Name: a mouse model for the transition of streptococcus pneumoniae from colonizer to pathogen upon viral co-infection recapitulates age-exacerbated illness
Uploaded: 2022-09-28T14:15:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness at JoVE.

Nous tenons à remercier Nick Lenhard pour la lecture critique et l’édition de ce manuscrit. Nous tenons également à remercier Andrew Camilli et Anthony Campagnari pour les souches bactériennes et Bruce Davidson pour les souches virales. Ce travail a été soutenu par la subvention du National Institute of Health (R21AG071268-01) à J.L. et le National Institute of Health Grants (R21AI145370-01A1), (R01AG068568-01A1), (R21AG071268-01) à E.N.B.G.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

La plupart des études expérimentales existantes sur la co-infection à S. pneumoniae/IAV reposent sur l’administration de bactéries dans les poumons de souris pré-infectées par le virus de l’IAV. Ces modèles ont permis d’identifier les changements dans l’environnement pulmonaire et la réponse immunitaire systémique qui rendent l’hôte vulnérable à une infection bactérienne secondaire 15,16,17,32,33,34,35,36,37. Cependant, ces modèles n’ont pas réussi à imiter la transition de S. pneumoniae d’un colonisateur asymptomatique à un agent pathogène capable de causer des infections pulmonaires et systémiques graves. De plus, ces modèles ne conviennent pas à l’étude des facteurs de l’hôte et des interactions hôte-pathogène dans les voies respiratoires supérieures qui contribuent à la susceptibilité à l’infection. Un modèle antérieur pour le mouvement des pneumocoques du nasopharynx vers le poumon après une infection par le VAI reposait sur une infection bactérienne du nasopharynx suivie d’une infection virale. Cependant, il n’a pas réussi à reproduire les signes graves de maladie observés chez les patients humains21. Le modèle modifié d’infection murine décrit ici récapitule la transition de S. pneumoniae d’un portage asymptomatique à un agent pathogène qui cause une maladie clinique grave.
Une étape critique de ce modèle consiste à établir une infection à S. pneumoniae dans le nasopharynx. Streptococcus pneumoniae forme des biofilms et colonise le nasopharynx à différentes efficacités 21,38. Pour établir une infection constante, au moins 5 × 106 UFC des souches bactériennes cultivées sur biofilm testées jusqu’à présent sont nécessaires23. Il est recommandé que toute nouvelle souche bactérienne soit testée pour une infection stable du nasopharynx avant l’infection virale. Pour la co-infection virale, des études antérieures ont montré qu’une infection intranasale par IAV est nécessaire pour la dispersion de la bactérie du nasopharynx21,22,23. Dans ces études antérieures, 500 UFP de l’IAV pour l’administration intranasale ont été utilisées, tandis que dans cette étude, 200 UFP étaient suffisantes pour augmenter le nombre de bactéries dans le nasopharynx. L’infection par le VAI ne se limite pas aux voies respiratoires supérieures et peut se propager aux poumons39,40, ce qui est essentiel pour rendre l’environnement pulmonaire plus permissif pour les infections bactériennes15,16,41. L’administration de l’IAV aux poumons peut être réalisée par administration intranasale ou par installation intratrachéale de souris anesthésiées. Des travaux antérieurs avec des souris BALB / cByJ ont révélé que l’administration intranasale entraîne une pneumonie virale21; cependant, l’accès de l’inoculum aux poumons après l’inoculation intranasale est plus restreint chez les souris C57BL/6. Chez les souris C57BL/6, une installation intratrachéale est nécessaire pour une administration régulière du virus23. Dans ce modèle, la colonisation bactérienne préalable accélère la présentation des symptômes de la maladie après une infection virale23. Comme l’infection virale peut elle-même causer des symptômes de la maladie avec une variation potentielle de la cinétique, il est recommandé de tester d’abord une gamme de doses pour toute nouvelle souche virale testée et de choisir une dose qui révèle une cinétique accélérée chez les hôtes co-infectés.
Les poumons fournissent une autre lecture critique pour l’évaluation de la maladie dans ce modèle. Pour l’évaluation de la charge pathogène et de l’afflux de cellules immunitaires, un poumon de la même souris peut être utilisé. Cependant, comme la gravité de l’infection et de l’inflammation peut différer d’un lobe à l’autre, il est recommandé de ne pas prendre différents lobes du même poumon pour les différentes évaluations. Au contraire, tous les lobes peuvent être hachés en petits morceaux, bien mélangés ensemble, puis analysés également pour les différentes évaluations. De même, le nasopharynx peut être utilisé pour le dénombrement de l’UFC bactérienne ou PFU virale et la réponse immunitaire. Cependant, le nombre de cellules obtenues à partir des lavages et des tissus est trop faible pour effectuer une cytométrie en flux sans regrouper les échantillons de souris du même groupe. Alternativement, l’inflammation dans le nasopharynx peut être évaluée histologiquement23.
Une caractéristique essentielle de ce modèle est qu’il récapitule la maladie clinique observée chez les patients. Chez les humains, la pneumonie pneumococcique secondaire à la suite d’une infection par le VAI entraîne souvent des signes évidents de maladie, notamment de la toux, de la dyspnée, de la fièvre et des douleurs musculaires pouvant entraîner des hospitalisations, une insuffisance respiratoire etmême la mort8,15,42,43. Ce modèle récapitule les signes graves de maladie clinique observés chez l’homme en termes de difficulté à respirer (reflétée dans le score respiratoire) et de malaise global (reflété dans les scores de posture et de mouvement) affichés par les souris, ainsi que de décès chez certains des jeunes témoins en bonne santé. Les symptômes exacerbés de la maladie chez les souris co-infectées sont probablement le résultat à la fois de la dissémination bactérienne dans les poumons et de l’altération de la clairance virale chez les souris atteintes de portage pneumococcique23. Une limite du modèle est que l’incidence de la maladie clinique et la dissémination bactérienne à partir du nasopharynx varient d’une souris à l’autre et sont influencées par la souche bactérienne, l’âge de l’hôte et le génotype21,22,23. En conséquence, pour les souches invasives, la progression de l’infection localisée (sans bactériémie détectable) à la mort peut se produire dans les 24 heures. Par conséquent, pour une véritable évaluation de la propagation systémique, la bactériémie doit être suivie sur des intervalles plus courts (toutes les 6 à 12 heures). De même, le score de la maladie peut changer rapidement, en particulier dans les 72 premières heures suivant la co-infection. Par conséquent, pour suivre de près les symptômes de la maladie, il est conseillé de surveiller les souris trois fois par jour pendant les jours 1 à 3 après l’infection par le VAI.
En résumé, ce modèle reproduit le déplacement de S. pneumoniae d’un colonisateur asymptomatique du nasopharynx à un agent pathogène capable de causer une maladie pulmonaire et systémique lors de l’infection par le VAI. Dans ce modèle, l’IAV déclenche la transition de S. pneumoniae en modifiant le comportement bactérien dans le nasopharynx, en augmentant la propagation bactérienne au poumon et en modifiant l’immunité antibactérienne23. De même, le portage bactérien atténue les réponses immunitaires antivirales et altère l’élimination de l’IAV des poumons23. Cela rend ce modèle idéal pour analyser les changements dans les réponses immunitaires dans les infections simples par rapport aux infections polymicrobiennes. De plus, l’évolution de la maladie après une co-infection dépend, en partie, de la souche de pneumocoques présente dans le nasopharynx. Par conséquent, le modèle est adapté pour disséquer les facteurs bactériens nécessaires à la colonisation asymptomatique par rapport à la transition pathogène de S. pneumoniae. Enfin, ce modèle reproduit la susceptibilité du vieillissement aux co-infections et, bien que cela n’ait pas été testé ici, il peut être facilement utilisé pour évaluer l’impact des antécédents de l’hôte sur l’évolution de la maladie. En conclusion, la séparation du portage et de la maladie en étapes distinctes offre la possibilité d’analyser les variantes génétiques des agents pathogènes et de l’hôte, ce qui permet d’examiner en détail les interactions d’un pathobionte important avec l’hôte à différentes phases de la progression de la maladie. À l’avenir, ce modèle pourra être utilisé pour adapter les options de traitement aux hôtes vulnérables.

Streptococcus pneumoniae (pneumocoque) sont des bactéries à Gram positif qui résident asymptomatiquement dans le nasopharynx de la plupart des individus en bonne santé 1,2. Favorisés par des facteurs qui ne sont pas complètement définis, les pneumocoques peuvent passer de colonisateurs bénins du nasopharynx à des agents pathogènes qui se propagent à d’autres organes entraînant des infections graves, notamment l’otite moyenne, la pneumonie et la bactériémie3. La présentation de la pneumococcie dépend, en partie, des différences spécifiques à la souche, y compris le sérotype, qui est basé sur la composition des polysaccharides capsulaires. Plus de 100 sérotypes ont été caractérisés jusqu’à présent, et certains sont associés à des infections plus invasives 4,5. Plusieurs autres facteurs augmentent le risque de pneumococcie. L’un de ces facteurs est l’infection virale, où le risque de pneumonie pneumococcique est multiplié par 100 par IAV 6,7. Historiquement, S. pneumoniae est l’une des causes les plus fréquentes de pneumonie bactérienne secondaire après la grippe et est associée à de pires résultats8. Un autre facteur de risque majeur est l’âge avancé. En fait, S. pneumoniae est la principale cause de pneumonie bactérienne d’origine communautaire chez les personnes âgées de plus de 65 ans 9,10. Les personnes âgées représentent la majorité (>75 %) des décès dus à la pneumonie et à la grippe, ce qui indique que les deux facteurs de risque - le vieillissement et l’infection par le VAI - aggravent de façon synergique la susceptibilité à la maladie11,12,13,14. Cependant, les mécanismes par lesquels l’infection virale provoque la transition des pneumocoques du colonisateur asymptomatique à l’agent pathogène invasif et la façon dont cela est façonné par les facteurs de l’hôte restent mal définis. Cela est dû en grande partie à l’absence d’un modèle de petit animal qui récapitule la transition de la colonisation pneumococcique asymptomatique à la maladie clinique critique.
Les études de co-infection ont classiquement été modélisées chez des souris inoculées avec des pneumocoques directement dans les poumons 7 jours après l’infection grippale15,16. Cela reproduit la susceptibilité à la pneumonie bactérienne secondaire et est idéal pour étudier comment les réponses immunitaires antivirales altèrent les défenses antibactériennes17. Cependant, des études longitudinales chez l’homme ont démontré que le portage pneumococcique dans le nasopharynx, où les bactéries peuvent former des biofilms asymptomatiques18, est uniformément associé à des maladies invasives 19,20. Les isolats bactériens provenant d’infections de l’oreille moyenne, des poumons et du sang sont génétiquement identiques à ceux trouvés dans le nasopharynx20. Ainsi, pour étudier la transition du portage asymptomatique à la maladie invasive à la suite d’une infection par le VAI, un modèle a été établi dans lequel des souris ont reçu par voie intranasale des pneumocoques cultivés par biofilm suivis d’une infection par le VAI du nasopharynx21,22. L’infection virale des voies respiratoires supérieures a entraîné des changements dans l’environnement de l’hôte qui ont entraîné la dispersion des pneumocoques à partir de biofilms et leur propagation aux voies respiratoires inférieures21. Ces bactéries dispersées avaient une expression régulée à la hausse de facteurs de virulence importants pour l’infection, les convertissant de colonisateurs en agents pathogènes21. Ces observations mettent en évidence l’interaction complexe entre le virus, l’hôte et la bactérie et démontrent que les changements de l’hôte déclenchés par l’infection virale ont un impact direct sur le comportement pneumococcique, qui, à son tour, modifie le cours de l’infection bactérienne. Cependant, ce modèle ne récapitule pas les signes graves de maladie observés chez les humains, probablement parce que le virus est limité aux fosses nasales et que les effets systémiques de l’infection virale sur l’immunité de l’hôte et les lésions pulmonaires ne sont pas récapitulés.
Nous avons récemment établi un modèle qui intègre l’interaction complexe entre l’hôte et les agents pathogènes, mais qui imite aussi plus étroitement la gravité de la maladie observée chez l’homme23. Dans ce modèle, les souris sont d’abord infectées par voie intranasale par des pneumocoques cultivés par biofilm pour établir un portage asymptomatique, suivi d’une infection par le VAI du nasopharynx et des poumons. Cela a entraîné une dissémination bactérienne dans les poumons, une inflammation pulmonaire et une maladie qui a évolué vers la létalité chez une fraction des jeunes souris23. Cette étude antérieure a démontré que l’infection virale et bactérienne modifiait la défense de l’hôte : l’infection virale favorisait la dissémination bactérienne et la colonisation bactérienne antérieure altérait la capacité de l’hôte à contrôler les niveaux d’IAV pulmonaires23. L’examen de la réponse immunitaire a révélé que l’infection par le VAI diminuait l’activité antibactérienne des neutrophiles, tandis que la colonisation bactérienne atténuait la réponse à l’interféron de type I essentielle à la défense antivirale23. Fait important, ce modèle reproduisait la susceptibilité au vieillissement. Par rapport aux jeunes souris, les souris âgées présentaient des signes de maladie plus tôt, présentaient une maladie clinique plus grave et succombaient à une infection plus fréquemment23. Les travaux présentés dans ce manuscrit montrent que le degré de maladie dépend également de la souche bactérienne, car les souches invasives de pneumocoque affichent une dissémination plus efficace lors de l’infection par le VAI, montrent des signes plus manifestes d’inflammation pulmonaire et entraînent des taux accélérés de maladie par rapport aux souches non invasives. Ainsi, ce modèle de co-infection S. pneumoniae/IAV permet l’examen détaillé des facteurs pathogènes et des facteurs de l’hôte et est bien adapté à l’étude des réponses immunitaires aux infections polymicrobiennes aux différentes phases de la progression de la maladie.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4-Aminobenzoic acid&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1267318</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>650101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-201-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC147440250</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501785325</td>
			<td>Microcyrstalline cellulose&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix Fixation Buffer&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BDB554655</td>
			<td>Fixation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Fortessa</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene Tubing&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>427410</td>
			<td>Tubing for nasal lavage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (1 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Microtainer Capillary Blood Collector and BD Microgard Closure</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-675-185</td>
			<td>Blood collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6233703</td>
			<td>Mix IV stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC230090010</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>#000644</td>
			<td>Mice used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C77-500</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD103 BV 421</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB562771</td>
			<td>Clone: M290 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>50-112-9622</td>
			<td>Clone: M1/70, DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB565592</td>
			<td>Clone: N418 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 AF 488</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>OB153030</td>
			<td>Clone: 145-2C11 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 V450</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>BDB560470</td>
			<td>Clone: RM4.5 DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 APC eF-780</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-9642</td>
			<td>Clone: 30-F11 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 PE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>50-103-70</td>
			<td>Clone: 30-F11 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#945; BV 650</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>BDB563234</td>
			<td>Clone: 53-6.7 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC110290500</td>
			<td>Final supplement to CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-761-107</td>
			<td>Filter sterilzation apparatus&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Tissue Culture Treated T-25 Flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-126-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Clear Multiple Well Plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-201-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;DMEM With L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose; Without Sodium Pyruvate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT10017CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanocobalamin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC405925000</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D39</td>
			<td>National Collection of Type Culture (NCTC)</td>
			<td>NCTC 7466</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Alanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1023114</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Calcium pantothenate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC243301000</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical&#160;</td>
			<td>LS002147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagles Minimum Essential Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4616-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EF3030</td>
			<td>Center for Disease Control and Prevention&#160;</td>
			<td>Available via the isolate bank request</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae strain, request using strain name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F480 PE Cy7</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-9713</td>
			<td>Clone: BMB DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>50 mL round bottom tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td>15 mL round bottom tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;Round-Bottom Polystyrene Test Tubes (5 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-5</td>
			<td>FACS tubes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric Nitrate Nonahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>I110-100</td>
			<td>Mix III stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Delicate Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-951-5</td>
			<td>Instruments used for harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable Inoculating Loops&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-602</td>
			<td>Inoculating loops&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Dissecting Tissue Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-812-38</td>
			<td>Forceps for harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-137</td>
			<td>Micocentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Sterile Syringes for Single Use (10 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC216630500</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI 1640 (ATCC)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A1049101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14025134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;MEM (Temin&#39;s modification) (2x), no phenol red</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-935-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>25-200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AA3643530</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1202414</td>
			<td>Mix II stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen UltraComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-112-9040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1517836</td>
			<td>Mix III stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6027918</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1573814</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAB2147322</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1352022</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1043518</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1038914</td>
			<td>Final supplement to CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cystine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1376218</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC156211000</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O2956-100</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC166150250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>50-112-1524</td>
			<td>Clone: N/A DF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC166170250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP385-100</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6222514</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1031822</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low endotoxin BSA&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A1470-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1323814</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1019922</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC132660250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC138930250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1023014</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1272014</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6C BV 605</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB563011</td>
			<td>Clone: AL-21 DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6G AF 488&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>NC1102120</td>
			<td>Clone: IA8, DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td>MDCK cell line for PFU analuysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate 7-Hydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>60-019-68</td>
			<td>CDM starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M113-500</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Fc Block</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB553142</td>
			<td>Clone: 2.4G2 DF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MWI VETERINARY&#160;PURALUBE VET OINTMENT</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC1886507</td>
			<td>Eye lubricant for infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCI-H292 mucoepidermoid carcinoma cell line&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1848</td>
			<td>H292 lung epithelial cell line for biofilm growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacinamide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>18-604-792</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK 1.1 AF 700</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-4692</td>
			<td>Clone: PK136 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxyrase For Broth 50Ml Bottle 1/Pk</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-200-5299</td>
			<td>To remove oxygen from liquid cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4% in PBS</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>J19932-K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pivetal Isoflurane&#160;</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-8440</td>
			<td>Isoflurane for anesthesia during infection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P285-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal hydrochloride&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC352710250</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxamine dihydrochloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6267906</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC132350250</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0530-500G</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP922I-500</td>
			<td>For FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>Starter stock and final supplement to CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR APC&#160;</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-8889</td>
			<td>Clone: GL-3 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; APC-Cy7</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>BDB560656</td>
			<td>Clone: H57-597 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Blood Agar with Gentamicin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>R01227</td>
			<td>Blood agar plates with the antibiotic gentamicin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Trypsin, TPCK Treated</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PI20233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine hydrochloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC148991000</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIGR4</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>BAA-334</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC157300250</td>
			<td>Mix II stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worthington Biochemical Corporation&#160;Collagenase, Type 2, 1 g</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9693955</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model for the transition of streptococcus pneumoniae from colonizer to pathogen upon viral co-infection recapitulates age-exacerbated illness

Streptococcus pneumoniae (pneumocoque ) est un colonisateur asymptomatique du nasopharynx chez la plupart des individus, mais peut évoluer vers un agent pathogène pulmonaire et systémique lors de l’infection par le virus de la grippe A (IAV). L’âge avancé augmente la susceptibilité de l’hôte à la pneumonie pneumococcique secondaire et est associé à une aggravation de l’issue de la maladie. Les facteurs de l’hôte à l’origine de ces processus ne sont pas bien définis, en partie à cause d’un manque de modèles animaux qui reproduisent la transition de la colonisation asymptomatique à la maladie clinique grave. 
Cet article décrit un nouveau modèle murin qui recrée la transition des pneumocoques du portage asymptomatique à la maladie lors d’une infection virale. Dans ce modèle, les souris sont d’abord inoculées par voie intranasale avec des pneumocoques cultivés par biofilm pour établir un portage asymptomatique, suivi d’une infection par le VAI du nasopharynx et des poumons. Il en résulte une dissémination bactérienne dans les poumons, une inflammation pulmonaire et des signes évidents de maladie pouvant évoluer vers la létalité. Le degré de maladie dépend de la souche bactérienne et des facteurs de l’hôte. 
Fait important, ce modèle reproduit la susceptibilité au vieillissement, car par rapport aux jeunes souris, les souris âgées présentent une maladie clinique plus grave et succombent à la maladie plus fréquemment. En séparant le portage et la maladie en étapes distinctes et en offrant la possibilité d’analyser les variantes génétiques de l’agent pathogène et de l’hôte, ce modèle de co-infection S. pneumoniae/IAV permet l’examen détaillé des interactions d’un pathobioonte important avec l’hôte à différentes phases de la progression de la maladie. Ce modèle peut également servir d’outil important pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles contre la pneumonie pneumococcique secondaire chez les hôtes sensibles.

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A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

Cet article décrit un nouveau modèle murin pour la transition du pneumocoque d’un colonisateur asymptomatique à un agent pathogène pathogène au cours d’une infection virale. Ce modèle peut être facilement adapté pour étudier les interactions polymicrobiennes et hôte-pathogène au cours des différentes phases de la progression de la maladie et entre divers hôtes.

Un modèle murin pour la transition de Streptococcus pneumoniae de colonisateur à pathogène lors d’une co-infection virale récapitule la maladie exacerbée par l’âge

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an asymptomatic colonizer of the nasopharynx in most individuals but can progress to a pulmonary and systemic ...

Cette méthode décrit un nouveau modèle murin pour étudier la transition du pneumocoque d’un colonisateur asymptomatique à un agent pathogène pathogène au cours d’une infection virale. Il imite plus étroitement ce qui se passe chez les humains. Ce modèle peut être un outil important pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles contre la pneumonie pneumococcique secondaire chez les hôtes sensibles.Ce modèle reproduit la susceptibilité au vieillissement. Par conséquent, il peut être utilisé pour comprendre quels aspects de l’hôte deviennent défectueux avec l’âge et nous permettre d’adapter les options de traitement aux hôtes âgés vulnérables. La croissance du biofilm pneumococcique est difficile car les différentes souches prennent des temps différents.Mon conseil est d’essayer de cultiver le biofilm avant d’exécuter l’étude animale. Une fois que les cellules H292 sont 100% confluentes, lavez les cellules trois fois avec du PBS. Ajoutez ensuite 250 microlitres de paraformaldéhyde à 4% par puits pour fixer les cellules et incuber pendant une heure sur de la glace ou une nuit à quatre degrés Celsius.Strake Streptococcus pneumoniae souche d’intérêt sur plaque de gélose au sang et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, inoculez les bactéries de la plaque dans un milieu frais chimiquement défini ou CDM plus oxyrase en lavant les bactéries de la plaque en ajoutant un millilitre de MDP plus oxyrase et en soulevant doucement les colonies bactériennes à l’aide du côté d’une pointe de pipette d’un millilitre, en prenant soin de ne pas gratter la gélose Diluer la culture bactérienne dans du MDP plus oxyrase jusqu’à obtenir une DO de départ de 600 de 0,05.Ensuite, cultivez les bactéries dans un tube conique de 50 millilitres à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone jusqu’à ce que la DO de 0,2 soit atteinte. Prochain vortex le tube de culture bactérienne. Ensemencer 0,5 millilitre de la culture sur les cellules H292 fixes et ajouter 0,5 millilitre supplémentaire de MDP plus milieu oxyrase par puits.Ajoutez CDM plus Oxyrase aux puits de contrôle sans bactéries. Incuber la plaque pendant 48 heures à 34 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Toutes les 12 heures, après l’ensemencement initial, remplacez doucement les 0,5 millilitres du milieu par du CDM frais plus de l’oxyrase.Attention à ne pas perturber la formation du biofilm. Vérifiez le fond de la plaque pour le biofilm et recherchez une nébulosité croissante au fil du temps en raison de la croissance du biofilm. Après 48 heures, retirez le surnageant et lavez le biofilm deux fois avec un millilitre de PBS.Ensuite, remettez le biofilm en suspension dans un millilitre de MDP frais et pipette vigoureusement de haut en bas pour soulever le biofilm. Pour chaque souche bactérienne, regroupez la culture de tous les puits dans un tube de 50 millilitres. Bien mélanger en inclinant doucement le tube bien bouché de haut en bas plusieurs fois.Ensuite, ajoutez 40% de glycérol et de CDM à volumes égaux pour obtenir une suspension bactérienne avec une concentration finale de 20% de glycérol. Aliquote d’un millilitre dans un tube microcentrifugeux, congeler sur de la glace sèche et économiser à moins 80 degrés Celsius. Décongeler les aliquotes cultivées sur la glace et faire tourner à 1 700 G pendant cinq minutes.Retirez et jetez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille. Ensuite, lavez la pastille en la remettant en suspension dans un millilitre de PBS et faites-la tourner à nouveau. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans le volume nécessaire pour atteindre la concentration désirée.Inoculer la souris noire C57 six mâles par voie intranasale avec cinq fois 10 à la sixième unité formant colonie ou UFC en pipetant cinq microlitres de l’inoculum dilué dans chaque naris. Après l’inoculation, tenez fermement la souris en stabilisant la tête jusqu’à ce que le volume soit inhalé. Une fois que le virus a dégelé, diluez-le dans du PBS à la concentration désirée.Placez un lubrifiant ophtalmique sur les yeux de la souris avant l’anesthésie. Infectez immédiatement la souris anesthésiée avec 50 microlitres de 20 unités formant des plaques, ou PFU, du virus de la grippe A ou IAV par voie intratrachéale en utilisant une pince à épiler émoussée pour retirer la langue de la bouche et pipeter le volume de liquide dans la trachée. Après récupération, inoculer par voie intranasale 10 microlitres de 200 PFU d’IAV en utilisant la méthode d’inoculation décrite précédemment.Pour le prélèvement des poumons, à l’aide de ciseaux à dissection, coupez les côtés de la cage thoracique exposée et tirez doucement les côtes vers la tête de la souris pour exposer le cœur. Insérez une aiguille de calibre 25 attachée à une seringue de 10 millilitres préremplie de PBS dans le ventricule droit et commencez à perfuser lentement. Recherchez le blanchiment des poumons comme indicateur de perfusion réussie.Rincer lentement pour éviter de casser le tissu pulmonaire. Soulevez le cœur avec une pince et faites une incision pour séparer les poumons et le cœur. Une fois séparé, ramassez tous les lobes du poumon avec une pince et rincez dans un plat avec du PBS stérile pour éliminer tout sang résiduel.Dans une boîte de Pétri, hacher le poumon en petits morceaux et bien mélanger. Retirez la moitié du mélange pulmonaire pour déterminer l’UFC bactérienne ou le PFU viral et placez-le dans un tube rond de 15 millilitres prérempli de 0,5 millilitre de PBS pour l’homogénéisation. Retirez l’autre moitié du poumon pour la cytométrie en flux et placez-la dans une plaque de 24 puits traitée par culture non tissulaire, chaque puits étant prérempli de 0,5 millilitre de RP10.Laisser à température ambiante jusqu’au traitement. Pour homogénéiser le tissu collecté, nettoyez la sonde homogénéisante en la mettant dans de l’éthanol à 70% et en allumant l’homogénéisateur à 60% de puissance pendant 30 secondes. Répétez cette étape dans de l’eau stérile pendant 10 secondes.Homogénéiser chaque tissu pendant une minute. Pour le dénombrement des nombres bactériens, dilutions en série sur plaques sur gélose au sang. Pour calculer le CFU total, utilisez 10 microlitres pour plaquer et notez le volume final en millilitres pour chaque échantillon.Plaquer les échantillons du nasopharynx sur des plaques de gélose au sang complétées par trois microgrammes par millilitre de gentamycine pour sélectionner la croissance de S pneumoniae tout en inhibant la croissance d’autres micro-organismes. Incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Pour la cytométrie en flux, ajouter 500 microlitres de tampon de digestion à chaque puits d’une plaque de 24 puits contenant un échantillon pulmonaire.Incuber l’assiette pendant 45 minutes à une heure. Ensuite, à l’aide d’une micro-pipette P-1000, déplacez les poumons digérés et placez-les sur le filtre. Utilisez ensuite le piston d’une seringue de trois millilitres pour écraser l’échantillon.La croissance du biofilm S. pneumoniae inoculum entraîne un portage pneumococcique constant limité au nasopharynx tout en évitant la propagation systématique. La présentation de la maladie chez les souris co-infectées par S pneumoniae IAV dépendait de la souche bactérienne. Bien qu’il n’y ait pas eu de différence significative dans le nombre de bactéries du nasopharynx entre les souches, S pneumoniae, TIGR4 et D39, mais pas EF3030 disséminé dans les poumons 48 heures après l’infection par le VAI.40% des souris infectées par S pneumoniae TIGR4 ont présenté une dissémination bactérienne dans les poumons et parmi celles-ci, la moitié d’entre elles sont devenues bactériémiques. Les souris infectées par S pneumoniae D39 ont montré une dissémination de 100% dans les poumons et la moitié d’entre elles ont présenté une bactériémie. Dans le suivi de la survie globale, quelle que soit la souche bactérienne, le taux de survie des souris co-infectées était significativement inférieur à celui des souris individuellement confrontées à S pneumoniae.Ce modèle a également été utilisé pour évaluer la présence de diverses cellules immunitaires dans les poumons à la suite d’une infection par le VAI. Les souches bactériennes D39 et TIGR4 ont provoqué une augmentation significative par rapport à la ligne de base de l’afflux de cellules immunitaires inflammatoires de la circulation, telles que les neutrophiles et les monocytes, contrairement à EF3030. L’infection par le VAI à elle seule a provoqué une augmentation significative par rapport à la ligne de base de l’afflux de cellules immunitaires telles que les cellules NK et les cellules T gamma delta.Ces réponses antivirales ont été significativement atténuées chez les souris infectées par voie intranasale par S pneumoniae avant la provocation virale. Chez les souris infectées individuellement, les titres viraux ne variaient pas entre les cohortes jeunes et âgées. Les souris âgées ont montré des signes de maladie plus précoces et significativement plus graves et sont mortes plus rapidement, dans les 24 heures, tandis que les jeunes témoins ont mieux survécu à l’infection.La séparation du portage et de la maladie en étapes distinctes nous permet d’examiner à la fois la réponse immunitaire et les facteurs bactériens et/ou viraux importants à différentes phases de la progression de la maladie. Nous espérons que ce modèle sera adapté par d’autres laboratoires pour étudier d’autres interactions polymicrobiennes et interactions hôtes-pathogènes au cours des différentes phases de la progression de la maladie et entre les différents hôtes.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Utiliser l&#39;imagerie Bioluminescent chargé d&#39;enquêter sur une synergie entre Streptococcus pneumoniae Et virus Influenza A de souriceaux

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Recherche

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