Name: extrahepatic bile duct and gall bladder dissection in nine-day-old mouse neonates
Uploaded: 2022-08-23T15:00:00
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Os autores reconhecem Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dra. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dra. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl e Magdalena Trochimiuk por suas contribuições. Hans Christian Schmidt foi apoiado financeiramente pela Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME Scholarship (2021_EKPK.10), UKE, Hamburgo.

Após a aprovação ética (N045/2021), foram observados neonatos de camundongos C57BL/6 machos e fêmeas até os 9 dias de idade. Os animais nasceram e foram fornecidos para fins experimentais pela instalação animal do Centro Médico Universitário de Hamburgo-Eppendorf, Hamburgo, Alemanha. Os neonatos foram alojados em uma gaiola junto com seus animais pais. As condições ambientais foram controladas em temperatura (20-24 °C), ciclo claro-escuro de 12:12 h e umidade relativa do ar de 40%-70%.
<p class="jove_tit...

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Este artigo relatou e discutiu a criação e validação de uma nova abordagem cirúrgica para a remoção da EBDS de camundongos neonatais eutanasiados. Os achados microscópicos e histológicos revelam que a abordagem detecta rapidamente as EBDs e as disseca perto das margens do ducto, mesmo em camundongos neonatais. Apenas instrumentos cirúrgicos e um microscópio com ampliação de 20x são necessários para o protocolo descrito. Além disso, a abordagem permite o isolamento de toda a EBDS. A técnica é altamente e...

A gênese e a progressão de colangiopatias como atresia biliar, colangite esclerosante primária (colangite esclerosante) e colangite biliar primária (CBP) são desconhecidas ou incompletas 1,2. A compreensão limitada da origem e progressão dessas doenças leva a uma escassez de opções terapêuticas3. O obstáculo mais difícil no estudo dos distúrbios do ducto biliar neonatal é obter uma compreensão molecular da fisiopatologia. Uma das chaves essenciais para uma melhor compreensão da patologia molecular é a melhor observação possível do tecido afetado. Para evitar a redução da comparabilidade e discrepâncias entre as pesquisas, como a observação da potencial etiologia viral da atresia biliar4, surge a necessidade do melhor preparo possível e do compartilhamento das técnicas de dissecção realizadas. Uma preparação pura do tecido alvo é necessária para investigações microscópicas posteriores ou culturas organoides de células e 3D reprodutoras. No entanto, em distúrbios neonatais murinos, as amostras de tecido são raras e só ocorrem em pequena quantidade devido ao tamanho muito pequeno. Em relação aos distúrbios do ducto biliar, dificuldades no preparo limpo dos ductos biliares em neonatos murinos têm sido descritas5. Devido ao estágio neonatal de desenvolvimento, a diferenciação tecidual não é excessivamente avançada, o que complica o preparo e aumenta a dificuldade em comparação com o preparo de amostras adultas. Portanto, o grupo de trabalho operacional investigou uma nova estratégia para preparar a EBDS em um modelo de camundongo neonatal. No presente estudo, a técnica permite uma dissecção eficiente de cada amostra.
O sistema de ducto biliar é colocado intraperitonealmente no abdômen superior direito, surgindo do fígado. A vesícula biliar está localizada abaixo da superfície visceral do lobo direito do fígado. O ducto biliar, juntamente com a veia porta e a artéria hepática, está incorporado no ligamento hepatoduodenal. Ele une o fígado e o duodeno diretamente e drena o líquido biliar para o duodeno6. Anatomicamente, o ducto biliar é dividido nos ductos hepáticos direito e esquerdo, no ducto hepático comum, no ducto cístico e no ducto colédoco, que é formado pela confluência do ducto cístico e do ducto hepático comum7. Este eventualmente esvazia o líquido biliar e a saliva do ducto pancreático para o duodeno através da Ampola de Vater.
Os colangiócitos revestem o ducto biliar intra e extra-hepaticamente, habitando-se em um complicado nicho anatômico onde auxiliam na produção biliar e na homeostase8. O fluido biliar passa essas células epiteliais especializadas em altas concentrações diariamente. Em particular, a manutenção do guarda-chuva HCO3- é muito importante para a proteção contra a toxicidade dos ácidos biliares9. Os colangiócitos são a primeira linha de defesa no sistema hepatobiliar contra, por exemplo, microrganismos luminais10. A eficácia de defesa dos colangiócitos contra agressões tóxicas pode ser enfraquecida pela predisposição genética. Uma sobrecarga tóxica causa danos e destruição e, portanto, pode levar a colangiopatias. Além disso, o ducto biliar em desenvolvimento não é completamente capaz de todos os mecanismos de autoproteção, levando a uma maior suscetibilidade a toxinas ambientais nos ductos biliares neonatais11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>CHEMSOLUTE</td>
			<td>11365000</td>
			<td>used as a dehydrating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G canula</td>
			<td>B Braun/Sterican, Melsungen Germany</td>
			<td>4656300</td>
			<td>canula for hydration of the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air vent</td>
			<td>C + P M&#246;belsysteme GmbH &#38; Co. KG, Breidenbach, Germany</td>
			<td>Tec-Ononmic AZ 1200</td>
			<td>the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua ad injectabilia Braun</td>
			<td>B Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>2351744</td>
			<td>saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bigger microsurgical Forceps</td>
			<td>DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland</td>
			<td>FD253R</td>
			<td>straight, 180 mm (7&#34;), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera &#8220;SmartCAM 5&#8221;&#160;</td>
			<td>Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom</td>
			<td>EVC131A</td>
			<td>optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2&#34;; Used for videoproduction and technical evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany</td>
			<td>12612613</td>
			<td>used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration sponge&#160;</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>TT56.1</td>
			<td>sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of&#160; two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Phosphat Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Doesn&#180;t contain Calzium or Magnesium, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassettes</td>
			<td>Engelbrecht GmbH, Ederm&#252;nde, Germany</td>
			<td>17990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>41-6660-00</td>
			<td>staining solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors CeramaCut</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>14959-09</td>
			<td>Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>41-5130-00</td>
			<td>staining solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highresolotion microscope</td>
			<td>Vision Engineering, Send United Kingdom</td>
			<td>EVO503&#160;</td>
			<td>Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany</td>
			<td>BX60F5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glases</td>
			<td>Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>101244</td>
			<td>60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany</td>
			<td>03-0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica, Nu&#223;loch, Germany</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td>Tool for sectioning (2 &#181;m-slices)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix-F 1 mL syringe</td>
			<td>B Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>syringe without canula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sakura Finetec, Torrance, USA</td>
			<td>4511</td>
			<td>Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding machine</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>TES 99</td>
			<td>The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Morphisto</td>
			<td>1176201000</td>
			<td>Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Microsurgical Forceps&#160;</td>
			<td>EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), B&#252;tthard, Bayern, Germany</td>
			<td>(00)165</td>
			<td>Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Ruler</td>
			<td>Agntho&#39;s AB, Liding&#246;, Sweden</td>
			<td>30085-15</td>
			<td>150mm With Metric &#38; Inch Graduations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors &#8211; Sharp-blunt for decapitation</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>14001-14</td>
			<td>Device for decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warming cabinet</td>
			<td>Haraeus, Hanau, Germany</td>
			<td>T 6060</td>
			<td>the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extrahepatic bile duct and gall bladder dissection in nine-day-old mouse neonates

A dissecção dos ductos biliares neonatais murinos tem sido descrita como difícil. O principal objetivo do procedimento cirúrgico padrão descrito é o isolamento do ducto biliar extra-hepático (EBD) em neonatos de camundongos sem danificar o ducto biliar durante a preparação. Devido à sua preparação excepcionalmente próxima em comparação com a linhagem celular de colangiócitos e a colheita de todo o sistema de ducto biliar extra-hepático (EBDS), a abordagem descrita é extremamente útil na pesquisa de modelos animais de distúrbios do ducto biliar recém-nascido, como a atresia biliar. Após a eutanásia, a cavidade peritoneal foi acessada e o sistema de ductos biliares, duodeno e fígado foram extraídos com a única ressecção em bloco (EbR). A amostra extraída é colocada em um tapete de espuma, e a EBD é dissecada de células contaminantes atraumaticamente sem o toque necessário. A dissecação de toda a EBDS é uma vantagem significativa deste método. Deve-se ter cuidado devido ao pequeno tamanho e quantidade de tecido do ducto biliar. Usando a técnica descrita, não há danos aos colangiócitos. Além disso, a pureza da técnica é reprodutível (n = 10). Portanto, amostras comparáveis de forma ideal podem ser colhidas. Além disso, nenhum tecido do ducto biliar é prejudicado, porque qualquer contato com o sistema do ducto biliar pode ser evitado durante a preparação, deixando o fluido biliar dentro da vesícula biliar. Mais importante ainda, durante a realização da vesícula biliar final e da dissecção do ducto biliar, microinstrumentos atrauratos foram usados apenas ligeiramente laterais do ducto biliar sem apertá-lo. Esta é a chave para uma amostra limpa e intacta, e essencial para uma investigação histológica mais aprofundada ou o isolamento de colangiócitos. Para resumir, a técnica de dissecção inovadora descrita permite que operadores especialmente inexperientes com o equipamento necessário isolem a EBDS da forma mais limpa possível.

A Figura 1A mostra a EBDS de um neonato murino, que foi dissecado com a técnica descrita. Microscopicamente, nenhum outro tecido hepático é visível. O tecido hepático foi removido durante as etapas finais de isolamento do protocolo e pode ser facilmente distinguido do tecido do ducto biliar em relação à cor e consistência. A Figura 1B mostra a amostra isolada em comparação com uma escala milimétrica. O comprimento da EBD (medido da vesícula biliar ?...

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Extrahepatic Bile Duct and Gall Bladder Dissection in Nine-Day-Old Mouse Neonates

Para a observação de distúrbios do ducto biliar neonatal murino, um ducto biliar intacto e uma preparação eficiente são necessários. Portanto, uma nova abordagem para isolar todo o sistema do ducto biliar extra-hepático em neonatos murinos foi desenvolvida com sucesso, mantendo a integridade do ducto biliar.

Dissecção do ducto biliar extra-hepático e da vesícula biliar em neonatos de camundongos com nove dias de idade

The dissection of murine neonatal bile ducts has been described as difficult. The main aim of the described standard operating procedure is the isolation ...

Muitos relatórios que avaliaram o sistema biliar extra-hepático relataram que obtiveram as amostras, mas não como as obtiveram, levantando questões relativas à comparabilidade. A principal vantagem desta técnica é que todo o sistema biliar extra-hepático pode ser dissecado e as células contaminantes podem ser removidas atraumaticamente. Nosso protocolo de dissecção pode ser geralmente aplicado a abordagens experimentais que trabalham com distúrbios do ducto biliar neonatal murino, visando a dissecção do sistema biliar extra-hepático.Algumas características do protocolo, por exemplo, deixar o estômago preso ao duodeno, podem ser úteis na pesquisa da atresia duodenal para permitir a orientação correta pelo leite parcialmente digerido expresso pelo estômago. No início, a técnica pode exigir algum tempo para o treinamento. Praticar e seguir a abordagem passo-a-passo aumentará a velocidade e o resultado.Para começar, coloque os instrumentos desinfetados e autoclavados em uma superfície estéril ao lado da mesa de operação. Depois de fazer um corte no peritônio, expanda o corte para o local da decapitação, seguindo a linha axilar frontal esquerda. Remova a pele do lado esquerdo para o direito com pinça atraumática.Sob um microscópio, segure o peritônio ao redor do baço. Leve-o suavemente até que o peritônio se assemelhe a uma estrutura semelhante a uma tenda e corte um buraco de um milímetro no centro. Espere que a tenda peritoneal seja preenchida com ar.Corte o peritônio em uma janela emoldurada pelas costelas inferiores, ambas as regiões abdominais laterais e a área inferior da bexiga. Garantir o acesso total ao fígado, sistema de ductos biliares, estômago, intestino delgado e cólon. Examine a vesícula biliar e os ductos biliares puxando cuidadosamente o processo xifoide em uma posição ventral craniana.Evite rasgar o ligamento falciforme que pode levar ao rompimento da vesícula biliar do sistema do ducto biliar. Em seguida, libere a tração do processo xifoide. Puxe suavemente o duodeno para baixo para liberar o sistema de ducto biliar.Em seguida, realize a mobilização En-bloc inferior, identificando a papila duodenal, que conecta o sistema de ducto biliar ao duodeno. Corte o duodeno cerca de dois centímetros para o lado lateral direito da papila. Em seguida, corte a área pilórica.Certifique-se de que o conteúdo do estômago esteja presente na área pilórica entre o local de corte e a papila duodenal. Para realizar a mobilização En-bloc superior, puxe suavemente o processo xifoide e obtenha acesso ao ligamento falciforme. Faça um corte de um centímetro através do ligamento falciforme entre a vesícula biliar e perto do processo xifoide.Corte as estruturas de conexão entre o fígado e o tórax, como o esôfago, a veia cava inferior, a aorta torácica e todos os ligamentos que cercam a área nua do fígado. Além disso, corte todas as conexões de tecido dorsalmente remanescentes. Sob ampliação microscópica de 20 vezes, coloque a amostra En-bloc em uma almofada de espuma.Monte a amostra reorganizando-a na posição anatômica correta. Usando movimentos suaves, achate a parte oral e aboral do duodeno. Usando pinça atraumática, inicie o movimento de achatamento na papila duodenal e continue até as arestas de corte.Em seguida, alise o conteúdo polpudo branco do estômago na parte oral do duodeno. Identifique a parte oral e a parte aboral do duodeno para descartar a provável rotação do ducto biliar. Corte grandes restos de tecido hepático antes de dissecar o ducto biliar.Após alguns movimentos de raspagem, transfira a amostra para uma posição mais limpa no tapete de espuma. Use o tecido hepático menos espremido no fundo para otimizar a visão para diferenciação entre EBDS e células indesejadas. Processe o ligamento hepatoduodenal até que a EBDS isolada permaneça.Observe a artéria hepática e a veia porta surgindo como filamentos brancos e muito delicados, a aproximadamente três a cinco milímetros por via oral da papila duodenal. Cuidadosamente, remova este filamento delicado usando uma puxada suave para o lado lateral esquerdo. Certifique-se de que os movimentos de raspagem começam a partir do sistema de ductos biliares e levam aos limites do fígado.Utilizando este protocolo, a EBDS foi dissecada a partir de neonatos murinos de nove dias de idade. O comprimento da EBDS isolada da vesícula biliar à papila duodenal foi inferior a 10 milímetros, e o diâmetro do delicado ducto colédoco variou de 0,05 a 0,2 milímetros. A coloração com hematoxilina eosina foi realizada no corte longitudinal da EBDS com lúmen aberto.Os colangiócitos foram identificados ao redor do lúmen como uma monocamada e foram tingidos mais escuros. Os pesquisadores devem compartilhar e padronizar técnicas operacionais, como dissecção e protocolos de injeção, para melhorar a comparabilidade e a rápida usabilidade de seus estudos e resultados. A dissecção prévia será vantajosa para abordagens histológicas e unicelulares, como o isolamento de intra e extrapericolangiócitos, pois resulta na redução da contaminação por cultura celular.

Research

JoVE Journal

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