Name: a mouse model for the transition of streptococcus pneumoniae from colonizer to pathogen upon viral co-infection recapitulates age-exacerbated illness
Uploaded: 2022-09-28T14:15:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness at JoVE.

Wir danken Nick Lenhard für die kritische Lektüre und Bearbeitung dieses Manuskripts. Wir möchten uns auch bei Andrew Camilli und Anthony Campagnari für die Bakterienstämme und Bruce Davidson für die Virusstämme bedanken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Institute of Health Grant (R21AG071268-01) an J.L. und das National Institute of Health Grants (R21AI145370-01A1), (R01AG068568-01A1), (R21AG071268-01) an E.N.B.G.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die meisten der existierenden experimentellen Studien zu S. pneumoniae/IAV-Koinfektionen beruhen auf der bakteriellen Abgabe in die Lunge von Mäusen, die bereits mit IAV infiziert waren. Diese Modelle haben dazu beigetragen, Veränderungen im Lungenmilieu und in der systemischen Immunantwort zu identifizieren, die den Wirt anfällig für sekundäre bakterielle Infektionen machen 15,16,17,32,33,34,35,36,37. Diese Modelle haben es jedoch nicht geschafft, den Übergang von S. pneumoniae von einem asymptomatischen Kolonisator zu einem Erreger nachzuahmen, der schwere Lungen- und systemische Infektionen verursachen kann. Darüber hinaus sind diese Modelle nicht geeignet, um die Wirtsfaktoren und Wirt-Pathogen-Interaktionen in den oberen Atemwegen zu untersuchen, die zur Anfälligkeit für Infektionen beitragen. Ein früheres Modell für die Bewegung von Pneumokokken vom Nasopharynx in die Lunge nach einer IAV-Infektion beruhte auf einer bakteriellen Infektion des Nasopharynx gefolgt von einer Virusinfektion. Die bei menschlichen Patienten beobachteten schweren Krankheitssymptome konnten jedoch nicht reproduziertwerden 21. Das hier beschriebene modifizierte murine Infektionsmodell rekapituliert den Übergang von S. pneumoniae von einer asymptomatischen Übertragung zu einem Erreger, der eine schwere klinische Erkrankung verursacht.
Ein wichtiger Schritt dieses Modells ist die Etablierung einer S. pneumoniae-Infektion im Nasen-Rachenraum. Streptococcus pneumoniae bilden Biofilme und besiedeln den Nasopharynx mit unterschiedlichen Wirkungsgraden21,38. Um eine konsistente Infektion herzustellen, sind mindestens 5 × 106 KBE der bisher getesteten Biofilm-gezüchteten Bakterienstämme erforderlich23. Es wird empfohlen, jeden neuen Bakterienstamm vor einer Virusinfektion auf eine stabile Infektion des Nasen-Rachen-Raums zu testen. Für die virale Koinfektion haben frühere Studien ergeben, dass eine intranasale Infektion mit IAV für die Ausbreitung der Bakterien aus dem Nasopharynx erforderlich ist21,22,23. In diesen früheren Studien wurden 500 PFU IAV für die intranasale Verabreichung verwendet, während in dieser Studie 200 PFU ausreichten, um die Bakterienzahl im Nasopharynx zu erhöhen. Die IAV-Infektion ist nicht auf die oberen Atemwege beschränkt und kann sich auf die Lunge ausbreiten39,40, was entscheidend ist, um das Lungenmilieu für bakterielle Infektionen durchlässiger zu machen15,16,41. Die Abgabe von IAV in die Lunge kann entweder durch intranasale Verabreichung oder intratracheale Implantation von anästhesierten Mäusen erfolgen. Frühere Arbeiten mit BALB/cByJ-Mäusen ergaben, dass die intranasale Verabreichung zu einer viralen Pneumonie führt21; Der Zugang des Inokulums zur Lunge nach intranasaler Inokulation ist bei C57BL/6-Mäusen jedoch eingeschränkter. Bei C57BL/6-Mäusen ist eine intratracheale Implantation für eine konsistente Abgabe des Virus erforderlich23. In diesem Modell beschleunigt eine vorherige bakterielle Besiedlung das Auftreten von Krankheitssymptomen nach Virusinfektion23. Da eine Virusinfektion selbst Krankheitssymptome mit potenzieller Variation der Kinetik verursachen kann, wird empfohlen, zunächst eine Reihe von Dosen für jeden neu getesteten Virusstamm zu testen und eine Dosis zu wählen, die eine beschleunigte Kinetik in koinfizierten Wirten zeigt.
Die Lunge liefert in diesem Modell einen weiteren wichtigen Messwert für die Bewertung von Krankheiten. Für die Abschätzung der Erregerlast und des Immunzelleinstroms kann eine Lunge derselben Maus verwendet werden. Da der Schweregrad der Infektion und der Entzündung jedoch zwischen den Lappen unterschiedlich sein können, wird empfohlen, für die verschiedenen Untersuchungen keine verschiedenen Lappen derselben Lunge zu verwenden. Vielmehr können alle Lappen in kleine Stücke zerkleinert, gut miteinander vermischt und dann für die verschiedenen Bewertungen gleichmäßig analysiert werden. In ähnlicher Weise kann der Nasopharynx für die Zählung von bakterieller KBE oder viraler PFU und der Immunantwort verwendet werden. Die Anzahl der Zellen, die aus den Waschungen und dem Gewebe gewonnen werden, ist jedoch zu gering, um eine Durchflusszytometrie durchzuführen, ohne die Proben von Mäusen innerhalb derselben Gruppe zusammenzufassen. Alternativ kann eine Entzündung im Nasen-Rachen-Raum histologisch beurteiltwerden 23.
Ein entscheidendes Merkmal dieses Modells ist, dass es die klinische Erkrankung, die bei Patienten beobachtet wurde, rekapituliert. Beim Menschen führt eine sekundäre Pneumokokken-Pneumonie nach einer IAV-Infektion häufig zu offensichtlichen Krankheitsanzeichen wie Husten, Dyspnoe, Fieber und Muskelschmerzen, die zu Krankenhausaufenthalten, Atemversagen und sogar zum Tod führen können 8,15,42,43. Dieses Modell rekapituliert die schweren Anzeichen klinischer Erkrankungen, die beim Menschen in Bezug auf Atembeschwerden (die sich im Atemwert widerspiegeln) und allgemeines Unwohlsein (spiegelt sich in den Haltungs- und Bewegungswerten wider) der Mäuse sowie den Tod bei einigen der gesunden jungen Kontrollen beobachtet haben. Die verschlimmerten Krankheitssymptome bei koinfizierten Mäusen sind wahrscheinlich sowohl auf die bakterielle Ausbreitung in die Lunge als auch auf eine gestörte Virusclearance bei Mäusen mit Pneumokokken-Trägerzurückzuführen 23. Eine Einschränkung des Modells besteht darin, dass die Inzidenz klinischer Erkrankungen und bakterieller Ausbreitung aus dem Nasopharynx zwischen Mäusen variiert und vom Bakterienstamm, dem Wirtsalter und dem Genotypbeeinflusst wird 21,22,23. Aus diesem Grund kann bei invasiven Stämmen das Fortschreiten von einer lokalisierten Infektion (ohne nachweisbare Bakteriämie) bis zum Tod innerhalb von 24 Stunden erfolgen. Um eine echte Beurteilung der systemischen Ausbreitung zu erhalten, sollte die Bakteriämie daher in kürzeren Intervallen (alle 6-12 Stunden) beobachtet werden. Ebenso kann sich der Krankheitsscore schnell ändern, insbesondere in den ersten 72 Stunden nach einer Koinfektion. Um die Krankheitssymptome genau zu verfolgen, ist es daher ratsam, die Mäuse dreimal täglich an den Tagen 1-3 nach der IAV-Infektion zu überwachen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Modell die Bewegung von S. pneumoniae von einem asymptomatischen Kolonisator des Nasopharynx zu einem Erreger repliziert, der bei einer IAV-Infektion eine pulmonale und systemische Erkrankung verursachen kann. In diesem Modell löst IAV den Übergang von S. pneumoniae aus, indem es das bakterielle Verhalten im Nasopharynx modifiziert, die bakterielle Ausbreitung in die Lunge erhöht und die antibakterielle Immunität verändert23. In ähnlicher Weise stumpft die bakterielle Übertragung die antiviralen Immunantworten ab und beeinträchtigt die IAV-Clearance aus der Lunge23. Dies macht dieses Modell ideal für die Analyse von Veränderungen in der Immunantwort bei einzelnen und polymikrobiellen Infektionen. Darüber hinaus ist der Krankheitsverlauf nach einer Koinfektion zum Teil vom Pneumokokkenstamm im Nasen-Rachen-Raum abhängig. Daher eignet sich das Modell, um die bakteriellen Faktoren zu analysieren, die für die asymptomatische Besiedlung im Vergleich zur pathogenen Transition von S. pneumoniae erforderlich sind. Schließlich reproduziert dieses Modell die Anfälligkeit des Alterns für Koinfektionen, und obwohl dies hier nicht getestet wurde, kann es leicht verwendet werden, um den Einfluss des Wirtshintergrunds auf den Krankheitsverlauf zu beurteilen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Aufteilung von Übertragung und Krankheit in verschiedene Schritte die Möglichkeit bietet, die genetischen Varianten sowohl der Erreger als auch des Wirts zu analysieren, was eine detaillierte Untersuchung der Interaktionen eines wichtigen Pathobionten mit dem Wirt in verschiedenen Phasen des Krankheitsverlaufs ermöglicht. In Zukunft kann dieses Modell verwendet werden, um Behandlungsoptionen für gefährdete Wirte maßzuschneidern.

Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) sind grampositive Bakterien, die sich asymptomatisch im Nasen-Rachen-Raum der meisten gesunden Personen befinden 1,2. Begünstigt durch Faktoren, die nicht vollständig definiert sind, können Pneumokokken von gutartigen Kolonisatoren des Nasen-Rachen-Raums zu Krankheitserregern übergehen, die sich auf andere Organe ausbreiten und zu schweren Infektionen führen, einschließlich Mittelohrentzündung, Lungenentzündung und Bakteriämie3. Das Erscheinungsbild einer Pneumokokkenerkrankung hängt zum Teil von stammspezifischen Unterschieden ab, einschließlich des Serotyps, der auf der Zusammensetzung der Kapselpolysaccharide basiert. Bisher wurden über 100 Serotypen charakterisiert, von denen einige mit invasiveren Infektionen assoziiert sind 4,5. Mehrere andere Faktoren erhöhen das Risiko einer Pneumokokken-Erkrankung. Ein solcher Faktor ist die Virusinfektion, bei der das Risiko einer Pneumokokken-Pneumonie durch IAV um das 100-fache erhöht ist 6,7. Historisch gesehen ist S. pneumoniae eine der häufigsten Ursachen für sekundäre bakterielle Pneumonien nach Influenza und wird mit schlechteren Ergebnissen in Verbindung gebracht8. Ein weiterer großer Risikofaktor ist das fortgeschrittene Alter. Tatsächlich ist S. pneumoniae die Hauptursache für ambulant erworbene bakterielle Pneumonien bei älteren Menschen über 65 Jahren 9,10. Ältere Menschen machen die Mehrheit (>75%) der Todesfälle aufgrund von Lungenentzündung und Influenza aus, was darauf hindeutet, dass die beiden Risikofaktoren - Alterung und IAV-Infektion - die Krankheitsanfälligkeit synergistisch verschlechtern11,12,13,14. Die Mechanismen, durch die eine Virusinfektion den Übergang von Pneumokokken von asymptomatischen Kolonisatoren zu invasiven Erregern bewirkt, und wie dies durch Wirtsfaktoren beeinflusst wird, sind jedoch noch wenig geklärt. Dies ist vor allem auf das Fehlen eines Kleintiermodells zurückzuführen, das den Übergang von der asymptomatischen Pneumokokken-Besiedlung zur kritischen klinischen Erkrankung rekapituliert.
Koinfektionsstudien wurden klassischerweise an Mäusen durchgeführt, die 7 Tage nach einer Influenzainfektion mit Pneumokokken direkt in die Lunge inokuliert wurden15,16. Dies reproduziert die Anfälligkeit für sekundäre bakterielle Pneumonien und ist ideal, um zu untersuchen, wie antivirale Immunantworten die antibakterielle Abwehr beeinträchtigen17. Längsschnittstudien am Menschen haben jedoch gezeigt, dass der Pneumokokken-Transport im Nasopharynx, wo die Bakterien asymptomatische Biofilme bilden können18, einheitlich mit invasiven Erkrankungen assoziiert ist19,20. Bakterielle Isolate aus Infektionen des Mittelohrs, der Lunge und des Blutes sind genetisch identisch mit denen, die im Nasen-Rachen-Raum vorkommen20. Um den Übergang von einer asymptomatischen Trägerkrankheit zu einer invasiven Erkrankung nach einer IAV-Infektion zu untersuchen, wurde daher ein Modell etabliert, in dem Mäusen intranasal Biofilm-gewachsene Pneumokokken verabreicht wurden, gefolgt von einer IAV-Infektion des Nasopharynx21,22. Eine Virusinfektion der oberen Atemwege führte zu Veränderungen in der Wirtsumgebung, die zur Ausbreitung von Pneumokokken aus Biofilmen und deren Ausbreitung in die unteren Atemwege führten21. Diese dispergierten Bakterien wiesen eine hochregulierte Expression von Virulenzfaktoren auf, die für die Infektion wichtig sind, und wandelten sie von Kolonisatoren in Krankheitserreger um21. Diese Beobachtungen verdeutlichen die komplexe Interaktion zwischen Virus, Wirt und Bakterien und zeigen, dass die durch eine Virusinfektion ausgelösten Veränderungen des Wirts einen direkten Einfluss auf das Verhalten der Pneumokokken haben, was wiederum den Verlauf der bakteriellen Infektion verändert. Dieses Modell ist jedoch nicht in der Lage, die beim Menschen beobachteten schweren Krankheitszeichen zu rekapitulieren, wahrscheinlich weil das Virus auf die Nasenhöhle beschränkt ist und die systemischen Auswirkungen einer Virusinfektion auf die Immunität des Wirts und die Lungenschädigung nicht rekapituliert werden.
Wir haben kürzlich ein Modell entwickelt, das die komplexe Interaktion zwischen Wirt und Krankheitserregern berücksichtigt, aber auch die beim Menschen beobachtete Schwere der Krankheit genauer nachahmt23. In diesem Modell werden Mäuse zunächst intranasal mit im Biofilm gewachsenen Pneumokokken infiziert, um eine asymptomatische Übertragung zu erreichen, gefolgt von einer IAV-Infektion sowohl des Nasen-Rachenraums als auch der Lunge. Dies führte zu einer bakteriellen Ausbreitung in die Lunge, einer Lungenentzündung und einer Erkrankung, die bei einem Bruchteil der jungen Mäuse tödlich endete23. Diese frühere Studie zeigte, dass sowohl eine virale als auch eine bakterielle Infektion die Abwehr des Wirts veränderten: Die Virusinfektion förderte die bakterielle Verbreitung, und eine vorherige bakterielle Besiedlung beeinträchtigte die Fähigkeit des Wirts, den pulmonalen IAV-Spiegel zu kontrollieren23. Die Untersuchung der Immunantwort zeigte, dass eine IAV-Infektion die antibakterielle Aktivität der neutrophilen Granulozyten verringerte, während die bakterielle Besiedlung die für die antivirale Abwehr entscheidende Typ-I-Interferonantwort abstumpfte23. Wichtig ist, dass dieses Modell die Anfälligkeit des Alterns reproduziert. Im Vergleich zu jungen Mäusen zeigten alte Mäuse früher Krankheitsanzeichen, zeigten schwerere klinische Erkrankungen und erlagen häufiger einer Infektion23. Die in diesem Manuskript vorgestellte Arbeit zeigt, dass der Ausmaß der Erkrankung auch vom Bakterienstamm abhängt, da invasive Pneumokokkenstämme eine effizientere Ausbreitung bei IAV-Infektion zeigen, offenkundigere Anzeichen einer Lungenentzündung zeigen und im Vergleich zu nicht-invasiven Stämmen zu beschleunigten Krankheitsraten führen. Somit erlaubt dieses S. pneumoniae/IAV-Koinfektionsmodell die detaillierte Untersuchung sowohl von Erreger- als auch von Wirtsfaktoren und eignet sich gut für die Untersuchung von Immunantworten auf polymikrobielle Infektionen in den verschiedenen Phasen des Krankheitsverlaufs.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4-Aminobenzoic acid&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1267318</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>650101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-201-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC147440250</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501785325</td>
			<td>Microcyrstalline cellulose&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix Fixation Buffer&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BDB554655</td>
			<td>Fixation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Fortessa</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene Tubing&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>427410</td>
			<td>Tubing for nasal lavage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (1 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Microtainer Capillary Blood Collector and BD Microgard Closure</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-675-185</td>
			<td>Blood collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6233703</td>
			<td>Mix IV stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC230090010</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>#000644</td>
			<td>Mice used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C77-500</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD103 BV 421</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB562771</td>
			<td>Clone: M290 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>50-112-9622</td>
			<td>Clone: M1/70, DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB565592</td>
			<td>Clone: N418 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 AF 488</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>OB153030</td>
			<td>Clone: 145-2C11 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 V450</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>BDB560470</td>
			<td>Clone: RM4.5 DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 APC eF-780</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-9642</td>
			<td>Clone: 30-F11 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 PE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>50-103-70</td>
			<td>Clone: 30-F11 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#945; BV 650</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>BDB563234</td>
			<td>Clone: 53-6.7 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC110290500</td>
			<td>Final supplement to CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-761-107</td>
			<td>Filter sterilzation apparatus&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Tissue Culture Treated T-25 Flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-126-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Clear Multiple Well Plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-201-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;DMEM With L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose; Without Sodium Pyruvate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT10017CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanocobalamin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC405925000</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D39</td>
			<td>National Collection of Type Culture (NCTC)</td>
			<td>NCTC 7466</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Alanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1023114</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Calcium pantothenate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC243301000</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical&#160;</td>
			<td>LS002147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagles Minimum Essential Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4616-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EF3030</td>
			<td>Center for Disease Control and Prevention&#160;</td>
			<td>Available via the isolate bank request</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae strain, request using strain name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F480 PE Cy7</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-9713</td>
			<td>Clone: BMB DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>50 mL round bottom tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td>15 mL round bottom tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;Round-Bottom Polystyrene Test Tubes (5 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-5</td>
			<td>FACS tubes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric Nitrate Nonahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>I110-100</td>
			<td>Mix III stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Delicate Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-951-5</td>
			<td>Instruments used for harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable Inoculating Loops&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-602</td>
			<td>Inoculating loops&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Dissecting Tissue Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-812-38</td>
			<td>Forceps for harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-137</td>
			<td>Micocentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Sterile Syringes for Single Use (10 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC216630500</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI 1640 (ATCC)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A1049101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14025134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;MEM (Temin&#39;s modification) (2x), no phenol red</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-935-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>25-200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AA3643530</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1202414</td>
			<td>Mix II stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen UltraComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-112-9040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1517836</td>
			<td>Mix III stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6027918</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1573814</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAB2147322</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1352022</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1043518</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1038914</td>
			<td>Final supplement to CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cystine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1376218</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC156211000</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O2956-100</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC166150250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>50-112-1524</td>
			<td>Clone: N/A DF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC166170250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP385-100</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6222514</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1031822</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low endotoxin BSA&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A1470-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1323814</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1019922</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC132660250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC138930250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1023014</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1272014</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6C BV 605</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB563011</td>
			<td>Clone: AL-21 DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6G AF 488&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>NC1102120</td>
			<td>Clone: IA8, DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td>MDCK cell line for PFU analuysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate 7-Hydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>60-019-68</td>
			<td>CDM starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M113-500</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Fc Block</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB553142</td>
			<td>Clone: 2.4G2 DF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MWI VETERINARY&#160;PURALUBE VET OINTMENT</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC1886507</td>
			<td>Eye lubricant for infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCI-H292 mucoepidermoid carcinoma cell line&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1848</td>
			<td>H292 lung epithelial cell line for biofilm growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacinamide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>18-604-792</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK 1.1 AF 700</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-4692</td>
			<td>Clone: PK136 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxyrase For Broth 50Ml Bottle 1/Pk</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-200-5299</td>
			<td>To remove oxygen from liquid cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4% in PBS</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>J19932-K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pivetal Isoflurane&#160;</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-8440</td>
			<td>Isoflurane for anesthesia during infection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P285-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal hydrochloride&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC352710250</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxamine dihydrochloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6267906</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC132350250</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0530-500G</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP922I-500</td>
			<td>For FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>Starter stock and final supplement to CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR APC&#160;</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-8889</td>
			<td>Clone: GL-3 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; APC-Cy7</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>BDB560656</td>
			<td>Clone: H57-597 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Blood Agar with Gentamicin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>R01227</td>
			<td>Blood agar plates with the antibiotic gentamicin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Trypsin, TPCK Treated</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PI20233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine hydrochloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC148991000</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIGR4</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>BAA-334</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC157300250</td>
			<td>Mix II stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worthington Biochemical Corporation&#160;Collagenase, Type 2, 1 g</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9693955</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model for the transition of streptococcus pneumoniae from colonizer to pathogen upon viral co-infection recapitulates age-exacerbated illness

Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) ist bei den meisten Menschen ein asymptomatischer Kolonisator des Nasen-Rachen-Raumes, kann sich aber bei einer Infektion mit dem Influenza-A-Virus (IAV) zu einem pulmonalen und systemischen Erreger entwickeln. Das fortgeschrittene Alter erhöht die Anfälligkeit des Wirts für sekundäre Pneumokokken-Pneumonien und ist mit einer Verschlechterung des Krankheitsverlaufs verbunden. Die Wirtsfaktoren, die diese Prozesse antreiben, sind nicht gut definiert, was zum Teil auf einen Mangel an Tiermodellen zurückzuführen ist, die den Übergang von einer asymptomatischen Kolonisierung zu einer schweren klinischen Erkrankung reproduzieren. 
Diese Arbeit beschreibt ein neuartiges Mausmodell, das den Übergang von Pneumokokken von der asymptomatischen Übertragung zur Krankheit nach einer Virusinfektion nachbildet. In diesem Modell werden Mäuse zunächst intranasal mit im Biofilm gezüchteten Pneumokokken beimpft, um eine asymptomatische Übertragung zu erreichen, gefolgt von einer IAV-Infektion sowohl des Nasen-Rachenraums als auch der Lunge. Dies führt zu einer bakteriellen Ausbreitung in die Lunge, einer Lungenentzündung und offensichtlichen Krankheitsanzeichen, die bis zur Letalität führen können. Der Grad der Erkrankung ist abhängig vom Bakterienstamm und den Wirtsfaktoren. 
Wichtig ist, dass dieses Modell die Anfälligkeit des Alterns reproduziert, denn im Vergleich zu jungen Mäusen zeigen alte Mäuse schwerere klinische Erkrankungen und erliegen häufiger der Krankheit. Durch die Aufteilung von Übertragung und Krankheit in verschiedene Schritte und die Möglichkeit, die genetischen Varianten sowohl des Erregers als auch des Wirts zu analysieren, ermöglicht dieses S. pneumoniae/IAV-Koinfektionsmodell die detaillierte Untersuchung der Interaktionen eines wichtigen Pathobolds mit dem Wirt in verschiedenen Phasen des Krankheitsverlaufs. Dieses Modell kann auch als wichtiges Werkzeug zur Identifizierung potenzieller therapeutischer Ziele gegen sekundäre Pneumokokken-Pneumonien bei empfänglichen Wirten dienen.

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A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

Diese Arbeit beschreibt ein neuartiges Mausmodell für den Übergang von Pneumokokken von einem asymptomatischen Kolonisator zu einem krankheitsverursachenden Erreger während einer Virusinfektion. Dieses Modell kann leicht angepasst werden, um polymikrobielle und Wirt-Pathogen-Interaktionen während der verschiedenen Phasen des Krankheitsverlaufs und über verschiedene Wirte hinweg zu untersuchen.

Ein Mausmodell für den Übergang von Streptococcus pneumoniae vom Kolonisator zum Krankheitserreger nach viraler Koinfektion rekapituliert altersbedingte Erkrankung

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an asymptomatic colonizer of the nasopharynx in most individuals but can progress to a pulmonary and systemic ...

Diese Methode beschreibt ein neues Mausmodell zur Untersuchung des Übergangs von Pneumokokken von einem asymptomatischen Kolonisator zu einem krankheitserregenden Erreger während einer Virusinfektion. Es ahmt genauer nach, was beim Menschen passiert. Dieses Modell kann ein wichtiges Werkzeug sein, um potenzielle therapeutische Ziele gegen die sekundäre Pneumokokken-Pneumonie in empfänglichen Wirten zu identifizieren.Dieses Modell reproduziert die Anfälligkeit des Alterns. Daher kann es verwendet werden, um zu verstehen, welche Aspekte des Wirts mit zunehmendem Alter defekt werden, und es uns ermöglichen, maßgeschneiderte Behandlungsoptionen für gefährdete ältere Wirte zu entwickeln. Die Züchtung von Pneumokokken-Biofilmen ist eine Herausforderung, da die verschiedenen Stämme unterschiedlich lange brauchen.Mein Rat ist, zu versuchen, den Biofilm zu züchten, bevor Sie die Tierstudie durchführen. Sobald die H292-Zellen zu 100 % konfluent sind, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Geben Sie dann 250 Mikroliter 4%Paraformaldehyd pro Well hinzu, um die Zellen zu fixieren, und inkubieren Sie sie eine Stunde lang auf Eis oder über Nacht bei vier Grad Celsius.Streptococcus pneumoniae Stamm von Interesse auf Blutagarplatte legen und über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Beimpfen Sie am nächsten Tag die Bakterien von der Platte in frische, chemisch definierte Medien oder CDM plus Oxyrase, indem Sie die Bakterien von der Platte waschen, indem Sie einen Milliliter CDM plus Oxyrase hinzufügen und die Bakterienkolonien vorsichtig mit der Seite einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze anheben, wobei Sie darauf achten, dass der Agar nicht abgekratzt wird. Verdünnen Sie die Bakterienkultur in CDM plus Oxyrase auf eine Ausgangs-OD 600 von 0,05.Dann züchten Sie die Bakterien in einem locker verschlossenen konischen 50-Milliliter-Röhrchen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bis ein OD von 0,2 erreicht ist. Als nächstes wird das Bakterienkulturröhrchen vorgewirbelt. Säen Sie 0,5 Milliliter der Kultur auf die fixierten H292-Zellen und fügen Sie weitere 0,5 Milliliter CDM plus Oxyrase-Medium pro Vertiefung hinzu.Geben Sie CDM plus Oxyrase in die Kontrollvertiefungen ohne Bakterien. Inkubieren Sie die Platte 48 Stunden lang bei 34 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Ersetzen Sie alle 12 Stunden nach der ersten Aussaat vorsichtig die 0,5 Milliliter des Mediums durch frisches CDM plus Oxyrase.Achten Sie darauf, die Bildung von Biofilm nicht zu stören. Überprüfen Sie die Unterseite der Platte auf Biofilm und achten Sie darauf, dass die Trübung im Laufe der Zeit aufgrund des Biofilmwachstums zunimmt. Entfernen Sie nach 48 Stunden den Überstand und waschen Sie den Biofilm zweimal mit einem Milliliter PBS.Anschließend den Biofilm in einem Milliliter frischem CDM resuspendieren und kräftig auf und ab pipettieren, um den Biofilm anzuheben. Für jeden Bakterienstamm wird die Kultur aus allen Vertiefungen in ein 50-Milliliter-Röhrchen gefüllt. Mischen Sie gut, indem Sie das fest verschlossene Röhrchen mehrmals vorsichtig auf und ab kippen.Als nächstes werden 40 % Glycerin und CDM in gleichen Mengen hinzugefügt, um eine bakterielle Suspension mit einer Endkonzentration von 20 % Glycerin zu erhalten. Einen Milliliter in ein Mikrozentrifugenröhrchen aliquotieren, auf Trockeneis schockgefrieren und bei minus 80 Grad Celsius aufbewahren. Tauen Sie die im Biofilm gewachsenen Aliquots auf Eis auf und schleudern Sie sie fünf Minuten lang bei 1.700 g.Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu beschädigen. Waschen Sie dann das Pellet, indem Sie es in einem Milliliter PBS resuspendieren und erneut schleudern. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in dem Volumen, das zum Erreichen der gewünschten Konzentration erforderlich ist.Inokulieren Sie die C57 black six männliche Maus intranasal mit fünf mal 10 bis sechsten koloniebildenden Einheiten oder KBE, indem fünf Mikroliter des verdünnten Inokulums in jede Naris pipettiert werden. Halten Sie die Maus nach der Inokulation fest und stabilisieren Sie den Kopf, bis das Volumen eingeatmet wird. Sobald das Virus aufgetaut ist, verdünnen Sie das Virus in PBS auf die gewünschte Konzentration.Tragen Sie vor der Narkose ophthalmisches Gleitmittel auf die Augen der Maus auf. Infizieren Sie die anästhesierte Maus sofort intratracheal mit 50 Mikrolitern von 20 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) des Influenza-A-Virus oder IAV, indem Sie die Zunge mit einer stumpfen Pinzette aus dem Mund ziehen und das Flüssigkeitsvolumen in die Luftröhre pipettieren. Nach der Genesung werden 10 Mikroliter 200 PFU IAV mit der zuvor beschriebenen Impfmethode intranasal inokuliert.Schneiden Sie für die Lungenentnahme mit einer Sezierschere die Seiten des freiliegenden Brustkorbs ab und ziehen Sie die Rippen vorsichtig nach oben in Richtung des Kopfes der Maus, um das Herz freizulegen. Führen Sie eine 25-Gauge-Nadel, die an einer mit PBS vorgefüllten 10-Milliliter-Spritze befestigt ist, in die rechte Herzkammer ein und beginnen Sie langsam mit der Perfurierung. Achten Sie auf eine Bleiche der Lunge als Indikator für eine erfolgreiche Durchblutung.Spülen Sie langsam, um einen Bruch des Lungengewebes zu vermeiden. Heben Sie das Herz mit einer Pinzette an und machen Sie einen Schnitt, um Lunge und Herz zu trennen. Nehmen Sie nach der Trennung alle Lungenlappen mit einer Pinzette auf und spülen Sie sie in einer Schale mit sterilem PBS aus, um das restliche Blut zu entfernen.In einer Petrischale die Lunge in kleine Stücke schneiden und gut vermischen. Entfernen Sie die Hälfte der Lungenmischung, um die bakterielle KBE oder das virale PFU zu bestimmen, und legen Sie sie zur Homogenisierung in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden, das mit 0,5 Millilitern PBS vorgefüllt ist. Entfernen Sie die andere Hälfte der Lunge für die Durchflusszytometrie und legen Sie sie in eine mit Nichtgewebekultur behandelte 24-Well-Platte, wobei jede Well mit 0,5 Millilitern RP10 vorgefüllt ist.Bis zur Verarbeitung bei Raumtemperatur stehen lassen. Um das gesammelte Gewebe zu homogenisieren, reinigen Sie die Homogenisatorsonde, indem Sie sie in 70%iges Ethanol einlegen und den Homogenisator 30 Sekunden lang mit 60%iger Leistung einschalten. Wiederholen Sie diesen Schritt 10 Sekunden lang in sterilem Wasser.Homogenisieren Sie jedes Gewebe eine Minute lang. Zur Zählung der Bakterienzahlen Plattenreihenverdünnungen auf Blutagarplatten. Um die Gesamtkbe zu berechnen, verwenden Sie 10 Mikroliter, um das endgültige Volumen in Millilitern für jede Probe zu dokumentieren und zu notieren.Die Nasopharynx-Proben werden auf Blutagarplatten plattiert, die mit drei Mikrogramm Gentamycin pro Milliliter ergänzt werden, um das Wachstum von S-Pneumonien zu selektieren und gleichzeitig das Wachstum anderer Mikroorganismen zu hemmen. Über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Für die Durchflusszytometrie werden 500 Mikroliter Aufschlusspuffer in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte gegeben, die eine Lungenprobe enthält.Inkubieren Sie die Platte 45 Minuten bis eine Stunde lang. Bewegen Sie als Nächstes mit einer P-1000-Mikropipette die verdaute Lunge und legen Sie sie auf den Filter. Verwenden Sie dann den Kolben einer Drei-Milliliter-Spritze, um die Probe zu zerdrücken.Das Inokulum von S. pneumoniae führt zu einer gleichmäßigen Übertragung von Pneumokokken, die auf den Nasenrachenraum beschränkt ist, während eine systematische Ausbreitung vermieden wird. Das Krankheitsbild in S pneumoniae IAV koinfizierten Mäusen war abhängig vom Bakterienstamm. Während es bei keinem der Stämme einen signifikanten Unterschied in der Bakterienzahl des Nasopharynx gab, verbreiteten sich S pneumoniae, TIGR4 und D39, aber nicht EF3030 48 Stunden nach der IAV-Infektion in die Lunge.40% der Mäuse, die mit S pneumoniae TIGR4 infiziert waren, zeigten eine bakterielle Ausbreitung in die Lunge, von denen die Hälfte bakteriämisch wurde. Mäuse, die mit S pneumoniae D39 infiziert waren, zeigten eine 100%ige Ausbreitung in die Lunge, und die Hälfte von ihnen erlitt eine Bakteriämie. Bei der Verfolgung des Gesamtüberlebens, unabhängig vom Bakterienstamm, war die Überlebensrate der koinfizierten Mäuse signifikant niedriger als die der Mäuse, die einzeln mit S-Pneumonien konfrontiert wurden.Dieses Modell wurde auch verwendet, um das Vorhandensein verschiedener Immunzellen in der Lunge nach einer IAV-Infektion zu beurteilen. Die Bakterienstämme D39 und TIGR4 führten zu einem signifikanten Anstieg des Einstroms von entzündlichen Immunzellen wie Neutrophilen und Monozyten aus dem Blutkreislauf, während dies bei EF3030 nicht der Fall war. Die IAV-Infektion allein führte zu einem signifikanten Anstieg des Einstroms von Immunzellen wie NK-Zellen und Gamma-Delta-T-Zellen über den Ausgangswert.Diese antiviralen Reaktionen waren bei Mäusen, die intranasal mit S-pneumonien infiziert waren, vor der viralen Provokation signifikant abgeschwächt. Bei einzeln infizierten Mäusen unterschieden sich die Virustiter nicht zwischen der jungen und der älteren Kohorte. Alte Mäuse zeigten früher und signifikant schwerere Krankheitssymptome und starben schneller, innerhalb von 24 Stunden, während die jungen Kontrollen die Infektion besser überlebten.Die Aufteilung von Übertragung und Krankheit in verschiedene Schritte ermöglicht es uns, sowohl die Immunantwort als auch die bakteriellen und/oder viralen Faktoren zu untersuchen, die in verschiedenen Phasen des Krankheitsverlaufs wichtig sind. Wir hoffen, dass dieses Modell von anderen Laboren adaptiert wird, um andere polymikrobielle Interaktionen und Interaktionen zwischen Wirtserregern und Wirtserregern in verschiedenen Phasen des Krankheitsverlaufs und über die verschiedenen Wirte hinweg zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Mit Bioluminescent Imaging, um Synergie von Untersuchen Streptococcus pneumoniae Und Influenza A Virus in Infant Mäuse

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging von Bacillus subtilis Und Streptococcus pneumoniae Verwendung von Automated Zeitraffer-Mikroskopie

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Die Nutzung der EpiAirway Modell zur Charakterisierung Langfristige Host-Pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Die<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Studieren Erreger und Wirt Beiträge zur Infectious Colitis

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Charakterisierung von Entzündungsreaktionen während der intranasalen Kolonisation mit Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Überwachen von Änderungen in Membran-Polarity, Membrane Integrity und intrazelluläre Ionenkonzentrationen in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Verwenden von Fluoreszenzfarbstoffen

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

Kapsel Serotypisierung von<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Verwenden der Quellung Reaktion

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

Einem Mausmodell für Pathogen-induzierten chronischen Entzündung an lokalen und systemischen Seiten

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Kapsel Serotypisierung<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Durch Latexagglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Messung der Immunantwort auf Malaria im Kontext der HIV-Koinfektion

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...