Name: extrahepatic bile duct and gall bladder dissection in nine-day-old mouse neonates
Uploaded: 2022-08-23T15:00:00
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저자는 Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl 및 Magdalena Trochimiuk의 공헌을 인정합니다. Hans Christian Schmidt는 함부르크의 UKE에 있는 Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME 장학금(2021_EKPK.10)의 재정 지원을 받았습니다.

윤리적 승인(N045/2021)에 따라 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스 신생아를 9일령까지 관찰했습니다. 동물들은 독일 함부르크의 함부르크-에펜도르프 대학 의료 센터의 동물 시설에서 실험 목적으로 태어나 제공되었습니다. 신생아는 부모 동물과 함께 새장에 수용되었습니다. 환경 조건은 온도 (20-24 ° C), 12:12 h 명암 사이클 및 40 % -70 %의 상대 습도로 제어되었습니다.
1. 실험 준비</...

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이 기사는 안락사된 신생아 마우스의 EBDS를 제거하기 위한 새로운 외과적 접근법의 생성 및 검증을 보고하고 논의했습니다. 현미경 및 조직학적 결과는 이 접근법이 EBD를 신속하게 감지하고 신생아 마우스에서도 덕트 가장자리 근처에서 해부한다는 것을 보여줍니다. 설명 된 프로토콜에는 수술 도구와 20 배 배율의 현미경 만 필요합니다. 또한 이 접근 방식을 통해 전체 EBDS를 격리할 수 있습니다....

담도 폐쇄증, 원발성 경화성 담관염(PSC) 및 원발성 담즙성 담관염(PBC)과 같은 담관병증의 기원과 진행은 알려지지않았거나 불완전합니다1,2. 이러한 질병의 기원과 진행에 대한 제한된 이해는 치료 옵션의 부족으로 이어집니다3. 신생아 담관 장애를 연구하는 데 가장 어려운 장애물은 병태생리학에 대한 분자적 이해를 얻는 것입니다. 분자 병리학을 더 잘 이해하기 위한 필수 열쇠 중 하나는 영향을 받은 조직을 최대한 관찰하는 것입니다. 담도 폐쇄증4의 잠재적 인 바이러스 병인을 관찰하는 것과 같은 연구 간의 비교 가능성 및 불일치 감소를 피하기 위해, 수행 된 해부 기술의 최상의 준비 및 공유가 필요합니다. 표적 조직의 순수한 준비는 나중에 현미경 조사 또는 세포 및 3D 오가노이드 배양 육종에 필요합니다. 그러나 쥐 신생아 장애에서 조직 샘플은 드물고 크기가 매우 작기 때문에 소량 만 발생합니다. 담관 장애와 관련하여 쥐 신생아에서 담관을 깨끗하게 준비하는 데 어려움이 설명되었습니다5. 신생아 발달 단계로 인해 조직 분화가 지나치게 진행되지 않아 성인 샘플 준비에 비해 준비가 복잡해지고 어려움이 증가합니다. 따라서 운영 작업 그룹은 신생아 마우스 모델에서 EBDS를 준비하기 위한 새로운 전략을 조사했습니다. 본 연구에서이 기술은 효율적입니다각 샘플의 해부.
담관 시스템은 간에서 발생하는 오른쪽 상복부에 복강 내 배치됩니다. 담낭은 간 우엽의 내장 표면 아래에 있습니다. 담관은 문맥 및 간동맥과 함께 간십이지장 인대에 내장되어 있습니다. 간과 십이지장을 직접 연결하고 담즙액을 십이지장6으로 배출합니다. 해부학 적으로 담관은 오른쪽 및 왼쪽 간관, 총 간관, 낭성 관 및 낭성 관과 총 간관의 합류에 의해 형성되는 담관7로 나뉩니다. 이것은 결국 담액과 타액을 췌관에서 Vater의 팽대부를 통해 십이지장으로 비웁니다.
담관 세포는 담관 내 및 간외로 늘어서 있으며 담즙 생성과 항상성을 돕는 복잡한 해부학 적 틈새에 거주합니다8. 담액은 이러한 특수 상피 세포를 매일 고농도로 통과합니다. 특히, HCO3-우산 유지는 담즙산 독성으로부터 보호하기 위해 매우중요하다9. 담관 세포는 예를 들어 내강 미생물10에 대한 간 담도계의 첫 번째 방어선입니다. 독성 공격에 대한 담관 세포의 방어 효능은 유전 적 소인에 의해 약화 될 수 있습니다. 독성 과부하는 손상과 파괴를 유발하므로 담관 병증을 유발할 수 있습니다. 더욱이, 발달중인 담관은 모든 자기 보호 메커니즘을 완전히 할 수 없으며, 신생아 담관11에서 환경 독소에 대한 더 높은 감수성을 유도합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>CHEMSOLUTE</td>
			<td>11365000</td>
			<td>used as a dehydrating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G canula</td>
			<td>B Braun/Sterican, Melsungen Germany</td>
			<td>4656300</td>
			<td>canula for hydration of the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air vent</td>
			<td>C + P M&#246;belsysteme GmbH &#38; Co. KG, Breidenbach, Germany</td>
			<td>Tec-Ononmic AZ 1200</td>
			<td>the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua ad injectabilia Braun</td>
			<td>B Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>2351744</td>
			<td>saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bigger microsurgical Forceps</td>
			<td>DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland</td>
			<td>FD253R</td>
			<td>straight, 180 mm (7&#34;), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera &#8220;SmartCAM 5&#8221;&#160;</td>
			<td>Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom</td>
			<td>EVC131A</td>
			<td>optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2&#34;; Used for videoproduction and technical evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany</td>
			<td>12612613</td>
			<td>used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration sponge&#160;</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>TT56.1</td>
			<td>sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of&#160; two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Phosphat Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Doesn&#180;t contain Calzium or Magnesium, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassettes</td>
			<td>Engelbrecht GmbH, Ederm&#252;nde, Germany</td>
			<td>17990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>41-6660-00</td>
			<td>staining solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors CeramaCut</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>14959-09</td>
			<td>Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>41-5130-00</td>
			<td>staining solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highresolotion microscope</td>
			<td>Vision Engineering, Send United Kingdom</td>
			<td>EVO503&#160;</td>
			<td>Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany</td>
			<td>BX60F5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glases</td>
			<td>Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>101244</td>
			<td>60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany</td>
			<td>03-0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica, Nu&#223;loch, Germany</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td>Tool for sectioning (2 &#181;m-slices)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix-F 1 mL syringe</td>
			<td>B Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>syringe without canula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sakura Finetec, Torrance, USA</td>
			<td>4511</td>
			<td>Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding machine</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>TES 99</td>
			<td>The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Morphisto</td>
			<td>1176201000</td>
			<td>Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Microsurgical Forceps&#160;</td>
			<td>EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), B&#252;tthard, Bayern, Germany</td>
			<td>(00)165</td>
			<td>Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Ruler</td>
			<td>Agntho&#39;s AB, Liding&#246;, Sweden</td>
			<td>30085-15</td>
			<td>150mm With Metric &#38; Inch Graduations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors &#8211; Sharp-blunt for decapitation</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>14001-14</td>
			<td>Device for decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warming cabinet</td>
			<td>Haraeus, Hanau, Germany</td>
			<td>T 6060</td>
			<td>the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extrahepatic bile duct and gall bladder dissection in nine-day-old mouse neonates

쥐 신생아 담관의 해부는 어려운 것으로 묘사되었습니다. 설명 된 표준 수술 절차의 주요 목적은 준비 중에 담관을 손상시키지 않고 마우스 신생아에서 간외 담관 (EBD)을 분리하는 것입니다. 담관 세포 세포주와 비교하여 예외적으로 가까운 준비 및 전체 간외 담관 시스템 (EBDS)의 수확으로 인해 설명 된 접근법은 담도 폐쇄증과 같은 신생아 담관 장애의 동물 모델을 연구하는 데 매우 유용합니다. 안락사 후 복강에 접근하고 담관 시스템, 십이지장 및 간을 독특한 En-bloc-Reclause (EbR)로 추출했습니다. 추출된 샘플을 폼 매트 위에 놓고 EBD를 오염된 세포에서 해부하여 필요한 접촉 없이 외상으로 제거합니다. 전체 EBDS의 해부는이 방법의 중요한 이점입니다. 담관 조직의 크기와 양이 작기 때문에주의를 기울여야합니다. 설명 된 기술을 사용하면 담관 세포에 손상이 없습니다. 또한, 기술의 순도는 재현 가능하다 (n = 10). 따라서 최적으로 비교 가능한 샘플을 수확 할 수 있습니다. 또한 담관 조직에는 담즙 조직이 손상되지 않는데, 이는 준비 중에 담관 시스템과의 접촉을 피할 수 있기 때문에 담낭 내부에 담액이 남습니다. 가장 중요한 것은 최종 담낭 및 담관 박리를 수행하는 동안 외상성 미세 도구를 압박하지 않고 담관의 약간 측면에서만 사용했습니다. 이것은 깨끗하고 손상되지 않은 샘플의 핵심이며 추가 조직 학적 조사 또는 담관 세포의 분리에 필수적입니다. 요약하자면, 설명된 혁신적인 해부 기술을 통해 필요한 장비를 갖춘 특히 경험이 없는 작업자가 EBDS를 가능한 한 깨끗하게 격리할 수 있습니다.

도 1A 는 뮤린 신생아의 EBDS를 보여주며, 이는 기술된 기술로 해부되었다. 현미경으로 볼 때 더 이상 간 조직이 보이지 않습니다. 간 조직은 프로토콜의 최종 분리 단계에서 제거되었으며 색상 및 일관성과 관련하여 담관 조직과 쉽게 구별 될 수 있습니다. 그림 1B 는 밀리미터 스케일과 비교하여 분리된 샘플을 보여줍니다. EBD의 길이(담낭에서 십이지장 ...

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Extrahepatic Bile Duct and Gall Bladder Dissection in Nine-Day-Old Mouse Neonates

쥐 신생아 담관 장애를 관찰하려면 손상되지 않은 담관과 효율적인 준비가 필요합니다. 따라서 쥐 신생아에서 전체 간외 담관 시스템을 분리하기위한 새로운 접근법이 담관의 완전성을 유지하면서 성공적으로 개발되었습니다.

9 일 된 마우스 신생아의 간외 담관 및 담낭 박리

The dissection of murine neonatal bile ducts has been described as difficult. The main aim of the described standard operating procedure is the isolation ...

간외 담즙 시스템을 평가하는 많은 보고서에서 샘플을 얻었지만 어떻게 얻었는지는 보고하지 않아 비교 가능성에 대한 문제가 제기되었습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 전체 간외 담즙 시스템을 해부 할 수 있고 오염 세포를 무 외상으로 제거 할 수 있다는 것입니다. 우리의 해부 프로토콜은 일반적으로 간외 담도 시스템의 해부를 목표로하는 쥐 신생아 담관 장애에 대한 실험적 접근법에 적용될 수 있습니다.예를 들어, 십이지장에 부착 된 위를 떠나는 것과 같은 프로토콜의 일부 기능은 위장에 의해 표현 된 부분적으로 소화 된 우유에 의한 올바른 방향을 허용하는 십이지장 폐쇄증 연구에 유용 할 수 있습니다. 처음에는 기술이 훈련에 약간의 시간이 필요할 수 있습니다. 단계별 접근 방식을 연습하고 따르면 속도와 결과가 향상됩니다.시작하려면 소독 및 고압 멸균 된기구를 작업 테이블 옆의 멸균 표면에 놓습니다. 복막을 자른 후 왼쪽 정면 겨드랑이 선을 따라 참수 위치로 절단을 확장하십시오. 외상성 집게로 왼쪽에서 오른쪽으로 피부를 제거하십시오.현미경으로 비장을 둘러싼 복막을 잡으십시오. 복막이 텐트와 같은 구조와 비슷할 때까지 부드럽게 들어 올리고 중앙에 1 밀리미터의 구멍을 자릅니다. 복막 텐트가 공기로 채워질 때까지 기다리십시오.아래쪽 갈비뼈, 양쪽 측면 복부 및 아래쪽 방광 영역으로 둘러싸인 창에서 복막을 잘라냅니다. 간, 담관 시스템, 위, 소장 및 결장에 대한 완전한 접근을 보장합니다. 두개골 복부 위치에서 xiphoid 과정을 조심스럽게 당겨 담낭과 담관을 검사하십시오.담관 시스템에서 담낭이 찢어 질 수있는 falciform 인대의 찢어짐을 피하십시오. 그런 다음 검상돌기의 당김을 해제합니다. 십이지장을 부드럽게 아래로 당겨 담관 시스템을 자유롭게합니다.그런 다음 담관 시스템을 십이지장에 연결하는 십이지장 유두를 식별하여 하부 En-bloc 동원을 수행하십시오. 유두의 오른쪽 측면으로 약 2 센티미터의 십이지장을 자릅니다. 그런 다음 유문 부위를 자릅니다.위의 내용물이 절단 위치와 십이지장 유두 사이의 유문 영역에 있는지 확인하십시오. 상부 En-bloc 동원을 수행하려면 검상돌기를 부드럽게 당기고 팔시 폼 인대에 접근하십시오. 담낭 사이의 falciform 인대를 통해 1 센티미터 절단하고 xiphoid 과정에 가깝게 만듭니다.식도, 하대 정맥, 흉부 대동맥 및 간의 맨 부분을 둘러싸고있는 모든 인대와 같은 간과 흉부 사이의 연결 구조를 잘라냅니다. 또한 등쪽에 남아있는 모든 조직 연결을 절단하십시오. 현미경 배율의 20배에서 En-bloc 샘플을 폼 패드에 놓습니다.샘플을 올바른 해부학 적 위치로 재구성하여 조립하십시오. 부드러운 움직임을 사용하여 십이지장의 구강 및 구강 부분을 평평하게하십시오. 외상성 집게를 사용하여 십이지장 유두에서 평평한 움직임을 시작하고 절삭 날로 계속하십시오.그런 다음 십이지장의 구강 부분에서 위의 흰색 펄프 내용물을 부드럽게하십시오. 가능한 담관 회전을 배제하기 위해 십이지장의 구강 및 구강 부분을 식별하십시오. 담관을 해부하기 전에 간 조직의 큰 잔해를 잘라냅니다.몇 번의 스크래핑 동작 후 샘플을 폼 매트의 더 깨끗한 위치로 옮깁니다. 백그라운드에서 덜 압착된 간 조직을 사용하여 EBDS와 원치 않는 세포 간의 구별을 위한 보기를 최적화합니다. 격리 된 EBDS가 남아있을 때까지 간십이지장 인대를 처리하십시오.십이지장 유두에서 약 3-5mm 떨어진 흰색의 매우 섬세한 필라멘트로 발생하는 간동맥과 문맥을 관찰하십시오. 조심스럽게 왼쪽 측면을 부드럽게 당겨이 섬세한 필라멘트를 제거하십시오. 긁는 움직임이 담관 시스템에서 시작하여 간 경계로 이어지는지 확인하십시오.이 프로토콜을 사용하여 EBDS는 9 일 된 쥐 신생아에서 해부되었습니다. 담낭에서 십이지장 유두까지 분리 된 EBDS의 길이는 10 밀리미터 미만이었고, 섬세한 덕트 콜레 도쿠스의 직경은 0.05에서 0.2 밀리미터까지 다양했다. 헤마톡실린 에오신 염색은 개방 내강으로 EBDS의 종방향 단면에서 수행하였다.담관 세포는 단층으로 내강을 둘러싸고 확인되었으며 더 어둡게 염색되었습니다. 연구원은 해부 및 주사 프로토콜과 같은 운영 기술을 공유하고 표준화하여 연구 및 결과의 비교 가능성과 신속한 유용성을 개선해야 합니다. 선행 해부는 세포 배양 오염의 감소를 초래하기 때문에 담관내 및 담관외 세포의 분리와 같은 조직학적 및 단일세포 접근법에 유리할 것이다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Mouse Bladder Wall Injection

마우스 블레더 월 주입

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. ...

연구

의학

Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct

와튼의 덕트를 통해 마우스 턱밑 침샘의 Cannulation

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

3 차원 수지 주조 및 마우스 포털 정맥 또는 Intrahepatic의 담즙 덕트 시스템의 이미징

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Urinary Bladder Distention Evoked Visceromotor Responses as a Model for Bladder Pain in Mice

쥐의 방광 통증 모델로 방광 팽창 유발 내장 운동 응답

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition ...

State of the Art Cranial Ultrasound Imaging in Neonates

신생아의 예술 두개골 초음파 이미징의 주

Cranial ultrasound (CUS) is a reputable tool for brain imaging in critically ill neonates. It is safe, relatively cheap and easy to use, even when a ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

마우스의 담관 결찰 : 폐쇄성 담즙에 의한 염증성 간 손상과 섬유화의 유도

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

내분비 및 외분비 리 프로그래밍과 대량 살상 무기 확산 모델로 췌관의 결찰을 통해 마우스 췌장 외과 부상

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

Transcutaneous Microcirculatory Imaging in Preterm Neonates

조산 신생아 경피 미세 영상

Microcirculatory imaging (MI) is a relatively new research tool mainly used in the intensive care setting. MI provides a clear view of the smallest ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

격리 및 프로파일 링 마이크로 RNA-포함하는 인간의 담즙에서 엑소 좀을

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...