A DF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC166170250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP385-100</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6222514</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1031822</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low endotoxin BSA&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A1470-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1323814</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1019922</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC132660250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC138930250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1023014</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1272014</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6C BV 605</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB563011</td>
			<td>Clone: AL-21 DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6G AF 488&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>NC1102120</td>
			<td>Clone: IA8, DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td>MDCK cell line for PFU analuysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate 7-Hydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>60-019-68</td>
			<td>CDM starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M113-500</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Fc Block</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB553142</td>
			<td>Clone: 2.4G2 DF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MWI VETERINARY&#160;PURALUBE VET OINTMENT</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC1886507</td>
			<td>Eye lubricant for infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCI-H292 mucoepidermoid carcinoma cell line&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1848</td>
			<td>H292 lung epithelial cell line for biofilm growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacinamide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>18-604-792</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK 1.1 AF 700</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-4692</td>
			<td>Clone: PK136 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxyrase For Broth 50Ml Bottle 1/Pk</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-200-5299</td>
			<td>To remove oxygen from liquid cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4% in PBS</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>J19932-K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pivetal Isoflurane&#160;</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-8440</td>
			<td>Isoflurane for anesthesia during infection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P285-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal hydrochloride&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC352710250</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxamine dihydrochloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6267906</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC132350250</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0530-500G</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP922I-500</td>
			<td>For FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>Starter stock and final supplement to CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR APC&#160;</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-8889</td>
			<td>Clone: GL-3 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; APC-Cy7</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>BDB560656</td>
			<td>Clone: H57-597 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Blood Agar with Gentamicin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>R01227</td>
			<td>Blood agar plates with the antibiotic gentamicin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Trypsin, TPCK Treated</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PI20233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine hydrochloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC148991000</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIGR4</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>BAA-334</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC157300250</td>
			<td>Mix II stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worthington Biochemical Corporation&#160;Collagenase, Type 2, 1 g</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9693955</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model for the transition of streptococcus pneumoniae from colonizer to pathogen upon viral co-infection recapitulates age-exacerbated illness

肺炎链球菌（肺炎球菌）是大多数人鼻咽的无症状定植者，但在感染甲型流感病毒 （IAV） 后可进展为肺部和全身病原体。高龄会增加宿主对继发性肺炎球菌肺炎的易感性，并与疾病结局恶化有关。驱动这些过程的宿主因素尚未明确，部分原因是缺乏重现从无症状定植到严重临床疾病的转变的动物模型。
本文描述了一种新的小鼠模型，该模型重现了肺炎球菌在病毒感染后从无症状携带到疾病的转变。在该模型中，首先用生物膜生长的肺炎球菌鼻内接种小鼠以建立无症状携带，然后鼻咽和肺部的IAV感染。这导致细菌向肺部传播、肺部炎症和可进展为致命的明显疾病迹象。疾病程度取决于细菌菌株和宿主因素。 
重要的是，该模型再现了衰老的易感性，因为与年轻小鼠相比，老年小鼠表现出更严重的临床疾病并且更频繁地屈服于疾病。通过将携带和疾病分成不同的步骤，并提供分析病原体和宿主的遗传变异的机会，这种 肺炎链球菌/IAV合并感染模型允许详细检查重要病理在疾病进展的不同阶段与宿主的相互作用。该模型还可以作为确定易感宿主继发性肺炎球菌肺炎潜在治疗靶点的重要工具。

生物膜生长的肺炎链球菌（图1A）用于感染小鼠（图1B），使用鼻内递送给未麻醉小鼠的10μL小接种物。这种小体积接种物导致一致的肺炎球菌携带仅限于鼻咽（图2A，+ sp组），同时避免全身传播（图2B，C，+ sp组）。鼻内接种两天后，小鼠感染小鼠适应的甲型H1N1流感病毒A / PR / 8 / 34（IAV）22，30鼻内和气管内递送，以实现向鼻咽和肺部一致递送特定量的23。
在这里，该模型用于比较鼻内受到不同肺炎链球菌菌株攻击的小鼠病毒感染后的病程，包括TIGR4和D39，它们是导致肺炎进展为菌血症的侵袭菌株，以及EF3030，这是一种中耳炎菌株21，24，25，26，31。肺炎链球菌/IAV混合感染小鼠的疾病表现取决于细菌菌株（图2）。虽然任何菌株之间的鼻咽细菌数量（图2A）没有显着差异，但肺炎链球菌TIGR4和D39，但没有EF3030，在IAV感染后48小时播散到肺部（图2B）。鼻内感染肺炎链球菌TIGR4的小鼠中有40%显示出细菌向肺部的传播，其中一半变得菌血症（图2C），与先前的发现一致23。
鼻内感染 肺炎链球菌 D39的小鼠显示出更有效的播散，因为在100%的合并感染小鼠中观察到扩散到肺部（图2B）。与 肺炎链球菌 TIGR4类似，其中一半经历了菌血症（图2C）。在跟踪总生存期时，无论细菌菌株如何，对于所有测试的菌株，合并感染小鼠的存活率显着低于单独使用 肺炎链球菌 的小鼠（图2D）。与单独使用IAV的对照小鼠相比，鼻内感染 肺炎链球菌 TIGR4和D39但未感染EF3030的小鼠显示出加速的疾病发生率。到IAV感染后第2天，30%（D39）和20%（TIGR4）的小鼠已经死亡，而仅IAV对照组直到激发后第5天才开始屈服（图2D）。同时感染 肺炎链球菌 EF3030和IAV的小鼠具有延迟症状，更类似于仅IAV对照（图2D）。这些发现表明，混合感染模型导致年轻健康小鼠的细菌菌株依赖性疾病，这使其成为探索疾病进展每一步所需的细菌因素的理想选择。
该模型用于评估鼻内接种不同肺炎链球菌菌株的小鼠在IAV感染后肺部各种免疫细胞（图3中的细胞类型和门控策略）的存在。在IAV感染后分散到肺部的细菌菌株D39和TIGR4引起来自循环的炎症免疫细胞（如中性粒细胞（PMN）和单核细胞）的流入显着增加，高于基线（未感染），而EF3030则没有（图4A-C）。仅IAV感染就引起对宿主防御病毒感染很重要的免疫细胞（如NK细胞和γ-δT细胞）的流入量显着高于基线（图4A-C）。在病毒攻击之前鼻内感染肺炎链球菌的小鼠中，这些抗病毒反应显着减弱（图4A-C）。这与先前评估细胞因子反应的研究一致，这些研究发现肺炎链球菌携带钝化了I型干扰素的产生，并损害了宿主控制肺部IAV负荷的能力23。这些发现表明，混合感染模型可用于研究单一与多种微生物感染中的免疫应答如何变化。
该模型还用于评估鼻内感染 肺炎链球菌 TIGR4的小鼠IAV感染后衰老对病程的影响。在单次感染的小鼠中，年轻和老年队列之间的病毒滴度没有变化（图5A）23。与先前的研究23一样，与年轻小鼠相比，老年小鼠表现出更早且明显更严重的疾病迹象，如较高的临床评分所示（图5B）。与疾病症状一致，接种 肺炎链球菌 的老年小鼠在IAV感染后24小时内开始更快地死亡，并且它们都死于该疾病，而年轻对照组在感染中存活率显着更高（33%）（图5C）。这些发现表明，混合感染模型可用于检测脆弱宿主中更严重的疾病，使其成为探索赋予共同感染抵抗力或易感性的宿主因素的理想选择。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64419/64419fig01.jpg"> 图1：用于评估免疫细胞流入和病原体负荷的混合感染和器官处理的时间表 。 （A） 肺炎链球菌 在生物膜中生长。（B）将小鼠鼻内接种5×106CFU 的指示生物膜生长的 肺炎链球菌 菌株以建立鼻咽携带或未经治疗。48小时后，小鼠要么用PBS模拟治疗，要么鼻内接受200 PFU的甲型流感病毒PR8和气管内20 PFU。随着时间的推移监测小鼠的临床疾病评分和存活率。（C）在IAV感染后48小时，评估不同器官中的细菌CFU或病毒PFU或肺部免疫细胞内流。缩写：CFU = 菌落形成单位;PFU = 斑块形成单位;IAV = 甲型流感病毒 PR8;IT = 气管内;NP = 鼻咽。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64419/64419fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64419/64419fig02.jpg"> 图2：接种肺炎链球菌的小鼠的鼻内/气管内双重IAV感染导致细菌传播和依赖于细菌菌株的疾病。 年轻（10-12周龄）雄性C57BL / 6（B6）小鼠感染如图1所示。（A）鼻咽，（B）肺和（C）血液中的细菌数量均在IAV感染后48小时测定。（乙，丙）百分比表示表现出传播的小鼠比例。（D）监测IAV感染后10天的生存率。显示来自（A，B）n = 5，（C）n = 11和（D）n = 6每组小鼠的合并数据。每个圆圈对应一个鼠标，虚线表示检测限制。（A-C） *，表示由克鲁斯卡尔-瓦利斯检验确定的指示组之间的显著差异（p < 0.05）。（D） *，表示通过对数秩（Mantel-Cox）测试确定的每种细菌菌株的+sp和Co-inf小鼠之间的显着差异（p < 0.05）。缩写：+sp =仅使用指定的菌株鼻内感染细菌的小鼠;Co-inf = 感染IAV的细菌感染小鼠;IAV = 接受甲型流感病毒的小鼠;CFU = 菌落形成单位。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64419/64419fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64419/64419fig03.jpg"> 图 3：免疫细胞门控策略。收获肺，通过流式细胞术测定免疫细胞内流。显示了不同细胞类型的代表性门控策略。（A）CD45+，活单细胞门控和（B）PMN（Ly6G +，CD11b +），巨噬细胞（Ly6G-，Ly6C-，F480+）和单核细胞（Ly6G-，Ly6C +），（C）DCs（Ly6G-，CD11c +）和NK细胞（NK1.1+，CD3-），（D）TCR-γΔ和CD8（CD8+，TCRβ+）和CD4（CD4+，TCRβ+） 测定 T 细胞。缩写：SSC-A = 侧散射峰面积;FSC-A = 前向散射峰面积;FSC-H = 前向散射峰高度;SSC-W = 侧散射峰宽度;L/D = 活/死;FMO = 荧光减一;NK = 自然杀手;PMN = 多形核白细胞;DC = 树突状细胞;TCR = T细胞受体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64419/64419fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64419/64419fig04.jpg"> 图4：肺部免疫反应依赖于细菌菌株。 年轻（10-12周龄）C57BL / 6雄性小鼠要么未感染，要么单独接种指定的 肺炎链球菌 菌株（+sp），单独攻击IAV（IAV），或同时感染 肺炎链球菌 和IAV（Co-inf）。IAV感染后48小时（见图 1中的实验设计），收获肺，按照 图3中的门控策略通过流式细胞术测定免疫细胞内流。（A）在热图上显示CD45门内每种指示细胞类型的平均百分比，用于所有治疗组。（B）显示每个小鼠组在处理之间显示显着差异的细胞类型的代表性点图。（C）显示了指示的免疫细胞类型的百分比。每个圆圈对应一个鼠标。（A，C）显示每组n = 5只小鼠的合并数据。*，表明Co-inf与未感染者之间存在显著差异（p < 0.05）; $，表示 IAV 和未感染之间有显著差异;#，表示Co-inf和IAV单独存在显着差异。每种细胞类型的激发组之间的显着差异由方差分析确定，然后通过Tukey测试确定。缩写：NK = 自然杀手;PMN = 多形核白细胞;DC = 树突状细胞;TCR = T细胞受体;IAV = 甲型流感病毒。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64419/64419fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64419/64419fig05.jpg"> 图5：老化和宿主对IAV /肺炎链球菌合并感染的易感性增加。年轻（10-12周）和年龄（21-22个月）C57BL / 6雄性小鼠同时感染肺炎链球菌TIGR4 i.n.和IAV i.n.和i.t.（如图1所示）或单独攻击IAV。（A）48小时后测定病毒滴度。星号表示由学生 t 检验确定的统计显著性 （p < 0.05）。数据从每组n = 4只小鼠合并。（B）随着时间的推移监测临床评分和（C）生存率。（B）显示每组n = 6只小鼠合并的平均±SEM。星号表示在由曼-惠特尼检验确定的指定时间点年轻小鼠与老年小鼠之间的统计学意义（p < 0.05）。（C）数据从每组n = 6只小鼠合并。星号表示由对数秩（Mantel-Cox）检验确定的年轻小鼠与老年小鼠之间的统计学意义（p < 0.05）。缩写：IAV = 甲型流感病毒;i.n. = 鼻内;I.T. = 气管内;SEM = 平均值的标准误差。图5A经Joma等人许可转载23。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64419/64419fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>混合 I 用于 CDM 的库存</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>腺嘌呤</td>
			<td>0.1 克</td>
		</tr><tr><td>D-丙氨酸</td>
			<td>0.25 克</td>
		</tr><tr><td>无水氯化钙2</td>
			<td>0.025 克</td>
		</tr><tr><td>硫酸锰</td>
			<td>0.03 克</td>
		</tr><tr><td>氰钴胺素</td>
			<td>100 μL 10 mg/mL 原液</td>
		</tr><tr><td>对氨基苯甲酸</td>
			<td>400 μL 5 mg/mL 原液</td>
		</tr><tr><td>吡哆胺2盐酸盐</td>
			<td>100 μL 10 mg/mL 原液</td>
		</tr><tr><td>用于清洁发展机制的混合II库存</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>鸟嘌呤</td>
			<td>0.05 克</td>
		</tr><tr><td>尿嘧啶</td>
			<td>0.05 克</td>
		</tr><tr><td>用于清洁发展机制的混合III库存</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>硝酸铁 9H2O</td>
			<td>50毫克/毫升</td>
		</tr><tr><td>硫酸铁 7H2O</td>
			<td>10毫克/毫升</td>
		</tr><tr><td>用于清洁发展机制的混合静脉注射原液</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸</td>
			<td>25毫克/毫升</td>
		</tr></tbody></table>表1：清洁发展机制混合一、二、三和四库存。 缩写：CDM = 化学成分明确的介质。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">用于清洁发展机制的维生素混合原料</td>
		</tr><tr><td>盐酸吡哆醛</td>
			<td>0.8 克</td>
		</tr><tr><td>硫胺素Cl 2</td>
			<td>0.4 克</td>
		</tr><tr><td>核黄素</td>
			<td>0.4 克</td>
		</tr><tr><td>钙泛酸</td>
			<td>0.4 克</td>
		</tr><tr><td>生物素</td>
			<td>0.04 克</td>
		</tr><tr><td>叶酸</td>
			<td>0.4 克</td>
		</tr><tr><td>烟酰胺</td>
			<td>0.4 克</td>
		</tr></tbody></table>表2：用于清洁发展机制的维生素混合物原液。 缩写：CDM = 化学成分明确的介质。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">用于清洁发展机制的氨基酸原液</td>
		</tr><tr><td>L-丙氨酸</td>
			<td>0.480 克</td>
		</tr><tr><td>L-精氨酸</td>
			<td>0.250 克</td>
		</tr><tr><td>L-天冬酰胺</td>
			<td>0.700 克</td>
		</tr><tr><td>L-天冬氨酸</td>
			<td>0.600 克</td>
		</tr><tr><td>L-半胱氨酸</td>
			<td>1.000 克</td>
		</tr><tr><td>L-胱氨酸</td>
			<td>0.100 克</td>
		</tr><tr><td>L-谷氨酸</td>
			<td>0.200 克</td>
		</tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td>
			<td>0.780 克</td>
		</tr><tr><td>L-甘氨酸</td>
			<td>0.350 克</td>
		</tr><tr><td>L-组氨酸</td>
			<td>0.300 克</td>
		</tr><tr><td>L-异亮氨酸</td>
			<td>0.430 克</td>
		</tr><tr><td>L-亮氨酸</td>
			<td>0.950 克</td>
		</tr><tr><td>L-赖氨酸</td>
			<td>0.880 克</td>
		</tr><tr><td>L-蛋氨酸</td>
			<td>0.250 克</td>
		</tr><tr><td>L-苯丙氨酸</td>
			<td>0.550 克</td>
		</tr><tr><td>L-脯氨酸</td>
			<td>1.350 克</td>
		</tr><tr><td>L-丝氨酸</td>
			<td>0.680 克</td>
		</tr><tr><td>L-苏氨酸</td>
			<td>0.450 克</td>
		</tr><tr><td>L-色氨酸</td>
			<td>0.100 克</td>
		</tr><tr><td>L-缬氨酸</td>
			<td>0.650 克</td>
		</tr></tbody></table>表3：清洁发展机制的氨基酸储备。 缩写：CDM = 化学成分明确的介质。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>清洁发展机制的起始原料</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>右旋糖</td>
			<td>1.0 克</td>
		</tr><tr><td>硫酸镁-7-水合物</td>
			<td>0.070 克</td>
		</tr><tr><td>磷酸二钾</td>
			<td>0.02 克</td>
		</tr><tr><td>磷酸钾一元</td>
			<td>0.1 克</td>
		</tr><tr><td>无水乙酸钠</td>
			<td>0.45 克</td>
		</tr><tr><td>碳酸氢钠</td>
			<td>0.25 克</td>
		</tr><tr><td>磷酸氢二钠</td>
			<td>0.735 克</td>
		</tr><tr><td>磷酸钠一元</td>
			<td>0.32 克</td>
		</tr><tr><td>清洁发展机制的最后补编</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>氯化胆碱</td>
			<td>0.1 克</td>
		</tr><tr><td>L-半胱氨酸盐酸盐</td>
			<td>0.075 克</td>
		</tr><tr><td>碳酸氢钠</td>
			<td>0.25 克</td>
		</tr></tbody></table>表4：清洁发展机制的起始原料和最终补充。 缩写：CDM = 化学成分明确的介质。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>抗体/荧光基团</td>
			<td>克隆</td>
			<td>稀释因子</td>
		</tr><tr><td>用于紫外激发的 L/D</td>
			<td>不适用</td>
			<td>0.38888889</td>
		</tr><tr><td>Ly6G AF 488</td>
			<td>1A8</td>
			<td>0.25</td>
		</tr><tr><td>CD11b APC</td>
			<td>M1/70</td>
			<td>0.25</td>
		</tr><tr><td>CD11c 聚乙烯</td>
			<td>N418</td>
			<td>0.18055556</td>
		</tr><tr><td>鼠标 Fc 块</td>
			<td>2.4G2</td>
			<td>0.11111111</td>
		</tr><tr><td>F4/80 PE Cy7</td>
			<td>BM8</td>
			<td>0.18055556</td>
		</tr><tr><td>Ly6C BV605</td>
			<td>铝-21</td>
			<td>0.25</td>
		</tr><tr><td>CD103 BV 421</td>
			<td>M290</td>
			<td>0.18055556</td>
		</tr><tr><td>CD45 APC-eF-780</td>
			<td>30-F11</td>
			<td>0.18055556</td>
		</tr></tbody></table>表 5：抗体组合 1。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>抗体/荧光基团</td>
			<td>克隆</td>
			<td>稀释因子</td>
		</tr><tr><td>用于紫外激发的 L/D</td>
			<td>不适用</td>
			<td>0.388888889</td>
		</tr><tr><td>TCR-β APC Cy7</td>
			<td>H57-597</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr><tr><td>CD4 V450 （太平洋蓝）</td>
			<td>马币4-5</td>
			<td>0.25</td>
		</tr><tr><td>CD8 BV650</td>
			<td>53-6.7</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr><tr><td>鼠标 Fc 块</td>
			<td>2.4G2</td>
			<td>0.111111111</td>
		</tr><tr><td>CD45 聚乙烯</td>
			<td>30-F11</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr><tr><td>CD3 AF488</td>
			<td>145-2C11</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr><tr><td>TCR- γΔ APC</td>
			<td>GL-3</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr><tr><td>NK1.1 AF 700</td>
			<td>PK136</td>
			<td>0.180555556</td>
		</tr></tbody></table>表 6：抗体组合 2。

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A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

本文描述了一种新的小鼠模型，用于肺炎球菌在病毒感染期间从无症状定植者转变为致病病原体。该模型可以很容易地适应研究疾病进展不同阶段和各种宿主之间的多种微生物和宿主 - 病原体相互作用。

病毒合并感染后 肺炎链球菌 从定植者转变为病原体的小鼠模型概括了年龄加重的疾病

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an asymptomatic colonizer of the nasopharynx in most individuals but can progress to a pulmonary and systemic ...

该方法描述了一种新的小鼠模型，用于研究肺炎球菌在病毒感染期间从无症状定植者转变为致病病原体。它更接近于模仿人类发生的事情。该模型可以成为确定易感宿主继发性肺炎球菌肺炎潜在治疗靶点的重要工具。该模型再现了衰老的易感性。因此，它可以用来了解宿主的哪些方面随着年龄的增长而变得有缺陷，并允许我们为脆弱的老年宿主量身定制治疗方案。生长肺炎球菌生物膜具有挑战性，因为不同的菌株需要不同的时间。我的建议是在进行动物研究之前尝试生长生物膜。一旦H292细胞100%汇合，用PBS洗涤细胞三次。然后每孔加入250微升4%多聚甲醛以固定细胞，并在冰上孵育一小时或在4摄氏度下孵育过夜。Strake肺炎链球菌菌株在血琼脂平板上，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育过夜。第二天，将细菌从平板接种到新鲜的化学成分明确的培养基或CDM加氧化酶中，方法是通过加入一毫升CDM加氧酶将细菌从盘子上洗掉，并使用一毫升移液器尖端的侧面轻轻提起细菌菌落，小心不要刮琼脂。将CDM加氧化酶中的细菌培养物稀释至起始OD 600为0.05。然后将细菌在松散盖的50毫升锥形管中以37摄氏度和5%二氧化碳培养，直到达到0.2的OD。接下来涡旋细菌培养管。在固定的H 292细胞上接种0.5毫升培养物，每孔再加入0.5毫升CDM加氧化酶培养基。将CDM加氧化酶添加到无细菌的对照孔中。将板在 34 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 48 小时。每12小时，在初始接种后，用新鲜的CDM加Oxyrase轻轻替换0.5毫升的培养基。注意不要破坏生物膜的形成。检查板底部是否有生物膜，并寻找由于生物膜生长而随着时间的推移而增加的混浊度。48小时后，除去上清液并用一毫升PBS洗涤生物膜两次。然后将生物膜重悬于一毫升新鲜CDM中，并用力上下移液以提起生物膜。对于每种细菌菌株，将所有孔中的培养物汇集到50毫升管中。轻轻地上下倾斜紧密盖的管子几次，充分混合。接下来，以等体积加入40%甘油和CDM，以获得终浓度为20%甘油的细菌悬浮液。将一毫升分装到微量离心管中，在干冰上快速冷冻，并在零下80摄氏度下保存。解冻在冰上等分生长的生物膜，并以 1， 700 G 的速度旋转五分钟。小心地除去并丢弃上清液，而不会破坏沉淀。然后通过将颗粒重悬于一毫升PBS中并再次旋转来洗涤颗粒。除去上清液并将沉淀重悬于达到所需浓度所需的体积中。通过将5微升稀释的接种物移液到每个鼻孔中，鼻内接种C57黑六雄性小鼠，以五倍10至第六个菌落形成单位或CFU。接种后，牢牢握住小鼠，稳定头部直到吸入体积。病毒解冻后，将PBS中的病毒稀释至所需浓度。麻醉前将眼科润滑剂放在小鼠的眼睛上。立即用50微升20个斑块形成单位或PFU的甲型流感病毒或IAV感染麻醉小鼠，方法是使用钝镊将舌头从口中拉出并将一定量的液体移入气管。恢复后，使用前面描述的接种方法鼻内接种10微升200 PFU的IAV。对于肺部收集，使用解剖剪刀，切开暴露的肋骨的两侧，轻轻地将肋骨向上拉向小鼠头部以暴露心脏。将连接到预装有PBS的10毫升注射器的25号针头插入右心室，并开始缓慢灌注。寻找肺部漂白作为成功灌注的指标。慢慢冲洗以避免破坏肺组织。用镊子提起心脏，切开肺和心脏。分离后，用镊子拾起肺的所有肺叶，并在装有无菌PBS的培养皿中冲洗以去除任何残留的血液。在培养皿中，将肺切成小块并充分混合。取出一半的肺混合物以确定细菌CFU或病毒PFU，并将其放入预装有0.5毫升PBS的圆底15毫升管中进行均质化。取出另一半肺进行流式细胞术，并将其置于非组织培养处理的24孔板中，每个孔预填充0.5毫升RP10。在室温下放置直至加工。为了均质收集的组织，通过将均质器探针放入70%乙醇中并以60%功率打开均质器30秒来清洁均质器探针。在无菌水中重复此步骤10秒钟。使每个组织均质一分钟。为了计数细菌数量，在血琼脂平板上连续稀释。要计算总CFU，请使用10微升进行板，并记下每个样品的最终体积（以毫升为单位）。将鼻咽样品铺在补充有每毫升庆大霉素三微克的琼脂平板上，以选择肺炎链球菌的生长，同时抑制其他微生物的生长。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。对于流式细胞术，向含有肺样品的24孔板的每个孔中加入500微升消化缓冲液。将培养皿孵育45分钟至1小时。接下来，使用P-1000微量移液器移动消化的肺并将它们放在过滤器上。然后使用三毫升注射器的柱塞捣碎样品。接种的肺炎链球菌生物膜生长导致肺炎球菌携带受限于鼻咽部，同时避免系统性传播。肺炎链球菌IAV合并感染小鼠的疾病表现取决于细菌菌株。虽然肺炎链球菌、TIGR4 和 D39 的任何菌株中鼻咽细菌数量没有显着差异，但在 IAV 感染后 48 小时内，EF3030 播散到肺部没有显着差异。感染肺炎链球菌TIGR4的小鼠中有40%显示出细菌向肺部的传播，其中一半成为菌血症。感染肺炎链球菌D39的小鼠显示100%扩散到肺部，其中一半经历了菌血症。在跟踪总生存期时，无论细菌菌株如何，合并感染小鼠的存活率均明显低于单独使用肺炎链球菌的小鼠。该模型还用于评估IAV感染后肺部各种免疫细胞的存在。细菌菌株D39和TIGR4在从循环中引入的炎性免疫细胞（如中性粒细胞和单核细胞）中引起高于基线的显着增加，而EF3030则没有。 仅IAV感染就引起了免疫细胞（如NK细胞和γδT细胞）流入的基线以上的显着增加。在病毒攻击之前鼻内感染肺炎链球菌的小鼠中，这些抗病毒反应显着减弱。在单次感染的小鼠中，年轻和老年队列之间的病毒滴度没有变化。老年小鼠表现出更早和更严重的疾病迹象，并且在24小时内死亡得更快，而年轻的对照组在感染中存活得更好。将携带和疾病分成不同的步骤，使我们能够检查免疫反应以及在疾病进展的不同阶段重要的细菌和/或病毒因素。我们希望该模型将被其他实验室采用，以研究疾病进展不同阶段和各种宿主期间的其他多种微生物相互作用和宿主病原体相互作用。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

利用生物发光成像之间调查的协同作用肺炎链球菌 A型流感病毒的婴儿小鼠

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

科研

免疫与感染

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

活细胞成像枯草芽孢杆菌肺炎链球菌使用自动定时显微镜

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

使用的EpiAirway模型，用于描述长期宿主 - 病原体相互作用

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

“<em&gt;枸橼酸rodentium</em&gt;鼠标产品型号：研究感染性结肠炎的病原体和宿主的贡献

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

肺炎链球菌在鼻内殖民期间炎症反应的特征

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

监测改变膜极性，膜完整性和细胞内离子浓度<em&gt;肺炎链球菌</em&gt;使用荧光染料

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

荚膜血清型<em&gt;肺炎链球菌</em&gt;使用荚膜肿胀反应

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

鼠标型号病原体引起的慢性炎症局部及全身站点

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

荚膜血清型<em&gt;肺炎链球菌</em&gt;乳胶凝集

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

一个<em&gt;体外</em&gt;模型在HIV合并感染的背景下测量免疫应答疟疾

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

病毒合并感染后 肺炎链球菌 从定植者转变为病原体的小鼠模型概括了年龄加重的疾病

病毒合并感染后肺炎链球菌从定植者转变为病原体的小鼠模型概括了年龄加重的疾病