Name: extrahepatic bile duct and gall bladder dissection in nine-day-old mouse neonates
Uploaded: 2022-08-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extrahepatic Bile Duct and Gall Bladder Dissection in Nine-Day-Old Mouse Neonates at JoVE.com

Yazarlar Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl ve Magdalena Trochimiuk'a katkılarından dolayı teşekkür eder. Hans Christian Schmidt, Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME Bursu (2021_EKPK.10), UKE, Hamburg tarafından finansal olarak desteklenmiştir.

Etik onayı takiben (N045/2021), erkek ve dişi C57BL/6 fare yenidoğanları 9 günlük olana kadar gözlendi. Hayvanlar, Hamburg, Almanya'daki Hamburg-Eppendorf Üniversitesi Tıp Merkezi'nin hayvan tesisi tarafından deneysel amaçlar için doğdu ve sağlandı. Yenidoğanlar, ebeveyn hayvanlarıyla birlikte bir kafese yerleştirildi. Çevre koşulları sıcaklık (20-24 °C), 12:12 saat açık-karanlık döngüsü ve %40-%70 bağıl nem oranlarında kontrol edildi.
1. Deneysel hazırl...

<ol>
	<li>Liwinski, T., Schramm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prim&#228;r+sklerosierende+Cholangitis.">Prim&#228;r sklerosierende Cholangitis.</a> Der Internist. 59 (6), 551-559 (2018).</li><li>Kobayashi, H., Stringer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+atresia.">Biliary atresia.</a> Seminars in Neonatology. 8 (5), 383-391 (2003).</li><li>Patman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+tract:+Newly+identified+biliatresone+causes+biliary+atresia.">Biliary tract: Newly identified biliatresone causes biliary atresia.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 12 (7), 369 (2015).</li><li>Mack, C. L., Sokol, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+pathogenesis+and+etiology+of+biliary+atresia.">Unraveling the pathogenesis and etiology of biliary atresia.</a> Pediatric Research. 57 (5), 87-94 (2005).</li><li>Karjoo, S., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neonatal+extrahepatic+cholangiocytes.">Isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51621 (2014).</li><li>Strazzabosco, M., Fabris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+anatomy+of+normal+bile+ducts.">Functional anatomy of normal bile ducts.</a> The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 653-660 (2008).</li><li>Nakanuma, Y., Hoso, M., Sanzen, T., Sasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructure+and+development+of+the+normal+and+pathologic+biliary+tract+in+humans,+including+blood+supply.">Microstructure and development of the normal and pathologic biliary tract in humans, including blood supply.</a> Microscopy Research and Technique. 38 (6), 552-570 (1997).</li><li>Banales, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocyte+pathobiology.">Cholangiocyte pathobiology.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (5), 269-281 (2019).</li><li>de Buy Wenniger, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cholangiocyte+glycocalyx+stabilizes+the+'biliary+HCO3-+umbrella':+an+integrated+line+of+defense+against+toxic+bile+acids.">The cholangiocyte glycocalyx stabilizes the 'biliary HCO3- umbrella': an integrated line of defense against toxic bile acids.</a> Digestive Diseases. 33 (3), 397-407 (2015).</li><li>Pinto, C., Giordano, D. M., Maroni, L., Marzioni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+inflammation+and+proinflammatory+cytokines+in+cholangiocyte+pathophysiology.">Role of inflammation and proinflammatory cytokines in cholangiocyte pathophysiology.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (4), 1270-1278 (2018).</li><li>Khandekar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+development+of+the+mouse+extrahepatic+bile+duct:+Implications+for+neonatal+susceptibility+to+biliary+injury.">Coordinated development of the mouse extrahepatic bile duct: Implications for neonatal susceptibility to biliary injury.</a> Journal of Hepatology. 72 (1), 135-145 (2020).</li><li>Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Sch&#228;fer, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-purity+myenteric+plexus+from+adult+human+and+mouse+gastrointestinal+tract.">Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract.</a> Scientific Reports. 5 (1), 9226 (2015).</li><li>Ishii, M., Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+morphologic+characterization+of+bile+duct+epithelial+cells+from+normal+rat+liver.">Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver.</a> Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).</li><li>Kumar, U., Jordan, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+biliary+epithelial+cells+from+the+biliary+tract+fraction+of+normal+rats.">Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats.</a> Liver. 6 (6), 369-378 (1986).</li><li>Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+polarized+primary+cultures+of+rat+intrahepatic+bile+duct+epithelial+cells.">Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells.</a> Laboratory Investigation. 74 (1), 303-313 (1996).</li><li>Paradis, K., Sharp, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+duct-like+structure+formation+after+isolation+of+bile+ductular+cells+from+a+murine+model.">In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 113 (6), 689-694 (1989).</li></ol>

Bu makalede, ötenazi yenidoğan farelerinin EBDS'lerinin çıkarılması için yeni bir cerrahi yaklaşımın oluşturulması ve doğrulanması bildirilmiş ve tartışılmıştır. Mikroskopik ve histolojik bulgular, yaklaşımın EBD'leri hızlı bir şekilde tespit ettiğini ve yenidoğan farelerde bile kanal kenarlarına yakın bir yerde diseke ettiğini ortaya koymaktadır. Tarif edilen protokol için sadece cerrahi aletler ve 20x büyütmeli bir mikroskop gereklidir. Ayrıca, yaklaşım tüm EBDS'nin izolasyonuna ...

Biliyer atrezi, primer sklerozan kolanjit (PSK) ve primer biliyer kolanjit (PBK) gibi kolanjiyopatilerin oluşumu ve progresyonu bilinmemekte veya tamamlanmamıştır 1,2. Bu hastalıkların kökeni ve ilerlemesinin sınırlı bir şekilde anlaşılması, tedavi seçeneklerinin azlığına yol açmaktadır3. Yenidoğan safra yolu hastalıklarının incelenmesindeki en zor engel, patofizyolojinin moleküler olarak anlaşılmasını sağlamaktır. Moleküler patolojinin daha iyi anlaşılmasının temel anahtarlarından biri, etkilenen dokunun mümkün olan en iyi şekilde gözlemlenmesidir. Biliyer atrezi4'ün potansiyel viral etiyolojisini gözlemlemek gibi araştırmalar arasındaki karşılaştırılabilirliğin ve tutarsızlıkların azalmasını önlemek için, gerçekleştirilen diseksiyon tekniklerinin mümkün olan en iyi şekilde hazırlanması ve paylaşılması ihtiyacı ortaya çıkmaktadır. Hedef dokunun saf bir şekilde hazırlanması, daha sonraki mikroskobik araştırmalar veya üreme hücresi ve 3D organoid kültürleri için gereklidir. Bununla birlikte, murin yenidoğan bozukluklarında, doku örnekleri nadirdir ve çok küçük boyut nedeniyle sadece az miktarda ortaya çıkar. Safra yolu bozuklukları ile ilgili olarak, murin yenidoğanlarda safra kanallarının temiz bir şekilde hazırlanmasındaki zorluklar tanımlanmıştır5. Gelişimin yenidoğan aşaması nedeniyle, doku farklılaşması aşırı derecede gelişmiş değildir, bu da hazırlığı zorlaştırır ve yetişkin örneklerin hazırlanmasına kıyasla zorluğu arttırır. Bu nedenle, işletme çalışma grubu, EBDS'yi yenidoğan fare modelinde hazırlamak için yeni bir strateji araştırdı. Bu çalışmada, teknik her numunenin verimli bir şekilde diseksiyonuna izin vermektedir.
Safra kanalı sistemi, karaciğerden kaynaklanan sağ üst karın bölgesine intraperitoneal olarak yerleştirilir. Safra kesesi, karaciğerin sağ lobunun viseral yüzeyinin altında bulunur. Safra kanalı, portal ven ve hepatik arter ile birlikte, hepatoduodenal ligamente gömülüdür. Karaciğer ve duodenuma doğrudan katılır ve safra sıvısını duodenum6'ya boşaltır. Anatomik olarak, safra kanalı sağ ve sol hepatik kanallara, ortak hepatik kanala, kistik kanala ve kistik kanal ile ortak hepatik kanalın7'nin birleşmesiyle oluşan Ductus choledochus'a ayrılır. Bu sonunda safra sıvısını ve tükürüğü pankreas kanalından Vater'in Ampulla'sı aracılığıyla duodenuma boşaltır.
Kolanjiyositler safra kanalını intra- ve ekstrahepatik olarak hizalar, safra üretimine ve homeostaza yardımcı oldukları karmaşık bir anatomik niş içindebulunurlar 8. Safra sıvısı bu özel epitel hücrelerini günlük olarak yüksek konsantrasyonlarda geçirir. Özellikle, HCO3- şemsiye bakımı, safra asidi toksisitesine karşı korunmak için çok önemlidir9. Kolanjiyositler, hepatobiliyer sistemde, örneğin luminal mikroorganizmalara karşı ilk savunma hattıdır10. Kolanjiyositlerin toksik saldırılara karşı savunma etkinliği genetik yatkınlık nedeniyle zayıflayabilir. Toksik bir aşırı yük hasar ve yıkıma neden olur ve bu nedenle kolanjiyopatilere yol açabilir. Ayrıca, gelişmekte olan safra kanalı tüm kendini koruyucu mekanizmalara tamamen sahip değildir ve bu da yenidoğan safra kanallarında çevresel toksinlere karşı daha yüksek bir duyarlılığa yol açar11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>CHEMSOLUTE</td>
			<td>11365000</td>
			<td>used as a dehydrating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G canula</td>
			<td>B Braun/Sterican, Melsungen Germany</td>
			<td>4656300</td>
			<td>canula for hydration of the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air vent</td>
			<td>C + P M&#246;belsysteme GmbH &#38; Co. KG, Breidenbach, Germany</td>
			<td>Tec-Ononmic AZ 1200</td>
			<td>the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua ad injectabilia Braun</td>
			<td>B Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>2351744</td>
			<td>saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bigger microsurgical Forceps</td>
			<td>DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland</td>
			<td>FD253R</td>
			<td>straight, 180 mm (7&#34;), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera &#8220;SmartCAM 5&#8221;&#160;</td>
			<td>Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom</td>
			<td>EVC131A</td>
			<td>optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2&#34;; Used for videoproduction and technical evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany</td>
			<td>12612613</td>
			<td>used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration sponge&#160;</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>TT56.1</td>
			<td>sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of&#160; two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Phosphat Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Doesn&#180;t contain Calzium or Magnesium, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassettes</td>
			<td>Engelbrecht GmbH, Ederm&#252;nde, Germany</td>
			<td>17990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>41-6660-00</td>
			<td>staining solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors CeramaCut</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>14959-09</td>
			<td>Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>41-5130-00</td>
			<td>staining solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highresolotion microscope</td>
			<td>Vision Engineering, Send United Kingdom</td>
			<td>EVO503&#160;</td>
			<td>Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany</td>
			<td>BX60F5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glases</td>
			<td>Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>101244</td>
			<td>60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany</td>
			<td>03-0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica, Nu&#223;loch, Germany</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td>Tool for sectioning (2 &#181;m-slices)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix-F 1 mL syringe</td>
			<td>B Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>syringe without canula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sakura Finetec, Torrance, USA</td>
			<td>4511</td>
			<td>Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding machine</td>
			<td>MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany</td>
			<td>TES 99</td>
			<td>The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Morphisto</td>
			<td>1176201000</td>
			<td>Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Microsurgical Forceps&#160;</td>
			<td>EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), B&#252;tthard, Bayern, Germany</td>
			<td>(00)165</td>
			<td>Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Ruler</td>
			<td>Agntho&#39;s AB, Liding&#246;, Sweden</td>
			<td>30085-15</td>
			<td>150mm With Metric &#38; Inch Graduations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors &#8211; Sharp-blunt for decapitation</td>
			<td>FST, Heidelberg Germany</td>
			<td>14001-14</td>
			<td>Device for decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warming cabinet</td>
			<td>Haraeus, Hanau, Germany</td>
			<td>T 6060</td>
			<td>the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extrahepatic bile duct and gall bladder dissection in nine-day-old mouse neonates

Murin neonatal safra kanallarının diseksiyonu zor olarak tanımlanmıştır. Tarif edilen standart çalışma prosedürünün temel amacı, fare yenidoğanlarında ekstrahepatik safra kanalının (EBD) hazırlık sırasında safra kanalına zarar vermeden izole edilmesidir. Kolanjiyositler hücre hattına kıyasla son derece yakın preparasyonu ve tüm ekstrahepatik safra kanalı sisteminin (EBDS) toplanması nedeniyle, tarif edilen yaklaşım, biliyer atrezi gibi yenidoğan safra kanalı bozukluklarının hayvan modellerinin araştırılmasında son derece yararlıdır. Ötanaziden sonra periton boşluğuna erişildi ve safra kanalı sistemi, duodenum ve karaciğer benzersiz En-bloc-Rezeksiyon (EbR) ile ekstrakte edildi. Ekstrakte edilen numune bir köpük paspas üzerine yerleştirilir ve EBD, gerekli dokunuş olmadan atravmatik olarak kirletici hücrelerden diseke edilir. EBDS'nin tamamının diseksiyonu bu yöntemin önemli bir avantajıdır. Safra kanalı dokusunun küçük boyutu ve miktarı nedeniyle dikkatli olunmalıdır. Tarif edilen tekniği kullanarak, kolanjiyositlere zarar verilmez. Ayrıca, tekniğin saflığı tekrarlanabilir (n = 10). Bu nedenle, optimum şekilde karşılaştırılabilir numuneler toplanabilir. Ayrıca, safra kanalı dokusu zarar görmez, çünkü safra kanalı sistemi ile herhangi bir temas, hazırlık sırasında önlenebilir ve safra sıvısı safra kesesi içinde bırakılır. En önemlisi, son safra kesesi ve safra kanalı diseksiyonu yapılırken, safra kanalının sadece biraz yanalında sıkılmadan atravmatik mikroaletler kullanıldı. Bu, temiz ve sağlam bir numunenin anahtarıdır ve daha fazla histolojik araştırma veya kolanjiyositlerin izolasyonu için gereklidir. Özetlemek gerekirse, açıklanan yenilikçi diseksiyon tekniği, EBDS'yi mümkün olduğunca temiz bir şekilde izole etmek için gerekli ekipmana sahip özellikle deneyimsiz operatörlere olanak tanır.

Şekil 1A , tarif edilen teknikle diseke edilen bir murin yenidoğanının EBDS'sini göstermektedir. Mikroskopik olarak, başka karaciğer dokusu görülmez. Hepatik doku, protokolün son izolasyon aşamalarında çıkarılmıştır ve renk ve kıvam açısından safra kanalı dokusundan kolayca ayırt edilebilir. Şekil 1B , milimetre ölçeğine kıyasla izole edilmiş numuneyi göstermektedir. EBD'nin uzunluğu (safra kesesinden duodenal papillaya kadar öl?...

Watch this Scientific Journal Video about Extrahepatic Bile Duct and Gall Bladder Dissection in Nine-Day-Old Mouse Neonates at JoVE.com

Extrahepatic Bile Duct and Gall Bladder Dissection in Nine-Day-Old Mouse Neonates

Murin neonatal safra kanalı bozukluklarının gözlenmesi için sağlam bir safra kanalı ve etkili bir hazırlık gereklidir. Bu nedenle, murin yenidoğanlarda tüm ekstrahepatik safra kanalı sisteminin izole edilmesi için safra kanalının bütünlüğünü korurken başarılı bir şekilde yeni bir yaklaşım geliştirilmiştir.

Dokuz Günlük Fare Yenidoğanlarında Ekstrahepatik Safra Kanalı ve Safra Kesesi Diseksiyonu

The dissection of murine neonatal bile ducts has been described as difficult. The main aim of the described standard operating procedure is the isolation ...

Ekstrahepatik biliyer sistemi değerlendiren birçok rapor, örnekleri elde ettiklerini, ancak bunları nasıl elde ettiklerini değil, karşılaştırılabilirlikle ilgili sorunları gündeme getirdiğini bildirmiştir. Bu tekniğin temel avantajı, tüm ekstrahepatik biliyer sistemin diseke edilebilmesi ve kirletici hücrelerin atravmatik olarak çıkarılabilmesidir. Diseksiyon protokolümüz genel olarak murin neonatal safra kanalı bozuklukları üzerinde çalışan ve ekstrahepatik safra yollarının diseksiyonunu amaçlayan deneysel yaklaşımlara uygulanabilir.Protokolün bazı özellikleri, örneğin, mideyi duodenuma bağlı bırakmak, mide tarafından ifade edilen kısmen sindirilmiş sütün doğru yönlendirilmesine izin vermek için duodenal atrezi araştırmalarında yararlı olabilir. Başlangıçta, teknik eğitim için biraz zaman gerektirebilir. Adım adım yaklaşımı uygulamak ve takip etmek hızı ve sonucu artıracaktır.Başlamak için, dezenfekte edilmiş ve otoklavlanmış aletleri ameliyat masasının yanındaki steril bir yüzeye yerleştirin. Peritonda bir kesim yaptıktan sonra, sol frontal aksiller çizgiyi takip ederek kesimi dekapitasyonun bulunduğu yere genişletin. Cildi atravmatik forseps ile soldan sağ tarafa doğru çıkarın.Bir mikroskop altında, dalağı çevreleyen periton tutun. Periton çadır benzeri bir yapıya benzeyene kadar yavaşça kaldırın ve merkezde bir milimetrelik bir delik açın. Peritoneal çadırın hava ile dolmasını bekleyin.Peritonu, alt kaburgalar, hem lateral karın bölgeleri hem de alt mesane bölgesi tarafından çerçevelenmiş bir pencerede kesin. Karaciğere, safra kanalı sistemine, mideye, ince bağırsaklara ve kolona tam erişim sağlayın. Safra kesesi ve safra kanallarını, ksifoid süreci kraniyal ventral pozisyonda dikkatlice çekerek inceleyin.Safra kesesinin safra kanalı sisteminden yırtılmasına yol açabilecek falsiform ligamentin yırtılmasından kaçının. Ardından, ksifoid işlemin çekişini serbest bırakın. Safra kanalı sistemini serbest bırakmak için duodenumu yavaşça aşağı çekin.Daha sonra, safra kanalı sistemini duodenuma bağlayan duodenal papillayı tanımlayarak alt En-blok mobilizasyonunu gerçekleştirin. Duodenumdan papillanın sağ yanal tarafına yaklaşık iki santimetre kesin. Ardından, pilor bölgesinden kesin.Mide içeriğinin, kesme yeri ile duodenal papilla arasındaki pilorik bölgede bulunduğundan emin olun. Üst En-blok mobilizasyonunu gerçekleştirmek için, ksifoid işlemi yavaşça çekin ve falsiform ligamente erişin. Safra kesesi arasındaki falsiform bağdan bir santimetre kesinti yapın ve ksifoid sürece yakın.Yemek borusu, inferior vena kava, torasik aort ve karaciğerin çıplak alanını çevreleyen tüm bağlar gibi karaciğer ve toraks arasındaki bağlantı yapılarını kesin. Ayrıca, dorsal olarak kalan tüm doku bağlantılarını kesin. 20 kat mikroskobik büyütmenin altında, En-bloc numunesini bir köpük ped üzerine yerleştirin.Numuneyi doğru anatomik konumda yeniden düzenleyerek birleştirin. Nazik bir hareket kullanarak, duodenumun oral ve aboral kısmını düzleştirin. Atravmatik forseps kullanarak, duodenal papillada düzleştirme hareketini başlatın ve kesici kenarlara devam edin.Daha sonra, duodenumun oral kısmındaki midenin beyaz hamurlu içeriğini yumuşatın. Olası safra kanalı rotasyonunu dışlamak için duodenumun oral ve aboral kısmını tanımlayın. Safra kanalını diseke etmeden önce büyük karaciğer dokusu kalıntılarını kesin.Birkaç kazıma hareketinden sonra, numuneyi köpük paspas üzerinde daha temiz bir konuma aktarın. EBDS ve istenmeyen hücreler arasındaki farklılaşma görünümünü optimize etmek için arka planda daha az sıkılmış karaciğer dokusunu kullanın. İzole EBDS kalana kadar hepatoduodenal ligamenti işleyin.Duodenal papilladan oral olarak yaklaşık üç ila beş milimetre uzakta beyaz ve çok hassas filament olarak ortaya çıkan hepatik arter ve portal veni gözlemleyin. Dikkatlice, sol yanal tarafa yumuşak bir çekme kullanarak bu hassas filamenti çıkarın. Kazıma hareketlerinin safra kanalı sisteminden başlayıp karaciğer sınırlarına yol açtığından emin olun.Bu protokol kullanılarak EBDS, dokuz günlük murin yenidoğanlarından diseke edildi. Safra kesesinden duodenal papillaya izole EBDS'nin uzunluğu 10 milimetreden azdı ve hassas duktus koledochusun çapı 0.05 ila 0.2 milimetre arasında değişiyordu. EBDS'nin uzunlamasına kesitine açık lümen ile hematoksilin eozin boyama yapıldı.Kolanjiyositler lümeni tek katmanlı olarak çevrelemiş ve daha koyu boyanmıştır. Araştırmacılar, çalışmalarının ve sonuçlarının karşılaştırılabilirliğini ve hızlı kullanılabilirliğini artırmak için diseksiyon ve enjeksiyon protokolleri gibi çalışma tekniklerini paylaşmalı ve standartlaştırmalıdır. Önceki diseksiyon, intra ve ekstraperi-kolanjiyositlerin izolasyonu gibi histolojik ve tek hücreli yaklaşımlar için avantajlı olacaktır, çünkü hücre kültürü kontaminasyonunun azalmasına neden olur.

Research

JoVE Journal

Medicine

Mouse Bladder Wall Injection

Fare mesane Duvar Enjeksiyon

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. ...

Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct

Wharton Kanalı üzerinden Fare Submandibular Tükürük Bezi kanülasyonu

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

3-Boyutlu Reçine Döküm ve Fare Portal Ven veya intrahepatik safra Sisteminin Görüntüleme

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Urinary Bladder Distention Evoked Visceromotor Responses as a Model for Bladder Pain in Mice

Farelerde Mesane Ağrı için bir model olarak Mesane Distansiyonunun Uyarılmış Visceromotor Cevapları

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition ...

State of the Art Cranial Ultrasound Imaging in Neonates

Yenidoğan Sanat Kranial Ultrason Görüntüleme Devlet

Cranial ultrasound (CUS) is a reputable tool for brain imaging in critically ill neonates. It is safe, relatively cheap and easy to use, even when a ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Farelerde Safra Kanalı ligasyonu: Obstrüktif Kolestaz tarafından İnflamatuar Karaciğer Hasarı ve Fibrozis indüksiyonu

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

Endokrin ve Ekzokrin yeniden programlanması ve Silahların Yayılmasını Önleme Modeli Olarak Pankreas kanalının bağlanmasını yoluyla Fare Pankreas Cerrahi Sakatlık

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

Transcutaneous Microcirculatory Imaging in Preterm Neonates

Preterm Yenidoğan Transkutanöz Mikrosirkülasyonda Görüntüleme

Microcirculatory imaging (MI) is a relatively new research tool mainly used in the intensive care setting. MI provides a clear view of the smallest ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

İzolasyon ve profil MicroRNA içeren İnsan Bile dan ekzozomlar

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...