Name: a mouse model for the transition of streptococcus pneumoniae from colonizer to pathogen upon viral co-infection recapitulates age-exacerbated illness
Uploaded: 2022-09-28T14:15:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness at JoVE.

Vorremmo ringraziare Nick Lenhard per la lettura critica e l'editing di questo manoscritto. Vorremmo anche ringraziare Andrew Camilli e Anthony Campagnari per i ceppi batterici e Bruce Davidson per i ceppi virali. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health Grant (R21AG071268-01) a J.L. e dal National Institute of Health Grants (R21AI145370-01A1), (R01AG068568-01A1), (R21AG071268-01) a E.N.B.G.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

La maggior parte degli studi sperimentali esistenti sulla co-infezione S. pneumoniae/IAV si basano sulla consegna batterica nei polmoni di topi pre-infettati da IAV. Questi modelli hanno contribuito a identificare i cambiamenti nell'ambiente polmonare e nella risposta immunitaria sistemica che rendono l'ospite suscettibile all'infezione batterica secondaria 15,16,17,32,33,34,35,36,37. Tuttavia, questi modelli non sono riusciti a imitare la transizione di S. pneumoniae da un colonizzatore asintomatico a un agente patogeno in grado di causare gravi infezioni polmonari e sistemiche. Inoltre, questi modelli non sono adatti per studiare i fattori dell'ospite e le interazioni ospite-patogeno nel tratto respiratorio superiore che contribuiscono alla suscettibilità alle infezioni. Un modello precedente per il movimento degli pneumococchi dal rinofaringe al polmone dopo l'infezione da IAV si basava sull'infezione batterica del rinofaringe seguita da infezione virale. Tuttavia, non è riuscito a riprodurre i gravi segni di malattia osservati nei pazienti umani21. Il modello di infezione murina modificato qui descritto ricapitola la transizione di S. pneumoniae da trasporto asintomatico a un patogeno che causa gravi malattie cliniche.
Un passo fondamentale di questo modello è stabilire l'infezione da S. pneumoniae nel rinofaringe. Streptococcus pneumoniae forma biofilm e colonizza il rinofaringe a diverse efficienze 21,38. Per stabilire un'infezione consistente, sono necessari almeno 5 × 106 CFU dei ceppi batterici cresciuti in biofilm finora testati23. Si raccomanda che qualsiasi nuovo ceppo batterico sia testato per l'infezione stabile del rinofaringe prima dell'infezione virale. Per la co-infezione virale, studi precedenti hanno scoperto che l'infezione intranasale con IAV è necessaria per la dispersione dei batteri dal rinofaringe21,22,23. In questi studi precedenti, sono stati utilizzati 500 PFU di IAV per la consegna intranasale, mentre in questo studio, 200 PFU erano sufficienti per aumentare il numero di batteri nel rinofaringe. L'infezione da IAV non è limitata alle vie aeree superiori e può diffondersi ai polmoni39,40, che è la chiave per rendere l'ambiente polmonare più permissivo per l'infezione batterica15,16,41. La consegna di IAV ai polmoni può essere ottenuta mediante somministrazione intranasale o installazione intratracheale di topi anestetizzati. Precedenti lavori con topi BALB / cByJ hanno scoperto che la consegna intranasale provoca polmonite virale21; tuttavia, l'accesso dell'inoculo ai polmoni dopo l'inoculazione intranasale è più limitato nei topi C57BL/6. Nei topi C57BL/6, l'installazione intratracheale è necessaria per una consegna coerente del virus23. In questo modello, la precedente colonizzazione batterica accelera la presentazione dei sintomi della malattia dopo l'infezione virale23. Poiché l'infezione virale può essa stessa causare sintomi di malattia con potenziale variazione della cinetica, si raccomanda di testare prima una gamma di dosi per ogni nuovo ceppo virale testato e scegliere una dose che riveli una cinetica accelerata negli ospiti co-infetti.
I polmoni forniscono un'altra lettura critica per la valutazione della malattia in questo modello. Per la valutazione del carico patogeno e dell'afflusso di cellule immunitarie, è possibile utilizzare un polmone dello stesso topo. Tuttavia, poiché la gravità dell'infezione e dell'infiammazione può differire tra i lobi, si raccomanda di non prendere diversi lobi dello stesso polmone per le varie valutazioni. Piuttosto, tutti i lobi possono essere tritati in piccoli pezzi, mescolati bene insieme e quindi analizzati ugualmente per le diverse valutazioni. Allo stesso modo, il rinofaringe può essere utilizzato per l'enumerazione di CFU batterico o PFU virale e risposta immunitaria. Tuttavia, il numero di cellule ottenute dai lavaggi e dai tessuti è troppo basso per eseguire la citometria a flusso senza raggruppare i campioni dai topi all'interno dello stesso gruppo. In alternativa, l'infiammazione nel rinofaringe può essere valutata istologicamente23.
Una caratteristica critica di questo modello è che ricapitola la malattia clinica osservata nei pazienti. Nell'uomo, la polmonite da pneumococco secondaria a seguito di infezione da IAV spesso provoca evidenti segni di malattia, tra cui tosse, dispnea, febbre e dolori muscolari che possono portare a ricoveri ospedalieri, insufficienza respiratoria e persino morte 8,15,42,43. Questo modello riassume i gravi segni di malattia clinica osservati negli esseri umani in termini di difficoltà respiratoria (riflessa nel punteggio di respirazione) e malessere generale (riflesso nei punteggi di postura e movimento) mostrati dai topi, nonché la morte in alcuni dei controlli giovani sani. I sintomi esacerbati della malattia nei topi co-infetti sono probabilmente il risultato sia della diffusione batterica ai polmoni che della compromissione della clearance virale nei topi con trasporto pneumococcico23. Una limitazione del modello è che l'incidenza della malattia clinica e della disseminazione batterica dal rinofaringe varia tra i topi ed è influenzata dal ceppo batterico, dall'età dell'ospite e dal genotipo21,22,23. Riflettendo questo, per i ceppi invasivi, la progressione dall'infezione localizzata (senza batteriemia rilevabile) alla morte può avvenire entro 24 ore. Pertanto, per una vera valutazione della diffusione sistemica, la batteriemia deve essere seguita a intervalli più brevi (ogni 6-12 ore). Allo stesso modo, il punteggio della malattia può cambiare rapidamente, in particolare nelle prime 72 ore successive alla co-infezione. Pertanto, per monitorare da vicino i sintomi della malattia, è consigliabile monitorare i topi tre volte al giorno per i giorni 1-3 dopo l'infezione da IAV.
In sintesi, questo modello replica il movimento di S. pneumoniae da un colonizzatore asintomatico del rinofaringe a un patogeno in grado di causare malattie polmonari e sistemiche in seguito all'infezione da IAV. In questo modello, IAV innesca la transizione di S. pneumoniae modificando il comportamento batterico nel rinofaringe, aumentando la diffusione batterica al polmone e alterando l'immunità antibatterica23. Allo stesso modo, il trasporto batterico attenua le risposte immunitarie antivirali e altera la clearance IAV dai polmoni23. Ciò rende questo modello ideale per analizzare i cambiamenti nelle risposte immunitarie nelle infezioni singole rispetto a quelle polimicrobiche. Inoltre, il decorso della malattia dopo la co-infezione dipende, in parte, dal ceppo di pneumococchi presente nel rinofaringe. Pertanto, il modello è adatto a sezionare i fattori batterici necessari per la colonizzazione asintomatica rispetto alla transizione patogena di S. pneumoniae. Infine, questo modello riproduce la suscettibilità dell'invecchiamento alle co-infezioni e, sebbene questo non sia stato testato qui, può essere facilmente utilizzato per valutare l'impatto del background dell'ospite sul decorso della malattia. In conclusione, separare il trasporto e la malattia in fasi distinte offre l'opportunità di analizzare le varianti genetiche sia dei patogeni che dell'ospite, consentendo l'esame dettagliato delle interazioni di un importante patobionte con l'ospite nelle diverse fasi della progressione della malattia. Andando avanti, questo modello può essere utilizzato per personalizzare le opzioni di trattamento per gli ospiti vulnerabili.

Streptococcus pneumoniae (pneumococco) sono batteri Gram-positivi che risiedono asintomaticamente nel rinofaringe della maggior parte degli individui sani 1,2. Promossi da fattori non completamente definiti, gli pneumococchi possono passare da colonizzatori benigni del rinofaringe a patogeni che si diffondono ad altri organi con conseguenti infezioni gravi, tra cui otite media, polmonite e batteriemia3. La presentazione della malattia pneumococcica dipende, in parte, dalle differenze specifiche del ceppo, incluso il sierotipo, che si basa sulla composizione dei polisaccaridi capsulari. Ci sono stati oltre 100 sierotipi caratterizzati finora, e alcuni sono associati a infezioni più invasive 4,5. Diversi altri fattori aumentano il rischio di malattia da pneumococco. Uno di questi fattori è l'infezione virale, in cui il rischio di polmonite da pneumococco è aumentato di 100 volte da IAV 6,7. Storicamente, S. pneumoniae è una delle cause più comuni di polmonite batterica secondaria dopo l'influenza ed è associata a esiti peggiori8. Un altro importante fattore di rischio è l'età avanzata. Infatti, S. pneumoniae è la principale causa di polmonite batterica acquisita in comunità in individui anziani sopra i 65 anni 9,10. Gli individui anziani rappresentano la maggioranza (>75%) dei decessi dovuti a polmonite e influenza, indicando che i due fattori di rischio - invecchiamento e infezione da IAV - peggiorano sinergicamente la suscettibilità alla malattia11,12,13,14. Tuttavia, i meccanismi attraverso i quali l'infezione virale induce la transizione degli pneumococchi da colonizzatore asintomatico a patogeno invasivo e come questo è modellato dai fattori dell'ospite rimangono scarsamente definiti. Ciò è in gran parte dovuto all'assenza di un piccolo modello animale che ricapitola la transizione dalla colonizzazione pneumococcica asintomatica alla malattia clinica critica.
Studi di co-infezione sono stati classicamente modellati in topi inoculati con pneumococchi direttamente nei polmoni 7 giorni dopo l'infezione influenzale15,16. Questo riproduce la suscettibilità alla polmonite batterica secondaria ed è ideale per studiare come le risposte immunitarie antivirali compromettono le difese antibatteriche17. Tuttavia, studi longitudinali sull'uomo hanno dimostrato che il trasporto pneumococcico nel rinofaringe, dove i batteri possono formare biofilm asintomatici18, è uniformemente associato a malattie invasive 19,20. Gli isolati batterici da infezioni dell'orecchio medio, del polmone e del sangue sono geneticamente identici a quelli trovati nel rinofaringe20. Pertanto, per studiare la transizione dal trasporto asintomatico alla malattia invasiva a seguito di infezione da IAV, è stato stabilito un modello in cui ai topi sono stati somministrati per via intranasale pneumococchi cresciuti con biofilm seguiti da infezione IAV del rinofaringe21,22. L'infezione virale delle vie aeree superiori ha portato a cambiamenti nell'ambiente ospite che hanno portato alla dispersione di pneumococchi dai biofilm e alla loro diffusione alle vie aeree inferiori21. Questi batteri dispersi avevano sovraregolato l'espressione di fattori di virulenza importanti per l'infezione, convertendoli da colonizzatori a patogeni21. Queste osservazioni evidenziano la complessa interazione tra virus, ospite e batteri e dimostrano che i cambiamenti nell'ospite innescati dall'infezione virale hanno un impatto diretto sul comportamento pneumococcico, che, a sua volta, altera il decorso dell'infezione batterica. Tuttavia, questo modello non riesce a ricapitolare i gravi segni di malattia osservati negli esseri umani, probabilmente perché il virus è limitato alla cavità nasale e gli effetti sistemici dell'infezione virale sull'immunità dell'ospite e sul danno polmonare non sono ricapitolati.
Abbiamo recentemente stabilito un modello che incorpora la complessa interazione tra l'ospite e i patogeni, ma imita anche più da vicino la gravità della malattia osservata negli esseri umani23. In questo modello, i topi vengono prima infettati per via intranasale con pneumococchi cresciuti in biofilm per stabilire un trasporto asintomatico, seguito da infezione IAV sia del rinofaringe che dei polmoni. Ciò ha provocato la disseminazione batterica ai polmoni, l'infiammazione polmonare e la malattia che è progredita fino alla letalità in una frazione di topi giovani23. Questo studio precedente ha dimostrato che sia l'infezione virale che quella batterica alteravano la difesa dell'ospite: l'infezione virale promuoveva la disseminazione batterica e la precedente colonizzazione batterica comprometteva la capacità dell'ospite di controllare i livelli di IAV polmonare23. L'esame della risposta immunitaria ha rivelato che l'infezione da IAV ha diminuito l'attività antibatterica dei neutrofili, mentre la colonizzazione batterica ha attenuato la risposta all'interferone di tipo I critica per la difesa antivirale23. È importante sottolineare che questo modello ha riprodotto la suscettibilità all'invecchiamento. Rispetto ai topi giovani, i topi anziani mostravano segni di malattia prima, mostravano malattie cliniche più gravi e soccombevano all'infezione più frequentemente23. Il lavoro presentato in questo manoscritto mostra che il grado di malattia dipende anche dal ceppo batterico, perché i ceppi pneumococcici invasivi mostrano una diffusione più efficiente dopo l'infezione da IAV, mostrano segni più evidenti di infiammazione polmonare e provocano tassi accelerati di malattia rispetto ai ceppi non invasivi. Pertanto, questo modello di co-infezione S. pneumoniae/IAV consente l'esame dettagliato sia dei fattori patogeni che di quelli dell'ospite ed è adatto per lo studio delle risposte immunitarie alle infezioni polimicrobiche nelle diverse fasi della progressione della malattia.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4-Aminobenzoic acid&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1267318</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>650101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-201-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC147440250</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501785325</td>
			<td>Microcyrstalline cellulose&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix Fixation Buffer&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BDB554655</td>
			<td>Fixation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Fortessa</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene Tubing&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>427410</td>
			<td>Tubing for nasal lavage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (1 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Microtainer Capillary Blood Collector and BD Microgard Closure</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-675-185</td>
			<td>Blood collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6233703</td>
			<td>Mix IV stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC230090010</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>#000644</td>
			<td>Mice used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C77-500</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD103 BV 421</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB562771</td>
			<td>Clone: M290 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>50-112-9622</td>
			<td>Clone: M1/70, DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB565592</td>
			<td>Clone: N418 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 AF 488</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>OB153030</td>
			<td>Clone: 145-2C11 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 V450</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>BDB560470</td>
			<td>Clone: RM4.5 DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 APC eF-780</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-9642</td>
			<td>Clone: 30-F11 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 PE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>50-103-70</td>
			<td>Clone: 30-F11 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#945; BV 650</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>BDB563234</td>
			<td>Clone: 53-6.7 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC110290500</td>
			<td>Final supplement to CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-761-107</td>
			<td>Filter sterilzation apparatus&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Tissue Culture Treated T-25 Flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-126-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Clear Multiple Well Plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-201-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;DMEM With L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose; Without Sodium Pyruvate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT10017CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanocobalamin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC405925000</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D39</td>
			<td>National Collection of Type Culture (NCTC)</td>
			<td>NCTC 7466</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Alanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1023114</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Calcium pantothenate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC243301000</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical&#160;</td>
			<td>LS002147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagles Minimum Essential Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4616-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EF3030</td>
			<td>Center for Disease Control and Prevention&#160;</td>
			<td>Available via the isolate bank request</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae strain, request using strain name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F480 PE Cy7</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-9713</td>
			<td>Clone: BMB DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>50 mL round bottom tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td>15 mL round bottom tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;Round-Bottom Polystyrene Test Tubes (5 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-5</td>
			<td>FACS tubes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric Nitrate Nonahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>I110-100</td>
			<td>Mix III stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Delicate Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-951-5</td>
			<td>Instruments used for harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable Inoculating Loops&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-602</td>
			<td>Inoculating loops&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Dissecting Tissue Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-812-38</td>
			<td>Forceps for harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-137</td>
			<td>Micocentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Sterile Syringes for Single Use (10 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC216630500</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI 1640 (ATCC)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A1049101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14025134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;MEM (Temin&#39;s modification) (2x), no phenol red</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-935-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>25-200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AA3643530</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1202414</td>
			<td>Mix II stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen UltraComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-112-9040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1517836</td>
			<td>Mix III stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6027918</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1573814</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAB2147322</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1352022</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1043518</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1038914</td>
			<td>Final supplement to CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cystine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1376218</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC156211000</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O2956-100</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC166150250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>50-112-1524</td>
			<td>Clone: N/A DF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC166170250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP385-100</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6222514</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1031822</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low endotoxin BSA&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A1470-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1323814</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1019922</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC132660250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC138930250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1023014</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1272014</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6C BV 605</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB563011</td>
			<td>Clone: AL-21 DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6G AF 488&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>NC1102120</td>
			<td>Clone: IA8, DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td>MDCK cell line for PFU analuysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate 7-Hydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>60-019-68</td>
			<td>CDM starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M113-500</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Fc Block</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB553142</td>
			<td>Clone: 2.4G2 DF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MWI VETERINARY&#160;PURALUBE VET OINTMENT</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC1886507</td>
			<td>Eye lubricant for infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCI-H292 mucoepidermoid carcinoma cell line&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1848</td>
			<td>H292 lung epithelial cell line for biofilm growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacinamide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>18-604-792</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK 1.1 AF 700</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-4692</td>
			<td>Clone: PK136 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxyrase For Broth 50Ml Bottle 1/Pk</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-200-5299</td>
			<td>To remove oxygen from liquid cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4% in PBS</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>J19932-K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pivetal Isoflurane&#160;</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-8440</td>
			<td>Isoflurane for anesthesia during infection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P285-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal hydrochloride&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC352710250</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxamine dihydrochloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6267906</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC132350250</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0530-500G</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP922I-500</td>
			<td>For FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>Starter stock and final supplement to CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR APC&#160;</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-8889</td>
			<td>Clone: GL-3 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; APC-Cy7</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>BDB560656</td>
			<td>Clone: H57-597 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Blood Agar with Gentamicin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>R01227</td>
			<td>Blood agar plates with the antibiotic gentamicin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Trypsin, TPCK Treated</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PI20233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine hydrochloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC148991000</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIGR4</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>BAA-334</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC157300250</td>
			<td>Mix II stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worthington Biochemical Corporation&#160;Collagenase, Type 2, 1 g</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9693955</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model for the transition of streptococcus pneumoniae from colonizer to pathogen upon viral co-infection recapitulates age-exacerbated illness

Streptococcus pneumoniae (pneumococco ) è un colonizzatore asintomatico del rinofaringe nella maggior parte degli individui, ma può progredire in un patogeno polmonare e sistemico dopo l'infezione da virus dell'influenza A (IAV). L'età avanzata aumenta la suscettibilità dell'ospite alla polmonite da pneumococco secondaria ed è associata a un peggioramento degli esiti della malattia. I fattori dell'ospite che guidano questi processi non sono ben definiti, in parte a causa della mancanza di modelli animali che riproducano la transizione dalla colonizzazione asintomatica alla grave malattia clinica. 
Questo articolo descrive un nuovo modello murino che ricrea la transizione degli pneumococchi dal trasporto asintomatico alla malattia dopo infezione virale. In questo modello, i topi vengono prima inoculati per via intranasale con pneumococchi cresciuti con biofilm per stabilire un trasporto asintomatico, seguito da infezione IAV sia del rinofaringe che dei polmoni. Ciò si traduce in disseminazione batterica ai polmoni, infiammazione polmonare e segni evidenti di malattia che possono progredire fino alla letalità. Il grado di malattia dipende dal ceppo batterico e dai fattori dell'ospite. 
È importante sottolineare che questo modello riproduce la suscettibilità all'invecchiamento, perché rispetto ai topi giovani, i topi anziani mostrano malattie cliniche più gravi e soccombono alla malattia più frequentemente. Separando il trasporto e la malattia in fasi distinte e fornendo l'opportunità di analizzare le varianti genetiche sia del patogeno che dell'ospite, questo modello di co-infezione S. pneumoniae/IAV consente l'esame dettagliato delle interazioni di un importante patobionte con l'ospite nelle diverse fasi della progressione della malattia. Questo modello può anche servire come strumento importante per identificare potenziali bersagli terapeutici contro la polmonite pneumococcica secondaria in ospiti sensibili.

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A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

Questo articolo descrive un nuovo modello murino per la transizione dello pneumococco da colonizzatore asintomatico a patogeno che causa malattie durante l'infezione virale. Questo modello può essere facilmente adattato per studiare le interazioni polimicrobiche e ospite-patogeno durante le diverse fasi della progressione della malattia e tra vari ospiti.

Un modello murino per la transizione di Streptococcus pneumoniae da colonizzatore a patogeno in seguito a co-infezione virale ricapitola la malattia esacerbata dall'età

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an asymptomatic colonizer of the nasopharynx in most individuals but can progress to a pulmonary and systemic ...

Questo metodo descrive un nuovo modello murino per studiare la transizione dello pneumococco da un colonizzatore asintomatico a un agente patogeno che causa la malattia durante l'infezione virale. Imita più da vicino ciò che accade negli esseri umani. Questo modello può essere uno strumento importante per identificare potenziali bersagli terapeutici contro la polmonite da pneumococco secondaria in ospiti sensibili.Questo modello riproduce la suscettibilità dell'invecchiamento. Pertanto, può essere utilizzato per capire quali aspetti dell'ospite diventano difettosi con l'età e consentirci di personalizzare le opzioni di trattamento per gli ospiti anziani vulnerabili. La crescita del biofilm pneumococcico è impegnativa poiché i diversi ceppi richiedono diverse quantità di tempo.Il mio consiglio è di provare a coltivare il biofilm prima di eseguire lo studio sugli animali. Una volta che le cellule H292 sono confluenti al 100%, lavare le cellule tre volte con PBS. Quindi aggiungere 250 microlitri di paraformaldeide al 4% per pozzetto per fissare le cellule e incubare per un'ora sul ghiaccio o durante la notte a quattro gradi Celsius.Strake streptococcus pneumoniae ceppo di interesse sulla piastra di agar sangue e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo inoculare i batteri dalla piastra in mezzi freschi, chimicamente definiti o CDM più ossirasi lavando i batteri dalla piastra aggiungendo un millilitro di CDM più ossirasi e sollevando delicatamente le colonie batteriche usando il lato di una punta di pipetta da un millilitro, facendo attenzione a non raschiare l'agar. Diluire la coltura batterica in CDM più Ossirasi a un OD 600 iniziale di 0,05.Quindi far crescere i batteri in un tubo conico da 50 millilitri con tappo libero a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica fino a raggiungere OD di 0,2. Prossimo vortice il tubo di coltura batterica. Seminare 0,5 millilitri della coltura sulle cellule H292 fisse e aggiungere altri 0,5 millilitri di CDM più mezzo di ossirasi per pozzetto.Aggiungi CDM più Oxyrase ai pozzetti di controllo senza batteri. Incubare la piastra per 48 ore a 34 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Ogni 12 ore, dopo la semina iniziale, sostituire delicatamente gli 0,5 millilitri del terreno con CDM fresco più Ossarasi.Fare attenzione a non interrompere la formazione del biofilm. Controlla la parte inferiore della piastra per il biofilm e cerca l'aumento della nuvolosità con il passare del tempo a causa della crescita del biofilm. Dopo 48 ore, rimuovere il surnatante e lavare il biofilm due volte con un millilitro di PBS.Quindi risospendere il biofilm in un millilitro di CDM fresco e pipettare su e giù vigorosamente per sollevare il biofilm. Per ogni ceppo batterico, raggruppare la coltura da tutti i pozzetti in un tubo da 50 millilitri. Mescolare bene inclinando delicatamente il tubo strettamente tappato su e giù più volte.Quindi, aggiungere il 40% di glicerolo e CDM a volumi uguali per ottenere una sospensione batterica con una concentrazione finale del 20% di glicerolo. Aliquot un millilitro in una provetta da micro centrifuga, congelare il flash su ghiaccio secco e risparmiare a meno 80 gradi Celsius. Scongelare le aliquote coltivate sul ghiaccio e centrifugare a 1.700 G per cinque minuti.Rimuovere con attenzione e scartare il surnatante senza interrompere il pellet. Quindi lavare il pellet risospendendolo in un millilitro di PBS e girarlo di nuovo. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet nel volume necessario per raggiungere la concentrazione desiderata.Inoculare il topo nero C57 sei maschi per via intranasale con cinque volte 10 alla sesta colonia formando unità o CFU pipettando cinque microlitri di inoculo diluito in ciascun naris. Dopo l'inoculazione, tenere saldamente il mouse, stabilizzando la testa fino a quando il volume non viene inalato. Una volta che il virus si è scongelato, diluire il virus in PBS alla concentrazione desiderata.Posizionare il lubrificante oftalmico sugli occhi del topo prima dell'anestesia. Infettare immediatamente il topo anestetizzato con 50 microlitri di 20 unità formanti placca, o PFU, del virus dell'influenza A o IAV per via intratracheale utilizzando pinzette smussate per estrarre la lingua dalla bocca e pipettare il volume di liquido lungo la trachea. Dopo il recupero, inoculare per via intranasale 10 microlitri di 200 PFU di IAV utilizzando il metodo di inoculazione descritto in precedenza.Per la raccolta dei polmoni, usando le forbici da dissezione, tagliare i lati della gabbia toracica esposta e tirare delicatamente le costole verso la testa del topo per esporre il cuore. Inserire un ago da 25 gauge collegato a una siringa da 10 millilitri preriempita con PBS nel ventricolo destro e iniziare lentamente a perfondere. Cerca lo sbiancamento dei polmoni come indicatore di perfusione riuscita.Sciacquare lentamente per evitare di rompere il tessuto polmonare. Sollevare il cuore con una pinza e fare un taglio per separare i polmoni e il cuore. Una volta separati, raccogliere tutti i lobi del polmone con una pinza e risciacquare in un piatto con PBS sterile per rimuovere eventuali residui di sangue.In una capsula di Petri, tritare il polmone in piccoli pezzi e mescolare bene. Rimuovere metà della miscela polmonare per determinare il CFU batterico o PFU virale e posizionarlo in un tubo rotondo da 15 millilitri preriempito con 0,5 millilitri di PBS per l'omogeneizzazione. Rimuovere l'altra metà del polmone per la citometria a flusso e posizionarla in una piastra a 24 pozzetti trattata con coltura non tissutale con ciascun pozzetto preriempito con 0,5 millilitri di RP10.Lasciare a temperatura ambiente fino alla lavorazione. Per omogeneizzare il tessuto raccolto, pulire la sonda omogeneizzatore mettendola in etanolo al 70% e accendendo l'omogeneizzatore al 60% di potenza per 30 secondi. Ripetere questo passaggio in acqua sterile per 10 secondi.Omogeneizzare ogni tessuto per un minuto. Per l'enumerazione dei numeri batterici, diluizioni seriali della piastra su piastre di agar sangue. Per calcolare il CFU totale utilizzare 10 microlitri per placcare e annotare il volume finale in millilitri per ciascun campione.Placcare i campioni di rinofaringe su piastre di agar di sangue integrate con tre microgrammi per millilitro di gentamicina per selezionare la crescita di S pneumoniae mentre inibisce la crescita di altri microrganismi. Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Per la citometria a flusso, aggiungere 500 microlitri di tampone di digestione a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente un campione polmonare.Incubare il piatto per 45 minuti a un'ora. Quindi, utilizzando una micro pipetta P-1000, spostare i polmoni digeriti e posizionarli sul filtro. Quindi utilizzare lo stantuffo di una siringa da tre millilitri per schiacciare il campione.L'inoculo di S.pneumoniae di crescita del biofilm determina un trasporto pneumococcico coerente limitato al rinofaringe evitando la diffusione sistematica. La presentazione della malattia nei topi coinfetti da S pneumoniae IAV dipendeva dal ceppo batterico. Mentre non c'era alcuna differenza significativa nel numero batterico del rinofaringe tra nessuno dei ceppi, S pneumoniae, TIGR4 e D39, ma non EF3030 disseminato ai polmoni entro 48 ore dopo l'infezione IAV.Il 40% dei topi infettati da S pneumoniae TIGR4 ha mostrato disseminazione batterica ai polmoni e di questi, la metà di loro è diventata batterica. I topi infettati da S pneumoniae D39 hanno mostrato il 100% di disseminazione ai polmoni e metà di quelli hanno sperimentato batteriemia. Nel tracciare la sopravvivenza globale, indipendentemente dal ceppo batterico, il tasso di sopravvivenza dei topi coinfetti era significativamente inferiore rispetto ai topi singolarmente sfidati con S pneumoniae.Questo modello è stato utilizzato anche per valutare la presenza di varie cellule immunitarie nei polmoni dopo l'infezione da IAV. I ceppi batterici D39 e TIGR4 hanno provocato un aumento significativo al di sopra del basale nell'afflusso di cellule immunitarie infiammatorie dalla circolazione, come neutrofili e monociti, mentre EF3030 no. L'infezione da IAV da sola ha suscitato un aumento significativo al di sopra del basale nell'afflusso di cellule immunitarie come le cellule NK e le cellule T gamma delta.Queste risposte antivirali sono state significativamente attenuate nei topi infettati per via intranasale con S pneumoniae prima della sfida virale. Nei topi singolarmente infetti, i titoli virali non variavano tra le coorti giovani e anziane. I topi anziani hanno mostrato segni di malattia più precoci e significativamente più gravi e sono morti più velocemente, entro 24 ore, mentre i giovani controlli sono sopravvissuti meglio all'infezione.Separare il trasporto e la malattia in fasi distinte ci consente di esaminare sia la risposta immunitaria che i fattori batterici e/o virali importanti nelle diverse fasi della progressione della malattia. Speriamo che questo modello venga adattato da altri laboratori per studiare altre interazioni polimicrobiche e interazioni patogene ospiti durante le diverse fasi della progressione della malattia e tra i vari ospiti.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

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Ricerca

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