Name: extrahepatic bile duct and gall bladder dissection in nine-day-old mouse neonates
Uploaded: 2022-08-23T15:00:00
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Die Autoren danken Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl und Magdalena Trochimiuk für ihre Beiträge. Hans Christian Schmidt wurde gefördert durch das iPRIME-Stipendium der Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2021_EKPK.10), UKE, Hamburg.

Nach der ethischen Zulassung (N045/2021) wurden männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse bis zum Alter von 9 Tagen beobachtet. Die Tiere wurden von der Tiereinrichtung des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Deutschland geboren und zu Versuchszwecken zur Verfügung gestellt. Die Neugeborenen wurden zusammen mit ihren Elterntieren in einem Käfig untergebracht. Die Umgebungsbedingungen wurden in Temperatur (20-24 °C), 12:12 h Hell-Dunkel-Zyklus und relativer Luftfeuchtigkeit von 40%-70% kontrolliert.
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Dieser Artikel berichtete und diskutierte die Entwicklung und Validierung eines neuen chirurgischen Ansatzes zur Entfernung des EBDS von euthanasierten Neugeborenenmäusen. Mikroskopische und histologische Befunde zeigen, dass der Ansatz EBDs schnell erkennt und sie in der Nähe der Ränder des Kanals seziert, selbst bei neugeborenen Mäusen. Für das beschriebene Protokoll werden lediglich chirurgische Instrumente und ein Mikroskop mit einer 20-fachen Vergrößerung benötigt. Darüber hinaus ermöglicht der Ansatz die ...

Die Entstehung und das Fortschreiten von Cholangiopathien wie Gallenatresie, primär sklerosierender Cholangitis (PSC) und primärer biliärer Cholangitis (PBC) sind entweder unbekannt oder unvollständig 1,2. Das begrenzte Verständnis der Entstehung und des Verlaufs dieser Krankheiten führt zu einem Mangel an Therapieoptionen3. Das schwierigste Hindernis bei der Untersuchung neonataler Gallengangserkrankungen ist das molekulare Verständnis der Pathophysiologie. Einer der wesentlichen Schlüssel zum besseren Verständnis der molekularen Pathologie ist die bestmögliche Beobachtung des betroffenen Gewebes. Um eine verminderte Vergleichbarkeit und Diskrepanzen zwischen der Forschung zu vermeiden, wie z.B. die Beobachtung der potenziellen viralen Ätiologie der Gallenatresie4, ergibt sich die Notwendigkeit der bestmöglichen Vorbereitung und des Austauschs der durchgeführten Dissektionstechniken. Eine reine Präparation des Zielgewebes ist für spätere mikroskopische Untersuchungen oder die Züchtung von Zell- und 3D-Organoidkulturen notwendig. Bei neonatalen Erkrankungen der Maus sind Gewebeproben jedoch selten und treten aufgrund der sehr geringen Größe nur in geringer Menge auf. In Bezug auf Gallengangserkrankungen wurden Schwierigkeiten bei einer sauberen Vorbereitung der Gallengänge bei murinen Neugeborenen beschrieben5. Aufgrund des neonatalen Entwicklungsstadiums ist die Gewebedifferenzierung nicht übermäßig fortgeschritten, was die Vorbereitung erschwert und die Schwierigkeit im Vergleich zur Vorbereitung von adulten Proben erhöht. Daher untersuchte die operative Arbeitsgruppe eine neuartige Strategie zur Vorbereitung des EBDS in einem neonatalen Mausmodell. In der vorliegenden Studie ermöglicht die Technik eine effiziente Zerlegung jeder Probe.
Das Gallengangssystem befindet sich intraperitoneal im rechten Oberbauch, der aus der Leber entsteht. Die Gallenblase befindet sich unter der viszeralen Oberfläche des rechten Leberlappens. Der Gallengang ist zusammen mit der Pfortader und der Leberarterie in das Ligamentum hepatoduodenalis eingebettet. Es verbindet die Leber und den Zwölffingerdarm direkt und leitet Gallenflüssigkeit in den Zwölffingerdarm6 ab. Anatomisch ist der Gallengang in die rechten und linken Lebergänge, den gemeinsamen Lebergang, den Zystengang und den Ductus choledochus unterteilt, der durch den Zusammenfluss des zystischen Ganges und des gemeinsamen Lebergangs7 gebildet wird. Dieser entleert schließlich Gallenflüssigkeit und Speichel aus dem Pankreasgang über die Ampulla von Vater in den Zwölffingerdarm.
Cholangiozyten kleiden den Gallengang intra- und extrahepatisch aus und leben in einer komplizierten anatomischen Nische, wo sie die Gallenproduktion und Homöostase unterstützen8. Gallenflüssigkeit passiert diese spezialisierten Epithelzellen täglich in hohen Konzentrationen. Insbesondere die HCO3-Schirmpflege ist sehr wichtig für den Schutz vor Gallensäuretoxizität9. Cholangiozyten sind die erste Verteidigungslinie im hepatobiliären System gegen beispielsweise luminale Mikroorganismen10. Die Abwehrwirksamkeit der Cholangiozyten gegen toxische Angriffe kann durch genetische Veranlagung geschwächt werden. Eine toxische Überlastung verursacht Schäden und Zerstörung und kann daher zu Cholangiopathien führen. Darüber hinaus ist der sich entwickelnde Gallengang nicht vollständig zu allen Selbstschutzmechanismen fähig, was zu einer höheren Anfälligkeit für Umweltgifte in neonatalen Gallengängen führt11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>CHEMSOLUTE</td>
			<td>11365000</td>
			<td>used as a dehydrating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G canula</td>
			<td>B Braun/Sterican, Melsungen Germany</td>
			<td>4656300</td>
			<td>canula for hydration of the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air vent</td>
			<td>C + P M&#246;belsysteme GmbH &#38; Co. KG, Breidenbach, Germany</td>
			<td>Tec-Ononmic AZ 1200</td>
			<td>the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua ad injectabilia Braun</td>
			<td>B Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>2351744</td>
			<td>saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bigger microsurgical Forceps</td>
			<td>DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland</td>
			<td>FD253R</td>
			<td>straight, 180 mm (7&#34;), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera &#8220;SmartCAM 5&#8221;&#160;</td>
			<td>Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom</td>
			<td>EVC131A</td>
			<td>optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2&#34;; Used for videoproduction and technical evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany</td>
			<td>12612613</td>
			<td>used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration sponge&#160;</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>TT56.1</td>
			<td>sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of&#160; two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Phosphat Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Doesn&#180;t contain Calzium or Magnesium, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassettes</td>
			<td>Engelbrecht GmbH, Ederm&#252;nde, Germany</td>
			<td>17990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>41-6660-00</td>
			<td>staining solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors CeramaCut</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>14959-09</td>
			<td>Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>41-5130-00</td>
			<td>staining solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highresolotion microscope</td>
			<td>Vision Engineering, Send United Kingdom</td>
			<td>EVO503&#160;</td>
			<td>Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany</td>
			<td>BX60F5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glases</td>
			<td>Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>101244</td>
			<td>60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany</td>
			<td>03-0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica, Nu&#223;loch, Germany</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td>Tool for sectioning (2 &#181;m-slices)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix-F 1 mL syringe</td>
			<td>B Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>syringe without canula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sakura Finetec, Torrance, USA</td>
			<td>4511</td>
			<td>Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding machine</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>TES 99</td>
			<td>The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Morphisto</td>
			<td>1176201000</td>
			<td>Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Microsurgical Forceps&#160;</td>
			<td>EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), B&#252;tthard, Bayern, Germany</td>
			<td>(00)165</td>
			<td>Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Ruler</td>
			<td>Agntho&#39;s AB, Liding&#246;, Sweden</td>
			<td>30085-15</td>
			<td>150mm With Metric &#38; Inch Graduations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors &#8211; Sharp-blunt for decapitation</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>14001-14</td>
			<td>Device for decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warming cabinet</td>
			<td>Haraeus, Hanau, Germany</td>
			<td>T 6060</td>
			<td>the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extrahepatic bile duct and gall bladder dissection in nine-day-old mouse neonates

Die Dissektion der neonatalen Gallengänge von Mäusen wurde als schwierig beschrieben. Das Hauptziel der beschriebenen Standardarbeitsanweisung ist die Isolierung des extrahepatischen Gallengangs (EBD) bei Mausneugeborenen, ohne den Gallengang während der Präparation zu schädigen. Aufgrund seiner außergewöhnlich engen Präparation im Vergleich zur Cholangiozyten-Zelllinie und der Gewinnung des gesamten extrahepatischen Gallengangssystems (EBDS) ist der beschriebene Ansatz äußerst nützlich bei der Erforschung von Tiermodellen neugeborener Gallengangserkrankungen, wie z.B. der Gallenatresie. Nach der Euthanasie wurde die Peritonealhöhle betreten und Gallengangssystem, Zwölffingerdarm und Leber mit der einzigartigen En-bloc-Resektion (EbR) extrahiert. Die extrahierte Probe wird auf eine Schaumstoffmatte gelegt, und das EBD wird ohne notwendige Berührung atraumatisch von kontaminierenden Zellen seziert. Die Dissektion des gesamten EBDS ist ein wesentlicher Vorteil dieser Methode. Aufgrund der geringen Größe und Menge an Gallengangsgewebe ist Vorsicht geboten. Mit der beschriebenen Technik gibt es keine Schädigung der Cholangiozyten. Weiterhin ist die Reinheit der Technik reproduzierbar (n = 10). So können optimal vergleichbare Proben entnommen werden. Darüber hinaus wird kein Gallengangsgewebe geschädigt, da jeder Kontakt mit dem Gallengangssystem während der Präparation vermieden werden kann und die Gallenflüssigkeit in der Gallenblase verbleibt. Am wichtigsten ist, dass bei der Durchführung der abschließenden Gallenblasen- und Gallengangsdissektion atraumatische Mikroinstrumente nur geringfügig seitlich des Gallengangs verwendet wurden, ohne ihn zu quetschen. Dies ist der Schlüssel zu einer sauberen und intakten Probe und unerlässlich für weitere histologische Untersuchungen oder die Isolierung von Cholangiozyten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die beschriebene innovative Dissektionstechnik es besonders unerfahrenen Bedienern ermöglicht, das EBDS möglichst sauber zu isolieren.

Abbildung 1A zeigt das EBDS eines murinen Neugeborenen, das mit der beschriebenen Technik seziert wurde. Mikroskopisch ist kein weiteres Lebergewebe sichtbar. Das Lebergewebe wurde während der letzten Isolationsschritte des Protokolls entfernt und konnte in Farbe und Konsistenz leicht vom Gallengangsgewebe unterschieden werden. Abbildung 1B zeigt die isolierte Probe im Vergleich zu einer Millimeterskala. Die Länge des EBD (gemessen von der Gallenblase bis zur ...

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Extrahepatic Bile Duct and Gall Bladder Dissection in Nine-Day-Old Mouse Neonates

Für die Beobachtung von neonatalen Gallengangsstörungen der Maus sind ein intakter Gallengang und eine effiziente Vorbereitung erforderlich. Daher wurde erfolgreich ein neuer Ansatz zur Isolierung des gesamten extrahepatischen Gallengangsystems bei murinen Neugeborenen unter Beibehaltung der Integrität des Gallengangs entwickelt.

Extrahepatische Gallengangs- und Gallenblasendissektion bei neun Tage alten Maus-Neugeborenen

The dissection of murine neonatal bile ducts has been described as difficult. The main aim of the described standard operating procedure is the isolation ...

Viele Berichte, die das extrahepatische Gallensystem bewerteten, berichteten, dass sie die Proben erhielten, aber nicht, wie sie sie erhielten, was Fragen hinsichtlich der Vergleichbarkeit aufwarf. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das gesamte extrahepatische Gallensystem seziert und kontaminierende Zellen atraumatisch entfernt werden können. Unser Dissektionsprotokoll kann allgemein auf experimentelle Ansätze angewendet werden, die an neonatalen Gallengangserkrankungen der Maus arbeiten und auf die Dissektion des extrahepatischen Gallensystems abzielen.Einige Merkmale des Protokolls, zum Beispiel das Belassen des Magens am Zwölffingerdarm, könnten bei der Erforschung der Zwölffingerdarmatresie nützlich sein, um eine korrekte Orientierung durch die teilweise verdaute Milch zu ermöglichen, die vom Magen ausgedrückt wird. Zu Beginn kann die Technik etwas Zeit für das Training benötigen. Das Üben und Befolgen des schrittweisen Ansatzes erhöht die Geschwindigkeit und das Ergebnis.Stellen Sie zunächst die desinfizierten und autoklavierten Instrumente auf eine sterile Oberfläche neben dem Operationstisch. Nachdem Sie einen Schnitt im Peritoneum gemacht haben, dehnen Sie den Schnitt bis zum Ort der Enthauptung aus und folgen Sie der linken frontalen Achsellinie. Entfernen Sie die Haut von links nach rechts mit einer schonenden Pinzette.Halten Sie unter einem Mikroskop das Peritoneum, das die Milz umgibt. Heben Sie es vorsichtig an, bis das Peritoneum einer zeltartigen Struktur ähnelt, und schneiden Sie ein Loch von einem Millimeter in die Mitte. Warten Sie, bis das Peritonealzelt mit Luft gefüllt ist.Schneiden Sie das Peritoneum in einem Fenster ab, das von den unteren Rippen, beiden seitlichen Bauchregionen und dem unteren Blasenbereich eingerahmt wird. Stellen Sie den vollen Zugang zu Leber, Gallengangssystem, Magen, Dünndarm und Dickdarm sicher. Untersuchen Sie die Gallenblase und die Gallenwege, indem Sie den Xiphoidfortsatz vorsichtig in eine kraniale ventrale Position ziehen.Vermeiden Sie das Reißen des falciformen Bandes, das zum Reißen der Gallenblase aus dem Gallengangssystem führen kann. Lassen Sie dann den Zug des Xiphoid-Prozesses los. Ziehen Sie den Zwölffingerdarm vorsichtig nach unten, um das Gallengangssystem zu befreien.Führen Sie dann die Mobilisierung des unteren En-Blocks durch, indem Sie die Zwölffingerdarmpapille identifizieren, die das Gallengangssystem mit dem Zwölffingerdarm verbindet. Schneiden Sie durch den Zwölffingerdarm etwa zwei Zentimeter zur rechten seitlichen Seite der Papille. Dann schneiden Sie durch den Pylorusbereich.Stellen Sie sicher, dass der Mageninhalt im Pylorusbereich zwischen der Schnittstelle und der Zwölffingerdarmpapille vorhanden ist. Um die Mobilisierung des oberen En-Blocks durchzuführen, ziehen Sie vorsichtig den Xiphoid-Prozess und erhalten Sie Zugang zum falciformen Band. Machen Sie einen Zentimeter großen Schnitt durch das falciforme Band zwischen der Gallenblase und in der Nähe des Xiphoid-Prozesses.Schneiden Sie durch die Verbindungsstrukturen zwischen Leber und Thorax, wie die Speiseröhre, die Vena cava inferior, die thorakale Aorta und alle Bänder, die den nackten Bereich der Leber umgeben. Schneiden Sie auch alle dorsal verbleibenden Gewebeverbindungen ab. Legen Sie die En-bloc-Probe unter der 20-fachen mikroskopischen Vergrößerung auf ein Schaumstoffpolster.Setzen Sie die Probe zusammen, indem Sie sie in der richtigen anatomischen Position neu organisieren. Flachen Sie mit sanften Bewegungen den oralen und aboralen Teil des Zwölffingerdarms ab. Beginnen Sie mit einer atraumatischen Pinzette die Abflachbewegung an der Zwölffingerdarmpapille und fahren Sie mit den Schneidkanten fort.Dann glätten Sie den weißen breiigen Inhalt des Magens im oralen Teil des Zwölffingerdarms. Identifizieren Sie den oralen und den aboralen Teil des Zwölffingerdarms, um eine wahrscheinliche Gallengangsrotation auszuschließen. Schneiden Sie große Reste von Lebergewebe weg, bevor Sie den Gallengang sezieren.Nach einigen Schabenbewegungen wird die Probe in eine sauberere Position auf der Schaumstoffmatte gebracht. Verwenden Sie das weniger komprimierte Lebergewebe im Hintergrund, um die Ansicht für die Unterscheidung zwischen EBDS und unerwünschten Zellen zu optimieren. Verarbeiten Sie das hepatoduodenale Band, bis das isolierte EBDS verbleibt.Beobachten Sie die Leberarterie und die Pfortader, die als weißes und sehr empfindliches Filament entstehen, etwa drei bis fünf Millimeter oral von der Zwölffingerdarmpapille entfernt. Entfernen Sie dieses empfindliche Filament vorsichtig mit einem sanften Zug zur linken Seitenseite. Stellen Sie sicher, dass die Schabenbewegungen vom Gallengangssystem ausgehen und zu den Lebergrenzen führen.Mit diesem Protokoll wurde EBDS aus neun Tage alten murinen Neugeborenen seziert. Die Länge des isolierten EBDS von der Gallenblase bis zur Zwölffingerdarmpapille betrug weniger als 10 Millimeter, und der Durchmesser des empfindlichen Ductus choledochus variierte zwischen 0,05 und 0,2 Millimetern. Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung wurde am Längsschnitt des EBDS mit offenem Lumen durchgeführt.Die Cholangiozyten, die das Lumen umgeben, wurden als Monoschicht identifiziert und dunkler gefärbt. Forscher sollten Operationstechniken wie Dissektions- und Injektionsprotokolle teilen und standardisieren, um die Vergleichbarkeit und schnelle Verwendbarkeit ihrer Studien und Ergebnisse zu verbessern. Die vorhergehende Dissektion wird für histologische und einzellige Ansätze, wie die Isolierung von intra- und extraperiperi-Cholangiozyten, vorteilhaft sein, da sie zu einer Verringerung der Zellkulturkontamination führt.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Transcutaneous Microcirculatory Imaging in Preterm Neonates

Transkutane Mikrozirkulatorische Imaging in Frühgeborenen

Microcirculatory imaging (MI) is a relatively new research tool mainly used in the intensive care setting. MI provides a clear view of the smallest ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...