Name: extrahepatic bile duct and gall bladder dissection in nine-day-old mouse neonates
Uploaded: 2022-08-23T15:00:00
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Les auteurs remercient Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, Dr. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl et Magdalena Trochimiuk pour leurs contributions. Hans Christian Schmidt a été soutenu financièrement par la bourse Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME (2021_EKPK.10), UKE, Hambourg.

Suite à l’approbation éthique (N045/2021), des nouveau-nés de souris C57BL/6 mâles et femelles ont été observés jusqu’à l’âge de 9 jours. Les animaux sont nés et fournis à des fins expérimentales par l’animalerie du Centre médical universitaire de Hambourg-Eppendorf, Hambourg, Allemagne. Les nouveau-nés ont été logés dans une cage avec leurs animaux parents. Les conditions environnementales ont été contrôlées en température (20-24 °C), 12:12 h de cycle lumière-obscurité et humidité relat...

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+biliary+epithelial+cells+from+the+biliary+tract+fraction+of+normal+rats.">Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats.</a> Liver. 6 (6), 369-378 (1986).</li><li>Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+polarized+primary+cultures+of+rat+intrahepatic+bile+duct+epithelial+cells.">Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells.</a> Laboratory Investigation. 74 (1), 303-313 (1996).</li><li>Paradis, K., Sharp, H. 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Cet article rapportait et discutait de la création et de la validation d’une nouvelle approche chirurgicale pour retirer l’EBDS de souris néonatales euthanasiées. Les résultats microscopiques et histologiques révèlent que l’approche détecte rapidement les EBD et les dissèque près des marges du canal, même chez les souris néonatales. Seuls des instruments chirurgicaux et un microscope avec un grossissement de 20x sont nécessaires pour le protocole décrit. De plus, l’approche permet d’isoler l’ense...

La genèse et la progression des cholangiopathies telles que l’atrésie biliaire, la cholangite sclérosante primitive (CSP) et la cholangite biliaire primitive (CBP) sont inconnues ou incomplètes 1,2. La compréhension limitée de l’origine et de la progression de ces maladies conduit à une pénurie d’options thérapeutiques3. L’obstacle le plus difficile dans l’étude des troubles des voies biliaires néonatales est d’acquérir une compréhension moléculaire de la physiopathologie. L’une des clés essentielles d’une meilleure compréhension de la pathologie moléculaire est la meilleure observation possible des tissus affectés. Pour éviter une comparabilité réduite et des divergences entre les recherches, telles que l’observation de l’étiologie virale potentielle de l’atrésiebiliaire 4, il est nécessaire de préparer et de partager au mieux les techniques de dissection effectuées. Une préparation pure du tissu cible est nécessaire pour des investigations microscopiques ultérieures ou des cultures organoïdes cellulaires et 3D de reproduction. Cependant, dans les troubles néonatals murins, les échantillons de tissus sont rares et ne se produisent qu’en petite quantité en raison de leur très petite taille. En ce qui concerne les troubles des voies biliaires, des difficultés dans une préparation propre des voies biliaires chez les nouveau-nés murins ont été décrites5. En raison du stade néonatal de développement, la différenciation tissulaire n’est pas trop avancée, ce qui complique la préparation et augmente la difficulté par rapport à la préparation d’échantillons adultes. Par conséquent, le groupe de travail opérationnel a étudié une nouvelle stratégie pour préparer l’EBDS dans un modèle murin néonatal. Dans la présente étude, la technique permet une dissection efficace de chaque échantillon.
Le système des canaux biliaires est placé par voie intrapéritonéale dans la partie supérieure droite de l’abdomen, provenant du foie. La vésicule biliaire est située sous la surface viscérale du lobe droit du foie. Le canal biliaire, ainsi que la veine porte et l’artère hépatique, sont intégrés dans le ligament hépatoduodénal. Il relie directement le foie et le duodénum et draine le liquide biliaire dans le duodénum6. Anatomiquement, le canal biliaire est divisé en canaux hépatiques droit et gauche, le canal hépatique commun, le canal kystique et le canal cholédoque, formé par la confluence du canal kystique et du canal hépatique commun7. Celui-ci finit par vider le liquide biliaire et la salive du canal pancréatique dans le duodénum via l’ampoule de Vater.
Les cholangiocytes tapissent les voies biliaires intra- et extra-hépatiques, vivant dans une niche anatomique compliquée où ils aident à la production de bile et à l’homéostasie8. Le liquide biliaire passe quotidiennement ces cellules épithéliales spécialisées à des concentrations élevées. En particulier, l’entretien du parapluie HCO3- est très important pour protéger contre la toxicité des acides biliaires9. Les cholangiocytes sont la première ligne de défense du système hépatobiliaire contre, par exemple, les micro-organismes luminaux10. L’efficacité de défense des cholangiocytes contre les agressions toxiques peut être affaiblie par une prédisposition génétique. Une surcharge toxique provoque des dommages et des destructions et peut donc entraîner des cholangiopathies. De plus, les voies biliaires en développement ne sont pas complètement capables de tous les mécanismes d’autoprotection, ce qui entraîne une plus grande susceptibilité aux toxines environnementales dans les voies biliaires néonatales11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>CHEMSOLUTE</td>
			<td>11365000</td>
			<td>used as a dehydrating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G canula</td>
			<td>B Braun/Sterican, Melsungen Germany</td>
			<td>4656300</td>
			<td>canula for hydration of the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air vent</td>
			<td>C + P M&#246;belsysteme GmbH &#38; Co. KG, Breidenbach, Germany</td>
			<td>Tec-Ononmic AZ 1200</td>
			<td>the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua ad injectabilia Braun</td>
			<td>B Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>2351744</td>
			<td>saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bigger microsurgical Forceps</td>
			<td>DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland</td>
			<td>FD253R</td>
			<td>straight, 180 mm (7&#34;), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera &#8220;SmartCAM 5&#8221;&#160;</td>
			<td>Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom</td>
			<td>EVC131A</td>
			<td>optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2&#34;; Used for videoproduction and technical evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany</td>
			<td>12612613</td>
			<td>used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration sponge&#160;</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>TT56.1</td>
			<td>sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of&#160; two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Phosphat Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Doesn&#180;t contain Calzium or Magnesium, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassettes</td>
			<td>Engelbrecht GmbH, Ederm&#252;nde, Germany</td>
			<td>17990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>41-6660-00</td>
			<td>staining solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors CeramaCut</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>14959-09</td>
			<td>Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>41-5130-00</td>
			<td>staining solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highresolotion microscope</td>
			<td>Vision Engineering, Send United Kingdom</td>
			<td>EVO503&#160;</td>
			<td>Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany</td>
			<td>BX60F5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glases</td>
			<td>Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>101244</td>
			<td>60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany</td>
			<td>03-0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica, Nu&#223;loch, Germany</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td>Tool for sectioning (2 &#181;m-slices)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix-F 1 mL syringe</td>
			<td>B Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>syringe without canula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sakura Finetec, Torrance, USA</td>
			<td>4511</td>
			<td>Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding machine</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>TES 99</td>
			<td>The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Morphisto</td>
			<td>1176201000</td>
			<td>Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Microsurgical Forceps&#160;</td>
			<td>EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), B&#252;tthard, Bayern, Germany</td>
			<td>(00)165</td>
			<td>Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Ruler</td>
			<td>Agntho&#39;s AB, Liding&#246;, Sweden</td>
			<td>30085-15</td>
			<td>150mm With Metric &#38; Inch Graduations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors &#8211; Sharp-blunt for decapitation</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>14001-14</td>
			<td>Device for decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warming cabinet</td>
			<td>Haraeus, Hanau, Germany</td>
			<td>T 6060</td>
			<td>the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extrahepatic bile duct and gall bladder dissection in nine-day-old mouse neonates

La dissection des voies biliaires néonatales murines a été décrite comme difficile. L’objectif principal de la procédure opératoire standard décrite est l’isolement du canal biliaire extrahépatique (EBD) chez les nouveau-nés de souris sans endommager le canal biliaire pendant la préparation. En raison de sa préparation exceptionnellement étroite par rapport à la lignée cellulaire des cholangiocytes et de la récolte de l’ensemble du système des canaux biliaires extrahépatiques (EBDS), l’approche décrite est extrêmement utile dans la recherche de modèles animaux de troubles des voies biliaires chez le nouveau-né, tels que l’atrésie biliaire. Après l’euthanasie, la cavité péritonéale a été consultée et le système des voies biliaires, le duodénum et le foie ont été extraits avec la résection unique En-bloc (EbR). L’échantillon extrait est placé sur un tapis de mousse, et l’EBD est disséqué des cellules contaminantes de manière atraumatique sans contact nécessaire. La dissection de l’ensemble de l’EBDS est un avantage significatif de cette méthode. Des précautions doivent être prises en raison de la petite taille et de la petite quantité de tissu des canaux biliaires. En utilisant la technique décrite, il n’y a pas de dommages aux cholangiocytes. De plus, la pureté de la technique est reproductible (n = 10). Par conséquent, des échantillons comparables de manière optimale peuvent être récoltés. De plus, aucun tissu des canaux biliaires n’est endommagé, car tout contact avec le système des canaux biliaires peut être évité pendant la préparation, laissant le liquide biliaire à l’intérieur de la vésicule biliaire. Plus important encore, lors de la dissection finale de la vésicule biliaire et des voies biliaires, des microinstruments atraumatiques n’ont été utilisés que légèrement latéralement du canal biliaire sans le serrer. C’est la clé d’un échantillon propre et intact, et essentiel pour une investigation histologique plus approfondie ou l’isolement des cholangiocytes. En résumé, la technique de dissection innovante décrite permet aux opérateurs, en particulier inexpérimentés, disposant de l’équipement nécessaire, d’isoler le EBDS aussi proprement que possible.

La figure 1A montre l’EBDS d’un nouveau-né murin, qui a été disséqué avec la technique décrite. Au microscope, aucun autre tissu hépatique n’est visible. Le tissu hépatique a été enlevé au cours des dernières étapes d’isolement du protocole et pourrait facilement être distingué du tissu des canaux biliaires en ce qui concerne la couleur et la consistance. La figure 1B montre l’échantillon isolé par rapport à une échelle millimétriqu...

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Extrahepatic Bile Duct and Gall Bladder Dissection in Nine-Day-Old Mouse Neonates

Pour l’observation des troubles des voies biliaires néonatales murines, un canal biliaire intact et une préparation efficace sont nécessaires. Par conséquent, une nouvelle approche pour isoler l’ensemble du système des canaux biliaires extrahépatiques chez les nouveau-nés murins a été développée avec succès tout en maintenant l’intégrité des voies biliaires.

Dissection des canaux biliaires extrahépatiques et de la vésicule biliaire chez les nouveau-nés de souris âgés de neuf jours

The dissection of murine neonatal bile ducts has been described as difficult. The main aim of the described standard operating procedure is the isolation ...

De nombreux rapports évaluant le système biliaire extrahépatique ont indiqué qu’ils avaient obtenu les échantillons, mais pas comment ils les avaient obtenus, ce qui soulevait des problèmes de comparabilité. Le principal avantage de cette technique est que l’ensemble du système biliaire extrahépatique peut être disséqué et que les cellules contaminantes peuvent être éliminées de manière atraumatique. Notre protocole de dissection peut être généralement appliqué à des approches expérimentales travaillant sur les troubles des canaux biliaires néonatals murins, visant la dissection du système biliaire extrahépatique.Certaines caractéristiques du protocole, par exemple, laisser l’estomac attaché au duodénum, pourraient être utiles dans la recherche sur l’atrésie duodénale pour permettre une orientation correcte par le lait partiellement digéré exprimé par l’estomac. Au début, la technique peut nécessiter un certain temps pour l’entraînement. Pratiquer et suivre l’approche étape par étape augmentera la vitesse et les résultats.Pour commencer, placez les instruments désinfectés et autoclavés sur une surface stérile à côté de la table d’opération. Après avoir fait une incision dans le péritoine, étendez la coupe à l’emplacement de la décapitation, en suivant la ligne axillaire frontale gauche. Retirez la peau de gauche à droite avec une pince atraumatique.Au microscope, tenez le péritoine entourant la rate. Soulevez-le doucement jusqu’à ce que le péritoine ressemble à une structure en forme de tente et faites un trou d’un millimètre au centre. Attendez que la tente péritonéale soit remplie d’air.Coupez le péritoine dans une fenêtre encadrée par les côtes inférieures, les deux régions abdominales latérales et la région inférieure de la vessie. Assurez-vous d’un accès complet au foie, au système des voies biliaires, à l’estomac, à l’intestin grêle et au côlon. Examinez la vésicule biliaire et les voies biliaires en tirant soigneusement le processus xiphoïde en position ventrale crânienne.Évitez la déchirure du ligament falciforme qui peut entraîner une déchirure de la vésicule biliaire du système des voies biliaires. Ensuite, relâchez l’attraction du processus xiphoïde. Tirez doucement vers le bas le duodénum pour libérer le système des voies biliaires.Ensuite, effectuez la mobilisation en bloc En-inférieur en identifiant la papille duodénale, qui relie le système des voies biliaires au duodénum. Coupez à travers le duodénum d’environ deux centimètres vers le côté latéral droit de la papille. Ensuite, coupez à travers la zone pylorique.Assurez-vous que le contenu de l’estomac est présent dans la région pylorique entre le lieu de coupe et la papille duodénale. Pour effectuer la mobilisation En-bloc supérieure, tirez doucement sur le processus xiphoïde et accédez au ligament falciforme. Faites une coupe d’un centimètre à travers le ligament falciforme entre la vésicule biliaire et près du processus xiphoïde.Couper à travers les structures de connexion entre le foie et le thorax, telles que l’œsophage, la veine cave inférieure, l’aorte thoracique et tous les ligaments qui entourent la zone nue du foie. En outre, coupez toutes les connexions tissulaires restantes dorsalement. Sous un grossissement microscopique de 20 fois, placer l’échantillon En-bloc sur un tampon en mousse.Assemblez l’échantillon en le réorganisant dans la bonne position anatomique. En utilisant un mouvement doux, aplatir la partie buccale et aborale du duodénum. À l’aide d’une pince atraumatique, commencez le mouvement d’aplatissement au niveau de la papille duodénale et continuez jusqu’aux bords tranchants.Ensuite, lissez le contenu pulpeux blanc de l’estomac dans la partie buccale du duodénum. Identifier la partie buccale et la partie aborale du duodénum pour exclure une rotation probable des voies biliaires. Coupez les gros restes de tissu hépatique avant de disséquer le canal biliaire.Après quelques mouvements de grattage, transférer l’échantillon dans une position plus propre sur le tapis de mousse. Utilisez le tissu hépatique moins pressé en arrière-plan pour optimiser la vue de différenciation entre EBDS et cellules indésirables. Traiter le ligament hépatoduodénal jusqu’à ce qu’il reste le EBDS isolé.Observez l’artère hépatique et la veine porte se présentant sous forme de filament blanc et très délicat, à environ trois à cinq millimètres par voie orale de la papille duodénale. Retirez soigneusement ce filament délicat en tirant doucement sur le côté latéral gauche. Assurez-vous que les mouvements de grattage commencent à partir du système des canaux biliaires et mènent aux limites du foie.À l’aide de ce protocole, EBDS a été disséqué à partir de nouveau-nés murins âgés de neuf jours. La longueur de l’EBDS isolé de la vésicule biliaire à la papille duodénale était inférieure à 10 millimètres, et le diamètre du canal choledochus délicat variait de 0,05 à 0,2 millimètre. La coloration à l’hématoxyline éosine a été réalisée sur la coupe longitudinale de l’EBDS avec une lumière ouverte.Les cholangiocytes ont été identifiés autour de la lumière comme une monocouche et ont été teints plus foncés. Les chercheurs devraient partager et normaliser les techniques opératoires telles que les protocoles de dissection et d’injection afin d’améliorer la comparabilité et la facilité d’utilisation rapide de leurs études et de leurs résultats. La dissection préalable sera avantageuse pour les approches histologiques et unicellulaires, telles que l’isolement des intra et extrapéri-cholangiocytes, car elle entraîne la réduction de la contamination par culture cellulaire.

Research

JoVE Journal

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Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Bile ligature du canal chez la souris: induction de inflammatoire lésions hépatiques et les fibrose par obstructive cholestase

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

Blessure chirurgicale au pancréas de souris par ligature du canal pancréatique tant que modèle de endocrines et exocrines Reprogrammation et prolifération

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

Transcutaneous Microcirculatory Imaging in Preterm Neonates

Transcutanée Microcirculatory Imagerie en nouveau-nés prématurés

Microcirculatory imaging (MI) is a relatively new research tool mainly used in the intensive care setting. MI provides a clear view of the smallest ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

L&#39;isolement et le profilage des exosomes de Bile humain contenant microARN-

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...