Name: a mouse model for the transition of streptococcus pneumoniae from colonizer to pathogen upon viral co-infection recapitulates age-exacerbated illness
Uploaded: 2022-09-28T14:15:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness at JoVE.

この原稿を批判的に読んで編集してくれたNick Lenhardに感謝します。また、細菌株のアンドリュー・カミリとアンソニー・カンパニャーリ、ウイルス株のブルース・デビッドソンにも感謝します。この研究は、国立衛生研究所助成金(R21AG071268-01)からJ.L.に、国立衛生研究所助成金(R21AI145370-01A1)、(R01AG068568-01A1)、(R21AG071268-01)からE.N.B.G.に支援されました。

著者は開示する利益相反を持っていません。

既存の肺炎球菌/IAV重感染実験研究のほとんどは、IAVに感染する前のマウスの肺への細菌送達に依存しています。これらのモデルは、宿主を二次的な細菌感染に感受性にする肺環境の変化および全身免疫応答を特定するのに役立ちました15、16、17、32、33、34、35、36、37。しかし、これらのモデルは、無症候性のコロニー形成者から深刻な肺および全身感染症を引き起こす可能性のある病原体へのS.肺炎への移行を模倣することができませんでした。さらに、これらのモデルは、感染に対する感受性に寄与する上気道における宿主因子および宿主-病原体相互作用の研究には適していません。IAV感染後の鼻咽頭から肺への肺炎球菌の移動に関する以前のモデルは、鼻咽頭の細菌感染とそれに続くウイルス感染に依存していました。しかし、ヒト患者21において観察される疾患の重篤な徴候を再現することはできなかった。ここで説明する修正マウス感染モデルは、無症候性の保菌から重篤な臨床疾患を引き起こす病原体への肺炎球菌の移行を要約しています。
このモデルの重要なステップは、鼻咽頭に肺炎球菌感染を確立することです。肺炎連鎖球菌はバイオフィルムを形成し、異なる効率で鼻咽頭にコロニーを形成します21,38。一貫した感染を確立するために、これまでに試験されたバイオフィルム増殖細菌株の少なくとも5×106 CFUが必要である23。ウイルス感染の前に、新しい細菌株の鼻咽頭の安定した感染についてテストすることをお勧めします。ウイルスの重感染については、以前の研究では、鼻咽頭からの細菌の分散にIAVによる鼻腔内感染が必要であることがわかっています21,22,23。これらの先行研究では、鼻腔内送達に500 PFUのIAVが使用されましたが、この研究では、鼻咽頭の細菌数を増やすには200 PFUで十分でした。IAV感染は上気道に限定されず、肺に広がる可能性があり39,40、これは肺環境を細菌感染に対してより寛容にするための鍵です15,16,41。肺へのIAVの送達は、麻酔をかけたマウスの鼻腔内送達または気管内設置のいずれかによって達成することができる。BALB / cByJマウスを使用した以前の研究では、鼻腔内送達がウイルス性肺炎を引き起こすことがわかりました21;ただし、鼻腔内接種後の肺への接種材料のアクセスは、C57BL / 6マウスではより制限されています。.C57BL/6マウスでは、ウイルス23の一貫した送達のために気管内設置が必要である。このモデルでは、以前の細菌コロニー形成は、ウイルス感染後の疾患症状の提示を加速する23。ウイルス感染自体が動態の潜在的な変動を伴う疾患症状を引き起こす可能性があるため、最初にテストされた新しいウイルス株の用量の範囲をテストし、同時感染宿主の加速された動態を明らかにする用量を選択することをお勧めします。
肺は、このモデルにおける疾患評価のための別の重要な読み出しを提供します。病原体負荷および免疫細胞流入の評価には、同じマウスからの肺を使用することができる。ただし、感染と炎症の重症度は葉によって異なる可能性があるため、さまざまな評価のために同じ肺の異なる葉を服用しないことをお勧めします。むしろ、すべてのローブを細かく刻み、よく混ぜ合わせてから、さまざまな評価のために均等に解析することができます。同様に、鼻咽頭は、細菌CFUまたはウイルスPFUおよび免疫応答の列挙に使用することができる。しかし、洗浄および組織から得られた細胞の数は、同じグループ内のマウスからのサンプルをプールせずにフローサイトメトリーを実行するには少なすぎます。あるいは、鼻咽頭の炎症を組織学的に評価することができます23。
このモデルの重要な特徴は、患者に見られる臨床疾患を再現することです。ヒトでは、IAV感染後の二次性肺炎球菌性肺炎は、咳、呼吸困難、発熱、筋肉痛などの明らかな病気の兆候を引き起こすことが多く、入院、呼吸不全、さらには死に至る可能性があります8,15,42,43。このモデルは、マウスが示す呼吸困難(呼吸スコアに反映)と全体的な倦怠感(姿勢と運動スコアに反映)、および一部の健康な若い対照の死亡に関して、ヒトで観察された臨床疾患の重篤な兆候を再現します。同時感染マウスにおける悪化した疾患症状は、肺への細菌播種および肺炎球菌保有マウスにおけるウイルスクリアランス障害の両方の結果である可能性が高い23。このモデルの限界は、臨床疾患の発生率と鼻咽頭からの細菌播種がマウス間で異なり、細菌株、宿主年齢、および遺伝子型21、22、23の影響を受けることです。これを反映して、侵襲性株の場合、局所感染(検出可能な菌血症なし)から死への進行は24時間以内に発生する可能性があります。したがって、全身の広がりを真に評価するためには、菌血症をより短い間隔(6〜12時間ごと)で追跡する必要があります。同様に、疾患スコアは、特に重感染後の最初の72時間で急速に変化する可能性があります。したがって、疾患の症状を綿密に追跡するために、IAV感染後1〜3日目にマウスを1日3回モニターすることをお勧めします。
要約すると、このモデルは、鼻咽頭の無症候性コロニーナイザーからIAV感染時に肺および全身性疾患を引き起こす可能性のある病原体への S.肺炎 の動きを再現します。このモデルでは、IAVは鼻咽頭の細菌の挙動を改変し、肺への細菌の広がりを増加させ、抗菌免疫を変化 させることによって、肺炎球菌 の移行を引き起こします23。同様に、細菌キャリッジは抗ウイルス免疫応答を鈍らせ、肺23からのIAVクリアランスを損なう。これにより、このモデルは、単一微生物感染と多菌感染における免疫応答の変化を解析するのに理想的です。さらに、重感染後の疾患の経過は、部分的には、鼻咽頭に存在する肺炎球菌の株に依存しています。したがって、このモデルは、無症候性コロニー形成と 肺炎球菌 の病原性移行に必要な細菌因子を解剖するのに適しています。最後に、このモデルは加齢の重感染に対する感受性を再現しており、ここではテストされていませんが、宿主の背景が疾患の経過に与える影響を評価するために簡単に使用できます。結論として、保菌と疾患を別々のステップに分離することで、病原体と宿主の両方の遺伝的変異を分析する機会が得られ、疾患進行のさまざまな段階における重要な病態と宿主との相互作用を詳細に調べることができます。今後、このモデルは、脆弱な宿主の治療オプションを調整するために使用できます。

肺炎連鎖球菌(肺炎球菌)は、ほとんどの健康な人の鼻咽頭に漸近的に存在するグラム陽性菌です1,2。完全に定義されていない要因によって促進される肺炎球菌は、鼻咽頭の良性コロニー形成者から他の臓器に広がる病原体に移行し、中耳炎、肺炎、菌血症などの深刻な感染症を引き起こす可能性があります3。肺炎球菌性疾患の提示は、部分的には、莢膜多糖の組成に基づく血清型を含む株特異的な違いに依存する。これまでに特徴付けられた100以上の血清型があり、いくつかはより侵襲的な感染症に関連しています4,5。他のいくつかの要因が肺炎球菌疾患のリスクを高めます。そのような要因の1つはウイルス感染であり、肺炎球菌性肺炎のリスクはIAV 6,7によって100倍に増加します。歴史的に、肺炎球菌はインフルエンザ後の二次性細菌性肺炎の最も一般的な原因の1つであり、より悪い結果と関連しています8。もう一つの主要な危険因子は高齢です。実際、S.肺炎は、65歳以上の高齢者における市中細菌性肺炎の主な原因です9,10。高齢者は肺炎とインフルエンザによる死亡の大部分(>75%)を占めており、加齢とIAV感染という2つの危険因子が相乗的に疾患感受性を悪化させることを示しています11,12,13,14。しかし、ウイルス感染が無症候性コロニー形成者から侵襲性病原体への肺炎球菌の移行を促すメカニズムと、これが宿主因子によってどのように形成されるかは、十分に定義されていない。これは主に、無症候性肺炎球菌コロニー形成から重篤な臨床疾患への移行を要約する小動物モデルがないためです。
重感染研究は、インフルエンザ感染の7日後に肺に直接肺炎球菌を接種したマウスで古典的にモデル化されています15,16。これは二次性細菌性肺炎に対する感受性を再現し、抗ウイルス免疫応答が抗菌防御をどのように損なうかを研究するのに理想的です17。しかし、ヒトにおける縦断的研究は、細菌が無症候性のバイオフィルムを形成することができる鼻咽頭における肺炎球菌の保菌が18、侵襲性疾患と一様に関連していることを示した19,20。中耳、肺、および血液の感染症からの細菌分離株は、鼻咽頭に見られるものと遺伝的に同一です20。したがって、IAV感染後の無症候性保菌から侵襲性疾患への移行を研究するために、マウスにバイオフィルム成長肺炎球菌を鼻腔内投与した後、鼻咽頭にIAV感染を行うモデルが確立されました21,22。上気道のウイルス感染は宿主環境の変化をもたらし、バイオフィルムからの肺炎球菌の拡散と下気道への拡散をもたらしました21。これらの分散した細菌は、感染に重要な病原性因子の発現をアップレギュレートし、それらをコロニーから病原体に変換しました21。これらの観察結果は、ウイルス、宿主、細菌の間の複雑な相互作用を強調し、ウイルス感染によって引き起こされる宿主への変化が肺炎球菌の行動に直接影響を及ぼし、それが細菌感染の経過を変えることを示しています。しかし、このモデルは、おそらくウイルスが鼻腔に限定されており、宿主免疫と肺損傷に対するウイルス感染の全身的影響が再現されていないため、ヒトで観察される病気の重篤な兆候を再現することはできません。
私たちは最近、宿主と病原体の間の複雑な相互作用を組み込んだモデルを確立しましたが、ヒトで観察される病気の重症度をより厳密に模倣しています23。このモデルでは、マウスは最初にバイオフィルム成長肺炎球菌を鼻腔内感染させて無症候性の保菌を確立し、続いて鼻咽頭と肺の両方にIAV感染します。その結果、肺への細菌の拡散、肺の炎症、および病気が発生し、若いマウスの一部で致死性に進行しました23。この以前の研究は、ウイルス感染と細菌感染の両方が宿主防御を変化させることを示しました:ウイルス感染は細菌の播種を促進し、以前の細菌コロニー形成は肺IAVレベルを制御する宿主の能力を損ないました23。免疫応答を調べると、IAV感染は好中球の抗菌活性を低下させ、細菌のコロニー形成は抗ウイルス防御に重要なI型インターフェロン応答を鈍らせることが明らかになりました23。重要なことに、このモデルは老化の感受性を再現しました。若いマウスと比較して、老齢マウスは病気の兆候を早く示し、より深刻な臨床的病気を示し、より頻繁に感染に屈しました23。この原稿で提示された研究は、侵襲性肺炎球菌株がIAV感染時により効率的に播種し、肺炎症のより明白な兆候を示し、非侵襲的株と比較して疾患の発生率が加速するため、疾患の程度も細菌株に依存することを示しています。したがって、この 肺炎球菌/IAV共感染モデルは、病原体と宿主因子の両方の詳細な検査を可能にし、疾患進行のさまざまな段階での多微生物感染に対する免疫応答の研究に適しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-Aminobenzoic acid&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1267318</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>650101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-201-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC147440250</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501785325</td>
			<td>Microcyrstalline cellulose&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix Fixation Buffer&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BDB554655</td>
			<td>Fixation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Fortessa</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene Tubing&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>427410</td>
			<td>Tubing for nasal lavage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (1 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Microtainer Capillary Blood Collector and BD Microgard Closure</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-675-185</td>
			<td>Blood collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6233703</td>
			<td>Mix IV stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC230090010</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>#000644</td>
			<td>Mice used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C77-500</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD103 BV 421</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB562771</td>
			<td>Clone: M290 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>50-112-9622</td>
			<td>Clone: M1/70, DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB565592</td>
			<td>Clone: N418 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 AF 488</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>OB153030</td>
			<td>Clone: 145-2C11 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 V450</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>BDB560470</td>
			<td>Clone: RM4.5 DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 APC eF-780</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-9642</td>
			<td>Clone: 30-F11 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 PE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>50-103-70</td>
			<td>Clone: 30-F11 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#945; BV 650</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>BDB563234</td>
			<td>Clone: 53-6.7 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC110290500</td>
			<td>Final supplement to CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-761-107</td>
			<td>Filter sterilzation apparatus&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Tissue Culture Treated T-25 Flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-126-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Clear Multiple Well Plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-201-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;DMEM With L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose; Without Sodium Pyruvate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT10017CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanocobalamin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC405925000</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D39</td>
			<td>National Collection of Type Culture (NCTC)</td>
			<td>NCTC 7466</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Alanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1023114</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Calcium pantothenate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC243301000</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical&#160;</td>
			<td>LS002147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagles Minimum Essential Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH4616-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EF3030</td>
			<td>Center for Disease Control and Prevention&#160;</td>
			<td>Available via the isolate bank request</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae strain, request using strain name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F480 PE Cy7</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-9713</td>
			<td>Clone: BMB DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>50 mL round bottom tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td>15 mL round bottom tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;Round-Bottom Polystyrene Test Tubes (5 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-5</td>
			<td>FACS tubes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric Nitrate Nonahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>I110-100</td>
			<td>Mix III stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Delicate Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-951-5</td>
			<td>Instruments used for harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable Inoculating Loops&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-602</td>
			<td>Inoculating loops&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Dissecting Tissue Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-812-38</td>
			<td>Forceps for harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-137</td>
			<td>Micocentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Sterile Syringes for Single Use (10 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC216630500</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI 1640 (ATCC)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A1049101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14025134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;MEM (Temin&#39;s modification) (2x), no phenol red</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-935-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>25-200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AA3643530</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1202414</td>
			<td>Mix II stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen UltraComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-112-9040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1517836</td>
			<td>Mix III stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6027918</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1573814</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAB2147322</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1352022</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1043518</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1038914</td>
			<td>Final supplement to CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cystine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1376218</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC156211000</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O2956-100</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC166150250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>50-112-1524</td>
			<td>Clone: N/A DF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC166170250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP385-100</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6222514</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1031822</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low endotoxin BSA&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A1470-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1323814</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1019922</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC132660250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC138930250</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophan</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1023014</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAA1272014</td>
			<td>Amino acid stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6C BV 605</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB563011</td>
			<td>Clone: AL-21 DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6G AF 488&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>NC1102120</td>
			<td>Clone: IA8, DF 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td>MDCK cell line for PFU analuysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate 7-Hydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>60-019-68</td>
			<td>CDM starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M113-500</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Fc Block</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB553142</td>
			<td>Clone: 2.4G2 DF 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MWI VETERINARY&#160;PURALUBE VET OINTMENT</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC1886507</td>
			<td>Eye lubricant for infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCI-H292 mucoepidermoid carcinoma cell line&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1848</td>
			<td>H292 lung epithelial cell line for biofilm growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacinamide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>18-604-792</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK 1.1 AF 700</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-4692</td>
			<td>Clone: PK136 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxyrase For Broth 50Ml Bottle 1/Pk</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-200-5299</td>
			<td>To remove oxygen from liquid cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4% in PBS</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>J19932-K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pivetal Isoflurane&#160;</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-8440</td>
			<td>Isoflurane for anesthesia during infection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P285-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal hydrochloride&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC352710250</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxamine dihydrochloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6267906</td>
			<td>Mix I stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC132350250</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0530-500G</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP922I-500</td>
			<td>For FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>Starter stock and final supplement to CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>Starter stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR APC&#160;</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>50-112-8889</td>
			<td>Clone: GL-3 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; APC-Cy7</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>BDB560656</td>
			<td>Clone: H57-597 DF 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Blood Agar with Gentamicin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>R01227</td>
			<td>Blood agar plates with the antibiotic gentamicin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Trypsin, TPCK Treated</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PI20233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine hydrochloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC148991000</td>
			<td>Vitamin stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIGR4</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>BAA-334</td>
			<td>Streptococcus pneumoniae strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC157300250</td>
			<td>Mix II stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worthington Biochemical Corporation&#160;Collagenase, Type 2, 1 g</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9693955</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model for the transition of streptococcus pneumoniae from colonizer to pathogen upon viral co-infection recapitulates age-exacerbated illness

肺炎連鎖球菌(肺炎球菌)は、ほとんどの人の鼻咽頭の無症候性コロニー形成者ですが、インフルエンザAウイルス(IAV)感染時に肺および全身性病原体に進行する可能性があります。高齢は、二次性肺炎球菌性肺炎に対する宿主の感受性を高め、疾患転帰の悪化と関連している。これらのプロセスを推進する宿主要因は、無症候性のコロニー形成から重度の臨床疾患への移行を再現する動物モデルが不足していることもあり、明確に定義されていません。
本稿では、ウイルス感染による無症候性保菌から疾患への肺炎球菌の移行を再現する新しいマウスモデルについて説明します。このモデルでは、マウスに最初にバイオフィルム成長肺炎球菌を鼻腔内接種して無症候性の保菌を確立し、続いて鼻咽頭と肺の両方にIAV感染させます。これは、肺への細菌の拡散、肺の炎症、および致死に進行する可能性のある病気の明らかな兆候をもたらします。病気の程度は細菌株と宿主因子に依存します。 
重要なことに、このモデルは、若いマウスと比較して、老齢マウスはより重篤な臨床疾患を示し、より頻繁に病気に屈するため、老化の感受性を再現します。この 肺炎球菌/IAV共感染モデルは、保菌と疾患を別々のステップに分け、病原体と宿主の両方の遺伝的変異を分析する機会を提供することにより、疾患進行のさまざまな段階における重要な病態と宿主との相互作用の詳細な検査を可能にします。このモデルは、感受性宿主における二次性肺炎球菌性肺炎に対する潜在的な治療標的を特定するための重要なツールとしても役立ちます。

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A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

この論文では、ウイルス感染中の無症候性コロニーから病気の原因となる病原体への肺炎球菌の移行に関する新しいマウスモデルについて説明します。このモデルは、疾患進行のさまざまな段階およびさまざまな宿主にわたる多微生物および宿主-病原体の相互作用を研究するために容易に適応できます。

肺炎 連鎖 球菌のウイルス重感染によるコロニー形成者から病原体への移行に関するマウスモデルが加齢増悪疾患を再現

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an asymptomatic colonizer of the nasopharynx in most individuals but can progress to a pulmonary and systemic ...

この方法は、ウイルス感染中の無症候性コロニーナイザーから病気の原因となる病原体への肺炎球菌の移行を研究するための新しいマウスモデルを記載する。それは人間で起こることをより厳密に模倣します。このモデルは、感受性宿主における二次性肺炎球菌性肺炎に対する潜在的な治療標的を特定するための重要なツールとなり得る。老化の影響を受けやすいモデルです。したがって、これは、宿主のどの側面が年齢とともに欠陥になるかを理解し、脆弱な高齢宿主の治療オプションを調整するために使用できます。肺炎球菌バイオフィルムの成長は、異なる株が異なる時間を要するため、困難です。私のアドバイスは、動物実験を実行する前にバイオフィルムを成長させることです。H292細胞が100%コンフルエントになったら、PBSで細胞を3回洗浄します。次に、ウェルあたり250マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドを加えて細胞を固定し、氷上で1時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。目的の肺炎連鎖球菌株を血液寒天プレートにストレーキし、摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。翌日、寒天をこすらないように注意しながら、1ミリリットルのCDMとオキシラーゼを加えてプレートから細菌を洗い流し、1ミリリットルのピペットチップの側面を使用して細菌コロニーを静かに持ち上げることにより、プレートから細菌を化学的に定義された新鮮な培地またはCDMとオキシラーゼに接種します。CDMとオキシラーゼの細菌培養物を0.05の開始OD 600に希釈します。次に、緩く蓋をした50ミリリットルの円錐管で、摂氏37度と5%二酸化炭素で、OD0.2に達するまで細菌を増殖させます。次に細菌培養チューブをボルテックスする。固定H292細胞に0.5ミリリットルの培養物を播種し、ウェルあたりさらに0.5ミリリットルのCDMとオキシラーゼ培地を加えます。CDMとオキシラーゼをバクテリアのないコントロールウェルに追加します。プレートを摂氏34度と5%二酸化炭素で48時間インキュベートします。最初の播種後、12時間ごとに、0.5ミリリットルの培地を新鮮なCDMとオキシラーゼと穏やかに交換します。バイオフィルムの形成を妨げないように注意してください。プレートの底にバイオフィルムがないか確認し、バイオフィルムの成長により時間が経つにつれて曇りが増すのを探します。48時間後、上清を取り除き、1ミリリットルのPBSでバイオフィルムを2回洗浄する。次に、バイオフィルムを1ミリリットルの新鮮なCDMに再懸濁し、ピペットで激しく上下させてバイオフィルムを持ち上げます。細菌株ごとに、すべてのウェルからの培養物を50ミリリットルのチューブにプールします。しっかりと蓋をしたチューブを数回上下にそっと傾けてよく混ぜます。次に、40%グリセロールとCDMを等量添加して、最終濃度20%グリセロールの細菌懸濁液を実現します。1ミリリットルをマイクロ遠心チューブに分注し、ドライアイスで瞬間凍結し、摂氏マイナス80度で保存します。氷上でアリコートを成長させたバイオフィルムを解凍し、1, 700 Gで5分間回転させます。ペレットを乱すことなく上清を慎重に取り除き、廃棄します。次に、ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁して洗浄し、再度回転させます。上清を除去し、所望の濃度に達するのに必要な量でペレットを再懸濁する。5マイクロリットルの希釈接種材料を各ナリスにピペッティングすることにより、C57ブラック6匹のオスマウスを鼻腔内に接種し、10〜6番目のコロニー形成単位またはCFUを5回投与する。接種後、マウスをしっかりと持ち、容量が吸入されるまで頭を安定させます。ウイルスが解凍したら、PBSでウイルスを希望の濃度に希釈します。麻酔の前にマウスの目に眼科用潤滑剤を置きます。麻酔をかけたマウスに、鈍いピンセットを使用して舌を口から引き出し、気管に大量の液体をピペッティングすることにより、50マイクロリットルの20個のプラーク形成ユニット(PFU)のインフルエンザAウイルスまたはIAVを気管内に感染させます。回復後、前述の接種方法を用いてIAVの200PFUを10マイクロリットル鼻腔内接種する。肺の採取では、解剖ハサミを使用して、露出した胸郭の側面を切り、肋骨をマウスの頭に向かってゆっくりと引き上げて心臓を露出させます。PBSを事前に充填した25ミリリットルの注射器に取り付けられた10ゲージの針を右心室に挿入し、ゆっくりと灌流を開始します。灌流の成功の指標として肺の漂白を探します。肺組織を壊さないようにゆっくりと洗い流してください。鉗子で心臓を持ち上げ、肺と心臓を分離するために切り込みを入れます。分離したら、鉗子で肺のすべての葉を拾い上げ、滅菌PBSを含む皿ですすぎ、残留血液を取り除きます。ペトリ皿で、肺を細かく刻み、よく混ぜます。肺ミックスの半分を取り除き、細菌CFUまたはウイルスPFUを決定し、均質化のために0.5ミリリットルのPBSを事前に充填した丸底15ミリリットルのチューブに入れます。フローサイトメトリーのために肺の残りの半分を取り除き、各ウェルに0.5ミリリットルのRP10を予め充填した非組織培養処理24ウェルプレートに入れます。処理するまで室温で放置してください。採取した組織を均質化するには、ホモジナイザープローブを70%エタノールに入れ、ホモジナイザーを60%電源で30秒間オンにして清掃します。滅菌水中でこの手順を10秒間繰り返します。各組織を1分間均質化します。細菌数の列挙のために、血液寒天プレート上のプレート段階希釈。総CFUを計算するには、10マイクロリットルを使用してプレートし、各サンプルの最終容量をミリリットル単位で記録します。鼻咽頭サンプルを、ミリリットルあたり3マイクログラムのゲンタマイシンを添加した血液寒天プレートにプレートし、他の微生物の増殖を抑制しながら肺炎球菌の増殖を選択します。摂氏37度と5%の二酸化炭素で一晩インキュベートします。フローサイトメトリーでは、肺サンプルを含む24ウェルプレートの各ウェルに500マイクロリットルの消化バッファーを追加します。プレートを45分から1時間インキュベートします。次に、P-1000マイクロピペットを使用して、消化された肺を動かしてフィルターの上に置きます。次に、3ミリリットルのシリンジのプランジャーを使用してサンプルをマッシュします。バイオフィルムの成長 S.pneumoniae 接種材料は、体系的な広がりを避けながら、鼻咽頭に限定された一貫した肺炎球菌キャリッジをもたらします。S肺炎IAV重感染マウスにおける疾患発現は、細菌株に依存していた。鼻咽頭の細菌数にはいずれの株間でも有意差はなかったが、肺炎球菌、TIGR4、D39は、IAV感染後48時間までに肺に播種したEF3030はなかった。肺炎球菌TIGR4に感染したマウスの40%が肺への細菌の播種を示し、そのうちの半分がバクテレミックになりました。肺炎S.D39に感染したマウスは、肺への100%の播種を示し、その半分は菌血症を経験しました。全生存期間の追跡において、細菌株に関係なく、同時感染マウスの生存率は、肺炎球菌に単独で挑戦したマウスよりも有意に低かった。このモデルは、IAV感染後の肺における様々な免疫細胞の存在を評価するためにも使用された。細菌株D39およびTIGR4は、好中球および単球などの循環からの炎症性免疫細胞の流入においてベースラインを超える有意な増加を誘発したが、EF3030は誘発しなかった。 IAV感染単独では、NK細胞およびガンマデルタT細胞などの免疫細胞の流入においてベースライン以上の有意な増加を誘発した。これらの抗ウイルス反応は、ウイルスチャレンジの前に肺炎球菌に鼻腔内に感染したマウスで有意に鈍化しました。単一感染マウスでは、ウイルス力価は若年コホートと高齢コホートの間で変化しなかった。老齢マウスは、より早く、より重篤な疾患の兆候を示し、24時間以内により早く死亡したが、若い対照群は感染をよりよく生き延びた。キャリッジと疾患を別々のステップに分けることで、免疫応答と、疾患進行のさまざまな段階で重要な細菌および/またはウイルス因子の両方を調べることができます。このモデルが他の研究室によって適応され、疾患の進行のさまざまな段階およびさまざまな宿主にわたる他のポリ微生物相互作用および宿主病原体相互作用を研究することを願っています。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

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の間に相乗効果を調査するために生物発光イメージングを使用して肺炎球菌幼児マウスで>とインフルエンザウイルス

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

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の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

長期宿主 - 病原体相互作用を特徴付けるためのEpiAirwayモデルの利用

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

ザ<em&gt;シトロrodentium</em&gt;マウスモデル：感染性大腸炎に勉強病原体とホスト貢献

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

肺炎球菌による鼻腔内コロニー形成時の炎症反応の特徴

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

メンブレン極性膜完全性、細胞内イオン濃度の監視の変更<em&gt;肺炎球菌</em&gt;蛍光染料を使用

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

の莢血清型<em&gt;肺炎球菌</em&gt;膨張反応を使用して、

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

局所および全身所における病原体により誘導される慢性炎症のためのマウスモデル

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

の莢膜血清型<em&gt;肺炎球菌</em&gt;ラテックス凝集による

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

アン<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV重感染のコンテキストでのマラリアに対する免疫応答を測定するためのモデル

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

肺炎 連鎖 球菌のウイルス重感染によるコロニー形成者から病原体への移行に関するマウスモデルが加齢増悪疾患を再現

肺炎連鎖球菌のウイルス重感染によるコロニー形成者から病原体への移行に関するマウスモデルが加齢増悪疾患を再現