Name: extrahepatic bile duct and gall bladder dissection in nine-day-old mouse neonates
Uploaded: 2022-08-23T15:00:00
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著者らは、ヨハンナ・ハーゲンス、ポーリーネ・シュパート、クララ・フィリッピ、PD博士クリスチャン・トムシャット、スヴェンヤ・ワーンケ、PDダイアナ・リンドナー博士、ディルク・ウェスターマン教授、ミリアム・トムザック、ニコール・リューダー、ナディーン・クルザワ、ライア・パジェロールス・ラルイ博士、ビルギット・アプル、マグダレーナ・トロチミウクの貢献を認めています。ハンス・クリスチャン・シュミットは、ハンブルクのUKEにあるエルゼ・クローナー・フレゼニウス・シュティフトゥングiPRIME奨学金(2021_EKPK.10)によって財政的に支援されました。

倫理的承認(N045/2021)後、雄および雌のC57BL / 6マウス新生児が9日齢まで観察されました。動物は、ドイツのハンブルクにあるハンブルクエッペンドルフ大学医療センターの動物施設によって生まれ、実験目的で提供されました。新生児は親動物と一緒にケージに収容されました。環境条件は、温度(20〜24°C)、12:12時間の明暗サイクル、および相対湿度40%〜70%で制御されました。
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この記事では、安楽死させた新生児マウスのEBDSを除去するための新しい外科的アプローチの作成と検証について報告し、議論しました。顕微鏡的および組織学的所見により、このアプローチはEBDを迅速に検出し、新生児マウスであっても管の縁の近くでそれらを解剖することが明らかになりました。記載されたプロトコルには、手術器具と20倍の倍率の顕微鏡のみが必要です。さらに、この?...

胆道閉鎖症、原発性硬化性胆管炎(PSC)、原発性胆汁性胆管炎(PBC)などの胆管障害の発生と進行は不明または不完全です1,2。これらの疾患の起源と進行についての理解が限られているため、治療の選択肢が不足しています3。新生児胆管疾患を研究する上で最も困難な障害は、病態生理学の分子的理解を得ることです。分子病理学をよりよく理解するための重要な鍵の1つは、患部組織の可能な限り最良の観察です。胆道閉鎖症4の潜在的なウイルス病因を観察するなど、研究間の比較可能性の低下や不一致を避けるために、実行された解剖技術の可能な限り最良の準備と共有の必要性が生じます。標的組織の純粋な調製は、後の顕微鏡調査や細胞および3Dオルガノイド培養の繁殖に必要です。しかし、マウス新生児障害では、組織サンプルはまれであり、サイズが非常に小さいため少量しか発生しません。胆管障害に関しては、マウス新生児における胆管のクリーンな調製の難しさが記載されている5。新生児の発達段階のために、組織分化は過度に進行しておらず、これは調製を複雑にし、成人サンプルの調製と比較して困難を増大させる。したがって、手術ワークグループは、新生児マウスモデルでEBDSを準備するための新しい戦略を調査しました。本研究では、この手法により、各サンプルの効率的な解剖が可能になります。
胆管系は、肝臓から生じる右上腹部に腹腔内に配置されます。胆嚢は、肝臓の右葉の内臓表面の下にあります。胆管は、門脈および肝動脈と共に、肝十二指腸靭帯に埋め込まれている。肝臓と十二指腸を直接結合し、十二指腸6に胆汁液を排出します。解剖学的には、胆管は左右の肝管、総肝管、嚢胞管、および嚢胞管と総肝管の合流点によって形成される総胆管7に分けられる。これは最終的に胆汁と唾液を膵管からベイターの膨大部 を介して 十二指腸に空にします。
胆管細胞は胆管を肝内および肝外に並べ、複雑な解剖学的ニッチに住み、胆汁産生と恒常性を助けます8。胆汁は、これらの特殊な上皮細胞を毎日高濃度で通過させます。特に、HCO3-傘の維持は、胆汁酸毒性から保護するために非常に重要です9。胆管細胞は、例えば管腔微生物10に対する肝胆道系における第一の防御線である。胆管細胞の毒性攻撃に対する防御効果は、遺伝的素因によって弱まる可能性があります。.有毒な過負荷は損傷と破壊を引き起こし、したがって胆管障害につながる可能性があります。さらに、発達中の胆管は、すべての自己防衛機構を完全に行うことができるわけではなく、新生児胆管11における環境毒素に対するより高い感受性をもたらす。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>CHEMSOLUTE</td>
			<td>11365000</td>
			<td>used as a dehydrating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G canula</td>
			<td>B Braun/Sterican, Melsungen Germany</td>
			<td>4656300</td>
			<td>canula for hydration of the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air vent</td>
			<td>C + P M&#246;belsysteme GmbH &#38; Co. KG, Breidenbach, Germany</td>
			<td>Tec-Ononmic AZ 1200</td>
			<td>the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua ad injectabilia Braun</td>
			<td>B Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>2351744</td>
			<td>saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bigger microsurgical Forceps</td>
			<td>DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland</td>
			<td>FD253R</td>
			<td>straight, 180 mm (7&#34;), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera &#8220;SmartCAM 5&#8221;&#160;</td>
			<td>Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom</td>
			<td>EVC131A</td>
			<td>optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2&#34;; Used for videoproduction and technical evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany</td>
			<td>12612613</td>
			<td>used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration sponge&#160;</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>TT56.1</td>
			<td>sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of&#160; two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Phosphat Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Doesn&#180;t contain Calzium or Magnesium, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassettes</td>
			<td>Engelbrecht GmbH, Ederm&#252;nde, Germany</td>
			<td>17990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>41-6660-00</td>
			<td>staining solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors CeramaCut</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>14959-09</td>
			<td>Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>41-5130-00</td>
			<td>staining solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highresolotion microscope</td>
			<td>Vision Engineering, Send United Kingdom</td>
			<td>EVO503&#160;</td>
			<td>Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany</td>
			<td>BX60F5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glases</td>
			<td>Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>101244</td>
			<td>60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany</td>
			<td>03-0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica, Nu&#223;loch, Germany</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td>Tool for sectioning (2 &#181;m-slices)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix-F 1 mL syringe</td>
			<td>B Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>syringe without canula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sakura Finetec, Torrance, USA</td>
			<td>4511</td>
			<td>Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding machine</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>TES 99</td>
			<td>The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Morphisto</td>
			<td>1176201000</td>
			<td>Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Microsurgical Forceps&#160;</td>
			<td>EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), B&#252;tthard, Bayern, Germany</td>
			<td>(00)165</td>
			<td>Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Ruler</td>
			<td>Agntho&#39;s AB, Liding&#246;, Sweden</td>
			<td>30085-15</td>
			<td>150mm With Metric &#38; Inch Graduations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors &#8211; Sharp-blunt for decapitation</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>14001-14</td>
			<td>Device for decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warming cabinet</td>
			<td>Haraeus, Hanau, Germany</td>
			<td>T 6060</td>
			<td>the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extrahepatic bile duct and gall bladder dissection in nine-day-old mouse neonates

マウス新生児胆管の解剖は難しいと言われている。記載された標準操作手順の主な目的は、調製中に胆管を損傷することなく、マウス新生児における肝外胆管(EBD)の単離である。胆管細胞細胞株と比較して非常に近い調製および肝外胆管系(EBDS)全体の採取のために、記載されたアプローチは、胆道閉鎖症などの新生児胆管障害の動物モデルの研究において非常に有用である。安楽死後、腹腔にアクセスし、胆管系、十二指腸、肝臓を独自のEn-bloc切除(EbR)で抽出しました。抽出したサンプルをフォームマットの上に置き、EBDを汚染細胞から非外傷的に解剖します。EBDS全体の解剖は、この方法の大きな利点です。胆管組織のサイズと量が小さいため、注意が必要です。記載された技術を使用しても、胆管細胞に損傷はない。また、当該技術の純度は再現性がある(n=10)。したがって、最適に比較可能なサンプルを採取することができます。さらに、胆管系との接触を調製中に回避し、胆嚢内に胆汁液を残すことができるため、胆管組織は損傷を受けません。最も重要なことは、最終的な胆嚢および胆管郭清を行う際に、非外傷性マイクロ器具を絞らずに胆管のわずかに外側にのみ使用したことです。これは、クリーンで無傷のサンプルの鍵であり、さらなる組織学的調査や胆管細胞の単離に不可欠です。要約すると、説明されている革新的な解剖技術により、特に経験の浅いオペレーターは、必要な機器を使用してEBDSを可能な限りきれいに分離できます。

図1A は、記載された技術を用いて解剖したマウス新生児のEBDSを示す。顕微鏡的には、それ以上の肝組織は見えません。肝組織は、プロトコルの最終分離ステップで除去され、色と一貫性に関して胆管組織と簡単に区別できます。 図1B は、分離されたサンプルをミリメートルスケールと比較したものです。EBDの長さ(胆嚢から十二指腸乳頭まで測定)...

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Extrahepatic Bile Duct and Gall Bladder Dissection in Nine-Day-Old Mouse Neonates

マウス新生児胆管障害の観察には、無傷の胆管と効率的な準備が必要です。したがって、マウス新生児の肝外胆管系全体を分離するための新しいアプローチは、胆管の完全性を維持しながら首尾よく開発されました。

9日齢マウス新生児における肝外胆管および胆嚢郭清

The dissection of murine neonatal bile ducts has been described as difficult. The main aim of the described standard operating procedure is the isolation ...

肝外胆道系を評価した多くの報告では、サンプルを入手したが、どのように入手したかは報告されておらず、比較可能性に関する問題が提起されている。この技術の主な利点は、肝外胆道系全体を解剖し、汚染細胞を非外傷的に除去できることです。私たちの解剖プロトコルは、一般的にマウス新生児胆管疾患に取り組む実験的アプローチに適用でき、肝外胆道系の解剖を目指しています。プロトコルのいくつかの特徴、例えば、胃を十二指腸に付着させたままにすることは、胃によって発現される部分的に消化されたミルクによる正しい方向を可能にする十二指腸閉鎖症の研究において有用であり得る。最初は、このテクニックはトレーニングに時間がかかる場合があります。段階的なアプローチを実践し、それに従うことで、スピードと結果が向上します。まず、消毒およびオートクレーブ処理した器具を手術台の横の無菌面に置きます。腹膜を切った後、左前頭腋窩線に沿って、断頭の位置に切り傷を広げます。非外傷性鉗子で左側から右側に皮膚を取り除きます。顕微鏡下で、脾臓を囲む腹膜を保持します。腹膜がテントのような構造に似るまでゆっくりと持ち上げ、中央に1ミリメートルの穴を開けます。腹膜テントが空気で満たされるのを待ちます。下肋骨、両方の外側腹部領域、および下部膀胱領域で囲まれた窓で腹膜を切り取ります。肝臓、胆管系、胃、小腸、結腸へのフルアクセスを確保します。剣状突起を頭蓋腹側位置で慎重に引っ張ることによって胆嚢および胆管を調べる。胆管系からの胆嚢の裂傷につながる可能性のある鷹状靭帯の裂傷を避けてください。次に、剣状突起のプルを解除します。十二指腸をそっと引き下げて、胆管系を解放します。次に、胆管系を十二指腸に接続する十二指腸乳頭を特定することにより、下部エンブロック動員を行う。乳頭の右側に約2センチメートルの十二指腸を切ります。次に、幽門領域を切り取ります。胃の内容物が切断位置と十二指腸乳頭の間の幽門領域に存在することを確認してください。上部エンブロック動員を実行するには、剣状突起を静かに引っ張り、鷹状靭帯にアクセスします。胆嚢と剣状突起の間の鷹状靭帯を1センチメートル切ります。食道、下大静脈、胸部大動脈、肝臓の裸の領域を囲むすべての靭帯など、肝臓と胸部の間の接続構造を切り取ります。また、背側に残っているすべての組織接続を切断します。顕微鏡倍率20倍で、En-Blocサンプルをフォームパッドの上に置きます。サンプルを正しい解剖学的位置に再編成して組み立てます。穏やかな動きを使用して、十二指腸の口腔部分と口腔部分を平らにします。非外傷性鉗子を使用して、十二指腸乳頭で平坦化運動を開始し、刃先まで続けます。次に、十二指腸の口腔部分の胃の白い果肉の内容物を滑らかにします。十二指腸の口腔部分と口腔部分を特定して、胆管の回転の可能性を除外します。胆管を解剖する前に、肝組織の大きな残りを切り取ります。数回こすった後、サンプルをフォームマットのよりきれいな位置に移します。バックグラウンドで圧迫されていない肝臓組織を使用して、EBDSと不要な細胞との分化のためのビューを最適化します。孤立したEBDSが残るまで肝十二指腸靭帯を処理します。十二指腸乳頭から約3〜5ミリメートルの経口で、白くて非常に繊細なフィラメントとして生じる肝動脈と門脈を観察します。この繊細なフィラメントを慎重に取り外し、左側の側面を軽く引っ張ります。掻き取りの動きが胆管系から始まり、肝臓の境界につながることを確認してください。このプロトコルを使用して、EBDSを9日齢のマウス新生児から解剖しました。胆嚢から十二指腸乳頭までの単離されたEBDSの長さは10ミリメートル未満であり、繊細な胆管の直径は0.05〜0.2ミリメートルの範囲で変化した。ヘマトキシリンエオジン染色は、開いた内腔を有するEBDSの縦断面で行った。胆管細胞は内腔の周囲を単層として同定され、より暗く染色された。研究者は、解剖や注射プロトコルなどの操作技術を共有および標準化して、研究と結果の比較可能性と迅速な使いやすさを向上させる必要があります。先行解剖は、細胞培養汚染の減少をもたらすため、胆管内および胆管周囲外の単離などの組織学的および単一細胞アプローチに有利であろう。

Research

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