Name: extrahepatic bile duct and gall bladder dissection in nine-day-old mouse neonates
Uploaded: 2022-08-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extrahepatic Bile Duct and Gall Bladder Dissection in Nine-Day-Old Mouse Neonates at JoVE.com

Forfatterne anerkender Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Hans Christian Schmidt blev støttet økonomisk af Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME Scholarship (2021_EKPK.10), UKE, Hamburg.

Efter etisk godkendelse (N045/2021) blev mandlige og kvindelige C57BL/6 mus nyfødte observeret indtil 9 dage gamle. Dyrene blev født og leveret til forsøgsformål af dyreanlægget på University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Tyskland. De nyfødte blev anbragt i et bur sammen med deres forældredyr. Miljøforholdene blev kontrolleret i temperatur (20-24 °C), 12:12 timers lys-mørk cyklus og relativ luftfugtighed på 40%-70%.
1. Eksperimentelt præparat
<ol><l...

<ol>
	<li>Liwinski, T., Schramm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prim&#228;r+sklerosierende+Cholangitis.">Prim&#228;r sklerosierende Cholangitis.</a> Der Internist. 59 (6), 551-559 (2018).</li><li>Kobayashi, H., Stringer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+atresia.">Biliary atresia.</a> Seminars in Neonatology. 8 (5), 383-391 (2003).</li><li>Patman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+tract:+Newly+identified+biliatresone+causes+biliary+atresia.">Biliary tract: Newly identified biliatresone causes biliary atresia.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 12 (7), 369 (2015).</li><li>Mack, C. L., Sokol, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+pathogenesis+and+etiology+of+biliary+atresia.">Unraveling the pathogenesis and etiology of biliary atresia.</a> Pediatric Research. 57 (5), 87-94 (2005).</li><li>Karjoo, S., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neonatal+extrahepatic+cholangiocytes.">Isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51621 (2014).</li><li>Strazzabosco, M., Fabris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+anatomy+of+normal+bile+ducts.">Functional anatomy of normal bile ducts.</a> The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 653-660 (2008).</li><li>Nakanuma, Y., Hoso, M., Sanzen, T., Sasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructure+and+development+of+the+normal+and+pathologic+biliary+tract+in+humans,+including+blood+supply.">Microstructure and development of the normal and pathologic biliary tract in humans, including blood supply.</a> Microscopy Research and Technique. 38 (6), 552-570 (1997).</li><li>Banales, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocyte+pathobiology.">Cholangiocyte pathobiology.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (5), 269-281 (2019).</li><li>de Buy Wenniger, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cholangiocyte+glycocalyx+stabilizes+the+'biliary+HCO3-+umbrella':+an+integrated+line+of+defense+against+toxic+bile+acids.">The cholangiocyte glycocalyx stabilizes the 'biliary HCO3- umbrella': an integrated line of defense against toxic bile acids.</a> Digestive Diseases. 33 (3), 397-407 (2015).</li><li>Pinto, C., Giordano, D. M., Maroni, L., Marzioni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+inflammation+and+proinflammatory+cytokines+in+cholangiocyte+pathophysiology.">Role of inflammation and proinflammatory cytokines in cholangiocyte pathophysiology.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (4), 1270-1278 (2018).</li><li>Khandekar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+development+of+the+mouse+extrahepatic+bile+duct:+Implications+for+neonatal+susceptibility+to+biliary+injury.">Coordinated development of the mouse extrahepatic bile duct: Implications for neonatal susceptibility to biliary injury.</a> Journal of Hepatology. 72 (1), 135-145 (2020).</li><li>Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Sch&#228;fer, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-purity+myenteric+plexus+from+adult+human+and+mouse+gastrointestinal+tract.">Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract.</a> Scientific Reports. 5 (1), 9226 (2015).</li><li>Ishii, M., Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+morphologic+characterization+of+bile+duct+epithelial+cells+from+normal+rat+liver.">Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver.</a> Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).</li><li>Kumar, U., Jordan, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+biliary+epithelial+cells+from+the+biliary+tract+fraction+of+normal+rats.">Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats.</a> Liver. 6 (6), 369-378 (1986).</li><li>Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+polarized+primary+cultures+of+rat+intrahepatic+bile+duct+epithelial+cells.">Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells.</a> Laboratory Investigation. 74 (1), 303-313 (1996).</li><li>Paradis, K., Sharp, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+duct-like+structure+formation+after+isolation+of+bile+ductular+cells+from+a+murine+model.">In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 113 (6), 689-694 (1989).</li></ol>

Denne artikel rapporterede og diskuterede oprettelsen og valideringen af en ny kirurgisk tilgang til fjernelse af EBDS af aflivede neonatale mus. Mikroskopiske og histologiske fund afslører, at tilgangen hurtigt registrerer EBD'er og dissekerer dem nær kanalens margener, selv hos neonatale mus. Kun kirurgiske instrumenter og et mikroskop med en 20x forstørrelse er påkrævet for den beskrevne protokol. Desuden tillader tilgangen isolering af hele EBDS. Teknikken er meget effektiv, ligetil og enkel at replikere.
<p...

Tilblivelsen og progressionen af cholangiopatier såsom galde atresi, primær skleroserende cholangitis (PSC) og primær galdekolangitis (PBC) er enten ukendte eller ufuldstændige 1,2. Den begrænsede forståelse af disse sygdommes oprindelse og progression fører til mangel på behandlingsmuligheder3. Den sværeste hindring for at studere neonatale galdekanalforstyrrelser er at få en molekylær forståelse af patofysiologien. En af de væsentlige nøgler til en bedre forståelse af molekylær patologi er den bedst mulige observation af berørt væv. For at undgå reduceret sammenlignelighed og uoverensstemmelser mellem forskning, såsom observation af potentiel viral ætiologi af galde atresi4, opstår behovet for den bedst mulige forberedelse og deling af de udførte dissektionsteknikker. En ren forberedelse af målvævet er nødvendig for senere mikroskopiske undersøgelser eller avlscelle- og 3D-organoidkulturer. Men i murine neonatale lidelser er vævsprøver sjældne og forekommer kun i en lille mængde på grund af den meget lille størrelse. Med hensyn til galdegangsforstyrrelser er der beskrevet vanskeligheder med en ren tilberedning af galdekanaler hos murine nyfødte5. På grund af det neonatale udviklingsstadium er vævsdifferentiering ikke alt for avanceret, hvilket komplicerer forberedelsen og øger vanskeligheden sammenlignet med forberedelsen af voksne prøver. Derfor undersøgte driftsarbejdsgruppen en ny strategi for forberedelse af EBDS i en neonatal musemodel. I denne undersøgelse muliggør teknikken en effektiv dissektion af hver prøve.
Galdekanalsystemet er intraperitonealt placeret i højre øvre del af maven, der stammer fra leveren. Galdeblæren er placeret under den viscerale overflade af leverens højre lap. Galdekanalen er sammen med portalvenen og leverarterien indlejret i hepatoduodenalbåndet. Det forbinder leveren og tolvfingertarmen direkte og dræner galdevæske ind i tolvfingertarmen6. Anatomisk er galdekanalen opdelt i højre og venstre leverkanal, den fælles leverkanal, den cystiske kanal og Ductus choledochus, som dannes ved sammenløbet af den cystiske kanal og den fælles leverkanal7. Denne tømmer til sidst galdevæske og spyt fra bugspytkirtelkanalen ind i tolvfingertarmen via Vaters Ampulla.
Cholangiocytter beklæder galdekanalen intra- og ekstrahepatisk og bor i en kompliceret anatomisk niche, hvor de hjælper med galdeproduktion og homeostase8. Galdevæske passerer disse specialiserede epitelceller i høje koncentrationer dagligt. Især HCO3-paraplyvedligeholdelsen er meget vigtig for at beskytte mod galdesyretoksicitet9. Cholangiocytter er den første forsvarslinje i hepatobiliærsystemet mod for eksempel luminale mikroorganismer10. Cholangiocytternes forsvarseffektivitet mod giftige angreb kan svækkes af genetisk disposition. En giftig overbelastning forårsager skade og ødelæggelse og kan derfor føre til cholangiopatier. Desuden er den udviklende galdekanal ikke helt i stand til alle selvbeskyttende mekanismer, hvilket fører til en højere modtagelighed for miljøgifte i neonatale galdekanaler11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>CHEMSOLUTE</td>
			<td>11365000</td>
			<td>used as a dehydrating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G canula</td>
			<td>B Braun/Sterican, Melsungen Germany</td>
			<td>4656300</td>
			<td>canula for hydration of the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air vent</td>
			<td>C + P M&#246;belsysteme GmbH &#38; Co. KG, Breidenbach, Germany</td>
			<td>Tec-Ononmic AZ 1200</td>
			<td>the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua ad injectabilia Braun</td>
			<td>B Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>2351744</td>
			<td>saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bigger microsurgical Forceps</td>
			<td>DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland</td>
			<td>FD253R</td>
			<td>straight, 180 mm (7&#34;), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera &#8220;SmartCAM 5&#8221;&#160;</td>
			<td>Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom</td>
			<td>EVC131A</td>
			<td>optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2&#34;; Used for videoproduction and technical evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany</td>
			<td>12612613</td>
			<td>used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration sponge&#160;</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>TT56.1</td>
			<td>sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of&#160; two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Phosphat Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Doesn&#180;t contain Calzium or Magnesium, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassettes</td>
			<td>Engelbrecht GmbH, Ederm&#252;nde, Germany</td>
			<td>17990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>41-6660-00</td>
			<td>staining solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors CeramaCut</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>14959-09</td>
			<td>Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>41-5130-00</td>
			<td>staining solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highresolotion microscope</td>
			<td>Vision Engineering, Send United Kingdom</td>
			<td>EVO503&#160;</td>
			<td>Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany</td>
			<td>BX60F5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glases</td>
			<td>Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>101244</td>
			<td>60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany</td>
			<td>03-0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica, Nu&#223;loch, Germany</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td>Tool for sectioning (2 &#181;m-slices)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix-F 1 mL syringe</td>
			<td>B Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>syringe without canula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sakura Finetec, Torrance, USA</td>
			<td>4511</td>
			<td>Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding machine</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>TES 99</td>
			<td>The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Morphisto</td>
			<td>1176201000</td>
			<td>Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Microsurgical Forceps&#160;</td>
			<td>EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), B&#252;tthard, Bayern, Germany</td>
			<td>(00)165</td>
			<td>Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Ruler</td>
			<td>Agntho&#39;s AB, Liding&#246;, Sweden</td>
			<td>30085-15</td>
			<td>150mm With Metric &#38; Inch Graduations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors &#8211; Sharp-blunt for decapitation</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>14001-14</td>
			<td>Device for decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warming cabinet</td>
			<td>Haraeus, Hanau, Germany</td>
			<td>T 6060</td>
			<td>the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extrahepatic bile duct and gall bladder dissection in nine-day-old mouse neonates

Dissektionen af murine neonatale galdekanaler er blevet beskrevet som vanskelig. Hovedformålet med den beskrevne standardoperationsprocedure er isolering af den ekstrahepatiske galdekanal (EBD) hos musenyfødte uden at beskadige galdekanalen under forberedelsen. På grund af dets usædvanligt tætte forberedelse sammenlignet med cholangiocytcellelinjen og høst af hele det ekstrahepatiske galdekanalsystem (EBDS) er den beskrevne tilgang yderst nyttig til forskning i dyremodeller af nyfødte galdekanalforstyrrelser, såsom galdeatresi. Efter eutanasi blev peritonealhulen tilgået, og galdekanalsystemet, tolvfingertarmen og leveren blev ekstraheret med den unikke En-bloc-Resection (EbR). Den ekstraherede prøve placeres på en skummåtte, og EBD dissekeres fra forurenende celler atraumatisk uden nødvendig berøring. Dissektionen af hele EBDS er en væsentlig fordel ved denne metode. Der skal udvises forsigtighed på grund af den lille størrelse og mængde galdegangsvæv. Ved hjælp af den beskrevne teknik er der ingen skade på cholangiocytterne. Endvidere er renheden af teknikken reproducerbar (n = 10). Derfor kan optimalt sammenlignelige prøver høstes. Desuden er intet galdegangsvæv skadet, fordi enhver kontakt med galdekanalsystemet kan undgås under forberedelsen, hvilket efterlader galdevæsken inde i galdeblæren. Vigtigst af alt, mens de udførte den endelige galdeblære og galdekanaldissektion, blev atraumatiske mikroinstrumenter kun brugt lidt lateralt af galdekanalen uden at klemme den. Dette er nøglen til en ren og intakt prøve og afgørende for yderligere histologisk undersøgelse eller isolering af cholangiocytter. For at opsummere gør den beskrevne innovative dissektionsteknik det muligt for især uerfarne operatører med det nødvendige udstyr at isolere EBDS så rent som muligt.

Figur 1A viser EBDS af en murine nyfødt, som blev dissekeret med den beskrevne teknik. Mikroskopisk er der ikke yderligere levervæv synligt. Levervævet er blevet fjernet under protokollens sidste isolationstrin og kunne let skelnes fra galdegangsvæv med hensyn til farve og konsistens. Figur 1B viser den isolerede prøve sammenlignet med en millimeterskala. EBD's længde (målt fra galdeblære til duodenal papilla) er mindre end 10 mm. Diameteren af den meget...

Watch this Scientific Journal Video about Extrahepatic Bile Duct and Gall Bladder Dissection in Nine-Day-Old Mouse Neonates at JoVE.com

Extrahepatic Bile Duct and Gall Bladder Dissection in Nine-Day-Old Mouse Neonates

Til observation af murine neonatale galdekanalforstyrrelser kræves en intakt galdekanal og effektiv forberedelse. Derfor blev en ny tilgang til isolering af hele det ekstrahepatiske galdekanalsystem i murine nyfødte med succes udviklet, samtidig med at galdekanalens integritet blev opretholdt.

Ekstrahepatisk galdegang og galdeblæredissektion hos ni dage gamle musenyfødte

The dissection of murine neonatal bile ducts has been described as difficult. The main aim of the described standard operating procedure is the isolation ...

Mange rapporter, der vurderede det ekstrahepatiske galdesystem, rapporterede, at de fik prøverne, men ikke hvordan de opnåede dem, hvilket rejste spørgsmål vedrørende sammenlignelighed. Den største fordel ved denne teknik er, at hele det ekstrahepatiske galdesystem kan dissekeres, og forurenende celler kan fjernes atraumatisk. Vores dissektionsprotokol kan generelt anvendes til eksperimentelle tilgange, der arbejder med murine neonatale galdekanalforstyrrelser, der sigter mod dissektion af det ekstrahepatiske galdesystem.Nogle funktioner i protokollen, for eksempel at forlade maven fastgjort til tolvfingertarmen, kan være nyttige i forskning af duodenal atresi for at muliggøre korrekt orientering af den delvist fordøjede mælk udtrykt af maven. I begyndelsen kan teknikken kræve lidt tid til træning. Øvelse og opfølgning af den trinvise tilgang vil øge hastigheden og resultatet.Til at begynde med skal du placere de desinficerede og autoklaverede instrumenter på en steril overflade ved siden af operationsbordet. Efter at have lavet et snit i peritoneum, udvid snittet til halshugningens placering efter den venstre frontale aksillære linje. Fjern huden fra venstre til højre side med atraumatiske tang.Under et mikroskop skal du holde peritoneum omkring milten. Løft det forsigtigt op, indtil bughinden ligner en teltlignende struktur, og skær et hul på en millimeter i midten. Vent på, at peritonealteltet bliver fyldt med luft.Afskær peritoneum i et vindue indrammet af de nedre ribben, begge laterale abdominale regioner og det nedre blæreområde. Sørg for fuld adgang til leveren, galdekanalsystemet, maven, tyndtarmen og tyktarmen. Undersøg galdeblæren og galdekanalerne ved omhyggeligt at trække xiphoidprocessen i en kranial ventral position.Undgå at rive det falciforme ledbånd, der kan føre til rive galdeblæren fra galdekanalsystemet. Slip derefter trækket af xiphoid-processen. Træk forsigtigt tolvfingertarmen ned for at frigøre galdekanalsystemet.Udfør derefter den nedre En-bloc mobilisering ved at identificere duodenal papilla, som forbinder galdekanalsystemet med tolvfingertarmen. Skær gennem tolvfingertarmen omkring to centimeter til højre sideside af papillen. Skær derefter gennem pylorområdet.Sørg for, at maveindholdet er til stede i pylorområdet mellem skærestedet og duodenal papillaen. For at udføre den øvre En-bloc mobilisering skal du forsigtigt trække xiphoidprocessen og få adgang til det falciforme ledbånd. Lav et snit på en centimeter gennem det falciforme ledbånd mellem galdeblæren og tæt på xiphoidprocessen.Skær gennem forbindelsesstrukturerne mellem leveren og thoraxen, såsom spiserøret, ringere vena cava, thorax aorta og alle ledbånd, der omgiver det blotte område af leveren. Skær også alle dorsalt resterende vævsforbindelser. Under 20 gange mikroskopisk forstørrelse placeres En-bloc-prøven på en skumpude.Saml prøven ved at omorganisere den i den korrekte anatomiske position. Ved hjælp af blid bevægelse flader den orale og aborale del af tolvfingertarmen. Brug atraumatisk tang til at starte udfladningsbevægelsen ved duodenal papilla og fortsæt til skærekanterne.Derefter glattes det hvide pulpy indhold i maven i den orale del af tolvfingertarmen. Identificer den orale og den aborale del af tolvfingertarmen for at udelukke sandsynlig galdekanalrotation. Skær store rester af levervæv væk, før galdekanalen dissekeres.Efter et par skrabebevægelser overføres prøven til en renere position på skummåtten. Brug det mindre pressede levervæv i baggrunden til at optimere visningen for differentiering mellem EBDS og uønskede celler. Behandl hepatoduodenal ligamentet, indtil det isolerede EBDS forbliver.Overhold leverarterien og portalvenen, der opstår som hvid og meget delikat filament, cirka tre til fem millimeter oralt fra duodenal papilla. Fjern forsigtigt dette sarte filament ved hjælp af et blidt træk til venstre sideside. Sørg for, at skrabebevægelserne starter fra galdekanalsystemet og fører til levergrænserne.Ved hjælp af denne protokol blev EBDS dissekeret fra ni dage gamle murine nyfødte. Længden af den isolerede EBDS fra galdeblære til duodenal papilla var mindre end 10 millimeter, og diameteren af den sarte ductus choledochus varierede fra 0,05 til 0,2 millimeter. Hematoxylin eosin farvning blev udført på den langsgående del af EBDS med et åbent lumen.Cholangiocytterne blev identificeret omkring lumen som et monolag og blev farvet mørkere. Forskere bør dele og standardisere driftsteknikker såsom dissektions- og injektionsprotokoller for at forbedre sammenligneligheden og den hurtige anvendelighed af deres undersøgelser og resultater. Forudgående dissektion vil være fordelagtig for histologiske og enkeltcellede tilgange, såsom isolering af intra- og extraperi-cholangiocytter, fordi det resulterer i reduktion af cellekulturforurening.

Research

JoVE Journal

Medicine

Mouse Bladder Wall Injection

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. ...

Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

3-dimensionelt Resin Støbning og Imaging of Mouse Portal Vein eller Intrahepatisk galdegang System

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Urinary Bladder Distention Evoked Visceromotor Responses as a Model for Bladder Pain in Mice

Urinblæren Udspilning Evoked Visceromotor Responses som en model for blæresmerter i mus

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition ...

State of the Art Cranial Ultrasound Imaging in Neonates

State of the Art Kranie Ultrasound Imaging hos nyfødte

Cranial ultrasound (CUS) is a reputable tool for brain imaging in critically ill neonates. It is safe, relatively cheap and easy to use, even when a ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Bile Duct Ligering i mus: Induktion af inflammatorisk leverskade, og fibrose ved Obstruktiv Kolestase

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

Kirurgisk Skade til Mouse Pancreas gennem Ligation af Pancreas Duct som en model for Endokrine og eksokrine omprogrammering og spredning

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

Transcutaneous Microcirculatory Imaging in Preterm Neonates

Transkutan mikrocirkulatoriske Imaging hos præmature nyfødte

Microcirculatory imaging (MI) is a relatively new research tool mainly used in the intensive care setting. MI provides a clear view of the smallest ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Isolering og Profilering af MicroRNA-holdige Exosomer fra human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...