Name: extrahepatic bile duct and gall bladder dissection in nine-day-old mouse neonates
Uploaded: 2022-08-23T15:00:00
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Los autores reconocen a Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl y Magdalena Trochimiuk por sus contribuciones. Hans Christian Schmidt recibió apoyo financiero de la beca Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME (2021_EKPK.10), UKE, Hamburgo.

Tras la aprobación ética (N045/2021), se observaron neonatos machos y hembras de ratones C57BL/6 hasta los 9 días de edad. Los animales nacieron y fueron proporcionados con fines experimentales por la instalación de animales del Centro Médico Universitario de Hamburgo-Eppendorf, Hamburgo, Alemania. Los neonatos fueron alojados en una jaula junto con sus animales parentales. Las condiciones ambientales se controlaron en temperatura (20-24 °C), ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h y humedad relativa de 40%-70%.
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Este artículo informó y discutió la creación y validación de un nuevo enfoque quirúrgico para eliminar el EBDS de ratones neonatales sacrificados. Los hallazgos microscópicos e histológicos revelan que el enfoque detecta rápidamente las EBD y las disecciona cerca de los márgenes del conducto, incluso en ratones neonatos. Solo se requieren instrumentos quirúrgicos y un microscopio con un aumento de 20x para el protocolo descrito. Además, el enfoque permite el aislamiento de todo el EBDS. La técnica es altamen...

La génesis y progresión de colangiopatías como la atresia biliar, la colangitis esclerosante primaria (CEP) y la colangitis biliar primaria (CBP) son desconocidas o incompletas 1,2. La comprensión limitada del origen y la progresión de esas enfermedades conduce a una escasez de opciones terapéuticas3. El obstáculo más difícil en el estudio de los trastornos neonatales del conducto biliar es obtener una comprensión molecular de la fisiopatología. Una de las claves esenciales para una mejor comprensión de la patología molecular es la mejor observación posible del tejido afectado. Para evitar la reducción de la comparabilidad y las discrepancias entre las investigaciones, como la observación de la posible etiología viral de la atresia biliar4, surge la necesidad de la mejor preparación posible y el intercambio de las técnicas de disección realizadas. Una preparación pura del tejido diana es necesaria para investigaciones microscópicas posteriores o cultivos de células de reproducción y organoides 3D. Sin embargo, en los trastornos neonatales murinos, las muestras de tejido son raras y solo ocurren en una pequeña cantidad debido al tamaño muy pequeño. En cuanto a los trastornos de las vías biliares, se han descrito dificultades en una preparación limpia de las vías biliares en neonatos murinos5. Debido a la etapa neonatal de desarrollo, la diferenciación tisular no está demasiado avanzada, lo que complica la preparación y aumenta la dificultad en comparación con la preparación de muestras adultas. Por lo tanto, el grupo de trabajo operativo investigó una estrategia novedosa para preparar el EBDS en un modelo de ratón neonatal. En el presente estudio, la técnica permite una disección eficiente de cada muestra.
El sistema de conductos biliares se coloca por vía intraperitoneal en la parte superior derecha del abdomen, que surge del hígado. La vesícula biliar se encuentra debajo de la superficie visceral del lóbulo derecho del hígado. El conducto biliar, junto con la vena porta y la arteria hepática, está incrustado en el ligamento hepatoduodenal. Se une al hígado y al duodeno directamente y drena el líquido biliar en el duodeno6. Anatómicamente, el conducto biliar se divide en los conductos hepáticos derecho e izquierdo, el conducto hepático común, el conducto cístico y el conducto colédoco, que está formado por la confluencia del conducto cístico y el conducto hepático común7. Este eventualmente vacía el líquido biliar y la saliva del conducto pancreático hacia el duodeno a través de la ampolla de Vater.
Los colangiocitos recubren el conducto biliar intra y extrahepáticamente, habitando en un nicho anatómico complicado donde ayudan en la producción de bilis y la homeostasis8. El líquido biliar pasa estas células epiteliales especializadas en altas concentraciones diariamente. En particular, el mantenimiento del paraguas HCO3- es muy importante para proteger contra la toxicidad de los ácidos biliares9. Los colangiocitos son la primera línea de defensa en el sistema hepatobiliar contra, por ejemplo, microorganismos luminales10. La eficacia de defensa de los colangiocitos contra las agresiones tóxicas puede verse debilitada por la predisposición genética. Una sobrecarga tóxica causa daño y destrucción y, por lo tanto, puede conducir a colangiopatías. Además, el conducto biliar en desarrollo no es completamente capaz de todos los mecanismos de autoprotección, lo que lleva a una mayor susceptibilidad a las toxinas ambientales en los conductos biliares neonatales11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>CHEMSOLUTE</td>
			<td>11365000</td>
			<td>used as a dehydrating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G canula</td>
			<td>B Braun/Sterican, Melsungen Germany</td>
			<td>4656300</td>
			<td>canula for hydration of the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air vent</td>
			<td>C + P M&#246;belsysteme GmbH &#38; Co. KG, Breidenbach, Germany</td>
			<td>Tec-Ononmic AZ 1200</td>
			<td>the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua ad injectabilia Braun</td>
			<td>B Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>2351744</td>
			<td>saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bigger microsurgical Forceps</td>
			<td>DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland</td>
			<td>FD253R</td>
			<td>straight, 180 mm (7&#34;), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera &#8220;SmartCAM 5&#8221;&#160;</td>
			<td>Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom</td>
			<td>EVC131A</td>
			<td>optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2&#34;; Used for videoproduction and technical evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany</td>
			<td>12612613</td>
			<td>used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration sponge&#160;</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>TT56.1</td>
			<td>sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of&#160; two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Phosphat Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Doesn&#180;t contain Calzium or Magnesium, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassettes</td>
			<td>Engelbrecht GmbH, Ederm&#252;nde, Germany</td>
			<td>17990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>41-6660-00</td>
			<td>staining solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors CeramaCut</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>14959-09</td>
			<td>Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>41-5130-00</td>
			<td>staining solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highresolotion microscope</td>
			<td>Vision Engineering, Send United Kingdom</td>
			<td>EVO503&#160;</td>
			<td>Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany</td>
			<td>BX60F5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glases</td>
			<td>Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>101244</td>
			<td>60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany</td>
			<td>03-0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica, Nu&#223;loch, Germany</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td>Tool for sectioning (2 &#181;m-slices)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix-F 1 mL syringe</td>
			<td>B Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>syringe without canula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sakura Finetec, Torrance, USA</td>
			<td>4511</td>
			<td>Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding machine</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>TES 99</td>
			<td>The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Morphisto</td>
			<td>1176201000</td>
			<td>Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Microsurgical Forceps&#160;</td>
			<td>EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), B&#252;tthard, Bayern, Germany</td>
			<td>(00)165</td>
			<td>Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Ruler</td>
			<td>Agntho&#39;s AB, Liding&#246;, Sweden</td>
			<td>30085-15</td>
			<td>150mm With Metric &#38; Inch Graduations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors &#8211; Sharp-blunt for decapitation</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>14001-14</td>
			<td>Device for decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warming cabinet</td>
			<td>Haraeus, Hanau, Germany</td>
			<td>T 6060</td>
			<td>the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extrahepatic bile duct and gall bladder dissection in nine-day-old mouse neonates

La disección de los conductos biliares neonatales murinos se ha descrito como difícil. El objetivo principal del procedimiento operativo estándar descrito es el aislamiento del conducto biliar extrahepático (EBD) en neonatos de ratón sin dañar el conducto biliar durante la preparación. Debido a su preparación excepcionalmente cercana en comparación con la línea celular de colangocitos y la recolección de todo el sistema de conductos biliares extrahepáticos (EBDS), el enfoque descrito es extremadamente útil en la investigación de modelos animales de trastornos del conducto biliar en recién nacidos, como la atresia biliar. Después de la eutanasia, se accedió a la cavidad peritoneal y se extrajeron el sistema de conductos biliares, el duodeno y el hígado con la única resección en bloque (EbR). La muestra extraída se coloca en una estera de espuma, y el EBD se disecciona de las células contaminantes de forma atraumática sin el contacto necesario. La disección de todo el EBDS es una ventaja significativa de este método. Se debe tener precaución debido al pequeño tamaño y cantidad de tejido del conducto biliar. Usando la técnica descrita, no hay daño a los colangiocitos. Además, la pureza de la técnica es reproducible (n = 10). Por lo tanto, se pueden recolectar muestras óptimamente comparables. Además, no se daña el tejido del conducto biliar, ya que se puede evitar cualquier contacto con el sistema de conductos biliares durante la preparación, dejando el líquido biliar dentro de la vesícula biliar. Lo más importante es que, mientras se realizaba la disección final de la vesícula biliar y el conducto biliar, se utilizaron microinstrumentos atraumáticos solo ligeramente laterales del conducto biliar sin apretarlo. Esta es la clave para una muestra limpia e intacta, y esencial para una mayor investigación histológica o el aislamiento de colangiocitos. En resumen, la innovadora técnica de disección descrita permite a los operadores especialmente inexpertos con el equipo necesario aislar el EBDS de la manera más limpia posible.

La Figura 1A muestra el EBDS de un neonato murino, que fue diseccionado con la técnica descrita. Microscópicamente, no hay más tejido hepático visible. El tejido hepático se ha eliminado durante los pasos finales de aislamiento del protocolo y podría distinguirse fácilmente del tejido del conducto biliar en cuanto a color y consistencia. La Figura 1B muestra la muestra aislada en comparación con una escala milimétrica. La longitud de la EBD (medida desd...

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Extrahepatic Bile Duct and Gall Bladder Dissection in Nine-Day-Old Mouse Neonates

Para la observación de los trastornos murinos del conducto biliar neonatal, se requiere un conducto biliar intacto y una preparación eficiente. Por lo tanto, se desarrolló con éxito un nuevo enfoque para aislar todo el sistema de vías biliares extrahepáticas en neonatos murinos mientras se mantenía la integridad del conducto biliar.

Disección extrahepática de las vías biliares y la vesícula biliar en neonatos de ratón de nueve días de edad

The dissection of murine neonatal bile ducts has been described as difficult. The main aim of the described standard operating procedure is the isolation ...

Muchos informes que evalúan el sistema biliar extrahepático informaron que obtuvieron las muestras, pero no cómo las obtuvieron, lo que plantea problemas con respecto a la comparabilidad. La principal ventaja de esta técnica es que todo el sistema biliar extrahepático se puede diseccionar y las células contaminantes se pueden eliminar de forma atraumática. Nuestro protocolo de disección se puede aplicar generalmente a enfoques experimentales que trabajan en trastornos murinos del conducto biliar neonatal, con el objetivo de la disección del sistema biliar extrahepático.Algunas características del protocolo, por ejemplo, dejar el estómago unido al duodeno, podrían ser útiles en la investigación de la atresia duodenal para permitir la orientación correcta de la leche parcialmente digerida extraída por el estómago. Al principio, la técnica puede requerir algún tiempo para el entrenamiento. Practicar y seguir el enfoque paso a paso aumentará la velocidad y el resultado.Para comenzar, coloque los instrumentos desinfectados y esterilizados en autoclave sobre una superficie estéril junto a la mesa de operaciones. Después de hacer un corte en el peritoneo, expanda el corte hasta la ubicación de la decapitación, siguiendo la línea axilar frontal izquierda. Retire la piel del lado izquierdo al derecho con fórceps atraumáticos.Bajo un microscopio, sostenga el peritoneo que rodea el bazo. Levántelo suavemente hasta que el peritoneo se asemeje a una estructura similar a una tienda de campaña, y corte un agujero de un milímetro en el centro. Espere a que la tienda peritoneal se llene de aire.Corte el peritoneo en una ventana enmarcada por las costillas inferiores, ambas regiones abdominales laterales y el área inferior de la vejiga. Asegure el acceso completo al hígado, al sistema de conductos biliares, al estómago, al intestino delgado y al colon. Examine la vesícula biliar y los conductos biliares tirando cuidadosamente del proceso xifoide en una posición ventral craneal.Evite el desgarro del ligamento falciforme que puede conducir al desgarro de la vesícula biliar del sistema de conductos biliares. Luego, libere el tirón del proceso xifoide. Tire suavemente hacia abajo del duodeno para liberar el sistema de conductos biliares.Luego, realice la movilización en bloque inferior identificando la papila duodenal, que conecta el sistema de conductos biliares con el duodeno. Corte a través del duodeno unos dos centímetros hacia el lado lateral derecho de la papila. Luego, corte a través del área pilórica.Asegúrese de que el contenido del estómago esté presente en el área pilórica entre el lugar de corte y la papila duodenal. Para realizar la movilización en bloque superior, tire suavemente del proceso xifoide y obtenga acceso al ligamento falciforme. Haga un corte de un centímetro a través del ligamento falciforme entre la vesícula biliar y cerca del proceso xifoideo.Corte a través de las estructuras de conexión entre el hígado y el tórax, como el esófago, la vena cava inferior, la aorta torácica y todos los ligamentos que rodean el área desnuda del hígado. Además, corte todas las conexiones de tejido dorsalmente restantes. Con un aumento microscópico inferior a 20 veces, coloque la muestra en bloque en una almohadilla de espuma.Ensamblar la muestra reorganizándola en la posición anatómica correcta. Usando un movimiento suave, aplanar la parte oral y aboral del duodeno. Usando fórceps atraumáticos, comience el movimiento de aplanamiento en la papila duodenal y continúe hasta los bordes cortantes.Luego, alise el contenido pulposo blanco del estómago en la parte oral del duodeno. Identificar la parte oral y aboral del duodeno para descartar una probable rotación del conducto biliar. Corte los restos grandes de tejido hepático antes de diseccionar el conducto biliar.Después de algunos movimientos de raspado, transfiera la muestra a una posición más limpia en la estera de espuma. Utilice el tejido hepático menos comprimido en segundo plano para optimizar la vista para la diferenciación entre EBDS y células no deseadas. Procesar el ligamento hepatoduodenal hasta que quede el EBDS aislado.Observe la arteria hepática y la vena porta que surgen como filamento blanco y muy delicado, aproximadamente de tres a cinco milímetros por vía oral fuera de la papila duodenal. Con cuidado, retire este delicado filamento con un suave tirón hacia el lado lateral izquierdo. Asegúrese de que los movimientos de raspado comiencen desde el sistema de conductos biliares y conduzcan a los límites del hígado.Usando este protocolo, EBDS se diseccionó de neonatos murinos de nueve días de edad. La longitud del EBDS aislado desde la vesícula biliar hasta la papila duodenal fue inferior a 10 milímetros, y el diámetro del delicado conducto colédoco varió de 0,05 a 0,2 milímetros. La tinción con hematoxilina eosina se realizó en la sección longitudinal de la EBDS con una luz abierta.Los colangiocitos se identificaron alrededor de la luz como una monocapa y se tiñeron más oscuros. Los investigadores deben compartir y estandarizar técnicas operativas como los protocolos de disección e inyección para mejorar la comparabilidad y la rápida usabilidad de sus estudios y resultados. La disección anterior será ventajosa para los enfoques histológicos y unicelulares, como el aislamiento de intra y extraperi-colangiocitos, ya que resulta en la reducción de la contaminación del cultivo celular.

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