Name: a soluble tetrazolium-based reduction assay to evaluate the effect of antibodies on candida tropicalis biofilms
Uploaded: 2022-09-16T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms at JoVE.com

这项工作得到了Ramalingaswami赠款DBT-843-BIO（印度政府生物技术部）和早期职业研究奖SER-1058-BIO（印度政府科学与工程研究委员会）的支持。作者承认ICMR-JRF向P.C.提供赠款，DBT-JRF向P.S.提供赠款。作者感谢Ravikant Ranjan博士在SEM期间对手稿和Pradeep Singh Thakur先生的手稿和技术援助提出的建议。

BALB / c小鼠被饲养在IIT Roorkee的小动物设施中。将所有动物保持在25°C的12h：12h光：暗循环中，并随意提供颗粒日粮 和水。所有动物程序均由IIT Roorkee的机构动物伦理委员会（IAEC）批准。
1.热带梭菌的制备
注意： 真菌热带念珠菌 属于风险组 2 病原体，被归类为 BSL2 微生物。在处理 念珠菌 物种时，请始终使用经过认?...

由念珠菌属引起的真菌感染与全世界的高发病率和死亡率有关。侵袭性真菌感染的威胁日益严重，因此需要及早管理这种危及生命的疾病。大多数念珠菌感染涉及生物膜的形成，生物膜粘附在各种医疗设备上，并导致医院环境中真菌感染的持续和复发31。生物膜由酵母或菌丝细胞组成，它们对大多数常规抗真菌药物表现出相当大的抗性32。念珠?...

系统性念珠菌病是院内感染的第四大原因，与全世界的高发病率和死亡率有关。在全球范围内，系统性念珠菌病影响约70万人1。念珠菌属，即白色念珠菌、热带念珠菌、副念珠菌、光滑念珠菌和耳念珠菌，是侵袭性 念珠菌感染的最常见原因2。念珠菌属是产生生物膜的机会性病原体3.生物膜主要与念珠菌毒力有关，念珠菌可以通过诱导生物膜形成来承受氧化和渗透应激条件4。生物膜进一步调节毒力因子和细胞壁成分的表达，形成外聚物保护基质，帮助念珠菌适应不同的宿主生态位4。生物膜有助于酵母粘附在宿主组织和医疗器械上5.因此，生物膜的形成与酵母的优势有关，因为生物膜内的酵母细胞可以逃避宿主免疫反应6。生物膜的形成还可以保护致病酵母免受抗真菌药物的作用5。Pierce等人已经证明了白色念珠菌生物膜对两性霉素B的敏感性降低7，8。此外，生物膜显示出对氟康唑的抗真菌药物耐药性，这损害了系统性念珠菌病的有效管理9，10。
微生物具有粘附在各种生物和非生物表面的内在倾向，从而导致生物膜的形成。 白色念珠菌是一种二态性真菌，以酵母和菌丝形式存在，其生物膜形成已在各种体外和体内模型系统中表征11。生物膜形成的步骤包括念珠菌细胞与底物的粘附、细丝化、增殖和生物膜成熟11。最初，白色念珠菌的酵母形式粘附在基质上，包括医疗器械和人体组织，然后是白色念珠菌的丝化和增殖成菌丝和假菌丝形式，最后是嵌入细胞外基质的生物膜成熟11。生物膜的形成在很大程度上有助于白色念珠菌的发病机制12。念珠菌物种形成耐药生物膜，这使得根除它们具有挑战性13。白色念珠菌生物膜产生人群的一小部分已被描述为对抗真菌药物两性霉素 B 和氯己定14 具有高度耐药性。值得注意的是，与浮游阶段和增殖阶段的酵母细胞相比，生物膜中的酵母细胞对多药治疗表现出高抗性14。有人提出，存在于生物膜中的酵母细胞对抗真菌药物具有高度耐受性，这有助于白色念珠菌在生物膜中的存活14。据报道，这些现有细胞是白色念珠菌的表型变体，而不是突变体14。此外，被称为“持久细胞”的念珠菌生物膜细胞可耐受高剂量的两性霉素-B治疗并有助于念珠菌存活，从而对高风险个体反复出现的全身性念珠菌感染构成巨大负担15。
念珠菌菌株中抗真菌耐药性的增加需要研究新的抗真菌药物和免疫疗法。从上述研究中可以明显看出，念珠菌生物膜显示出对抗真菌药物的敏感性降低。因此，需要改进免疫疗法来控制念珠菌生物膜的形成。早期的研究表明，CAGTA可以通过在体外抑制白色念珠菌生物膜的形成来提供有效的保护，以防止全身性念珠菌感染16。另一项研究报告说，用白色念珠菌rAls3-N蛋白免疫小鼠诱导高抗体滴度，干扰白色念珠菌生物膜的体外形成17。 抗Als3-N抗体也对白色念珠菌从生物膜中扩散产生抑制作用17。基于白色念珠菌的NDV-3A疫苗目前正在临床试验中，还发现抗NDV-3A血清可减少耳念珠菌生物膜的形成18。最近的一项研究发现，Sap2抗体抑制生物膜形成是系统性念珠菌病小鼠模型中的保护机制19。
本文概述了详细的 体外 方案，用于评估从不同组Sap2疫苗接种小鼠获得的多克隆血清中存在的抗原特异性抗体对预制热带 念珠菌 生物膜的影响。为了实现这一目标，在实验室中优化并开发了一种基于XTT还原测定的方法，该方法可以在存在或不存在抗体的情况下以快速，灵敏和高通量的方式测量生物膜活力。
XTT 测定用于测量细胞代谢活性，作为细胞活力、细胞增殖和细胞毒性的指标20。该比色测定基于通过代谢活性细胞将黄色四唑盐钠 3'-[1-（苯氨基羰基）-3，4-四唑]-双（4-甲氧基-6-硝基）苯磺酸水合物 （XTT） 还原为橙色甲臜染料。由于只有活细胞才能降低XTT，因此还原的XTT甲臜的量与颜色强度和细胞活力成正比。形成的甲臜染料是水溶性的，使用酶标仪直接定量。由于其水溶性，XTT测定允许研究完整的生物膜，以及检查生物膜药物敏感性，而不会破坏生物膜结构21。此外，该方法由于其易用性、速度、准确性、高通量和高重现性而用于念珠菌真菌活力评估7，22。
除了 XTT 还原测定外，还确定了用于测量生物膜数量的许多替代技术。其中一些包括使用 MTT 还原测定、结晶紫染色、DNA 定量、定量 PCR、蛋白质定量、干细胞重量测量和活菌落计数。这些程序在时间和成本要求方面差异很大。Taff 等人对七种不同的 念珠 菌生物膜定量测定进行了比较分析，发现 XTT 测定为 定量估计白色念珠菌 生物膜提供了最可重复、最准确和最有效的方法23。结晶紫等染色技术有一定的局限性;结晶紫测试通过测量结晶紫染色的生物膜基质和细胞的光密度间接确定生物膜的量。尽管结晶紫测定提供了生物膜质量的良好测量，但它不能测量生物膜活力，因为它会染色微生物细胞和细胞外基质24。Dhale等人进一步报告说，与结晶紫测定25相比，XTT还原测定是检测生物膜产生的最灵敏，可重复，准确，有效和特异性的方法。文献报告表明，XTT 测定与 CFU 计数方法中的 CFU/mL 参数密切相关。然而，与XTT测定相比，CFU方法是劳动密集型且缓慢的26。此外，分离的活细胞的比例可能不代表初始生物膜群27。尽管 XTT 还原测定似乎是量化活力的最佳选择，但该技术存在一些局限性。虽然XTT方法对于涉及一种真菌菌株的比较很有用，但在比较不同的真菌菌株和物种时，其使用可能会受到限制。在没有详细标准化的情况下，菌株间比较可能很困难，因为不同的菌株代谢具有不同能力的底物21。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>546021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>-</td>
			<td>Prepared in lab</td>
			<td>NaCl : 4 g 
			KCl : 0.1 g 
			Na2HPO4:&#160; 0.72 g 
			KH2PO4 : 0.12 g 
			Water 500 mL. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>546041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>442404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Menadione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter Plate Reader</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette and tips</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>460090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringers Lactate</td>
			<td>-</td>
			<td>Prepared in lab</td>
			<td>sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 MOPS</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>AT180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud dextrose Agar</td>
			<td>SRL</td>
			<td>24613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud dextrose Broth</td>
			<td>SRL</td>
			<td>24835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XTT&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>X6493</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a soluble tetrazolium-based reduction assay to evaluate the effect of antibodies on candida tropicalis biofilms

念珠菌 属是系统性院内感染的第四大常见原因。全身性或侵袭性念珠菌病通常涉及植入装置或导管上的生物膜形成，这与毒力和死亡率增加有关。由不同 念珠菌 物种产生的生物膜对各种抗真菌药物表现出增强的抗性。因此，有必要开发针对 念珠菌 生物膜的有效免疫疗法或辅助治疗。虽然细胞免疫在抗念珠菌 保护中的作用已得到充分证实，但体液免疫的作用研究较少。
据推测，抑制生物膜形成和成熟是保护性抗体的主要功能之一，白色念珠菌胚管抗体（CAGTA）已被证明可以更早地抑制白色念珠菌的体外生长和生物膜形成。本文概述了评估抗体对热带梭菌形成的生物膜的作用的详细方案。该协议的方法涉及在96孔微量滴定板中形成热带梭菌生物膜，然后在存在或不存在抗原特异性抗体的情况下孵育，然后进行2，3-双（2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基）-5-羧苯胺-2H-四唑（XTT）测定，用于测量生物膜中真菌细胞的代谢活性。
通过使用适当的血清对照（包括去除Sap2特异性抗体的血清）证实了特异性。结果表明，免疫动物血清中存在的抗体可以在体外抑制念珠菌生物膜成熟。总之，本文为抗体在开发侵袭性念珠菌病期间针对生物膜的新型免疫疗法和协同或辅助治疗的潜力提供了重要的见解。该体外方案可用于检查潜在的新抗真菌化合物对生物膜中念珠菌属细胞代谢活性的影响。

热带念珠菌 生物膜在96孔微量滴定板中生长，并使用倒置显微镜以40倍成像（图1A）。使用结晶紫进一步染色生物膜，并使用倒置显微镜在40x下观察（图1B）。扫描电子显微镜显示 热带梭菌 生物膜的代表性图像（图1C）。为了进行生物膜抑制测定，按照布局，在时间0将105 个 念珠菌 细胞添加到96孔微量?...

Watch this Scientific Journal Video about A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms at JoVE.com

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

本文描述了一种基于96孔微量滴定板的方案，使用2，3-双（2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基）-5-甲苯胺-2H-四唑（XTT）还原测定，以研究抗体对 热带梭菌形成的生物膜的影响。该 体外 方案可用于检查潜在的新抗真菌化合物对生物膜中 念珠菌 属细胞代谢活性的影响。

一种基于四唑的可溶性还原测定，用于评估抗体对 热带念珠菌 生物膜的影响

Candida species are the fourth-most common cause of systemic nosocomial infections. Systemic or invasive candidiasis frequently involves biofilm formation ...

这种体外，基于96孔板的方案可用于测试新型抗真菌剂的抗体对念珠菌生物膜中真菌细胞代谢活性的抑制作用。与其他方法相比，这是一种高度灵敏、准确、高通量、可重复、用户友好且具有成本效益的技术，用于评估抗体或抗真菌药对念珠菌生物膜发育的影响。该测定可用于评估新型药物或基于抗体的疗法的疗效，以及针对念珠菌生物膜的候选疫苗，这些候选疫苗与侵袭性念珠菌病的严重程度有关。该方法可用于测试新型抗真菌剂或抗体在不同环境中使用不同真菌菌株或抗体源在不同环境中形成或成熟过程中的效果。演示这一程序的将是Pankaj Chandley先生，他是在我的实验室工作的博士研究学者。首先，将 100 微升热带念珠菌培养物添加到 96 孔微量滴定板中。使用多通道移液器，单独用 100 微升 RPMI 1640 MOPS 培养基填充最后两列。用盖子和铝箔盖住微量滴定板，并在静止条件下在 37 摄氏度下孵育板 24 小时。第二天，使用多通道移液器小心吸出培养基。在印迹纸上轻轻倒置板，然后轻拍以去除任何残留培养基。使用多通道移液器用200微升1X PBS清洗板。使用多通道移液器小心吸出PBS，并用PBS洗涤两次。要去除多余的PBS，请在生物安全柜内的室温下风干板30分钟。在无菌RPMI 1640 MOPS培养基中制备热灭活血清样品的连续稀释液。向96孔微量滴定板的每个孔中加入100微升选定的血清稀释液。在第 10 列中，仅添加 RPMI 1640 MOPS 培养基用于纯真菌阳性对照。向第11列中的所有孔中加入1至50稀释的血清，作为无真菌加血清阴性对照。用盖子和铝箔盖住板后，将板在 24 摄氏度下孵育 37 小时。第二天，使用多通道移液器小心吸出血清后，轻轻敲击倒置板以去除任何残留的血清。重复PBS洗涤三次，并在生物安全柜内在室温下风干板30分钟，以干燥任何多余的PBS。然后，将 25 毫克 XTT 溶解在 50 毫升过滤灭菌的林格氏乳酸中。在单独的管中等分10毫升。用铝箔覆盖并存放在零下80摄氏度。接下来，将 8.6 毫克甲萘醌溶解在 5 毫升丙酮中。在 50 个单独的微管中分配 100 微升后，将等分试样储存在零下 80 摄氏度。取XTT10毫升，加入甲萘醌1微升，即得1微摩尔工作溶液。每孔 96 孔微量滴定板加入 100 微升 XTT 甲萘醌溶液。接下来，用盖子和铝箔盖住板后，在黑暗中将板在 37 摄氏度下孵育两个小时。最后，将80微升有色上清液从每个孔转移到新鲜的96孔板中，并在490纳米处读取板。来自Sap2-副疣免疫小鼠的血清可以防止预成型的热带念珠菌生物膜的成熟65%，而来自Sap2-白色念珠菌的血清为45%，在Sap2-热带免疫小鼠中为55%。总体而言，Sap2免疫血清对生物膜的抑制显著高于假免疫血清，在免疫前血清中分别为16%和13%。使用PBS和无血清对照的生物膜抑制几乎可以忽略不计。在执行洗涤步骤时应格外小心，以防止生物膜的破坏。XTT溶液应在使用前制备，并立即添加到平板中。按照此过程，用户可以在不同的研究环境中使用不同的真菌菌株评估新型抗真菌剂、候选疫苗或抗体在念珠菌生物膜形成和成熟过程中的效果。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

共培养模型绿脓杆菌现场人类呼吸道细胞生长的生物膜

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

科研

免疫与感染

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

一个96孔微孔板为基础的方法监测的形成和抗真菌的药敏试验白色念珠菌生物膜

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

一个细胞检测系统估算的GM - CSF抗体的中和能力，采用重组可溶性GM - CSF受体

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

可见光和庆大霉素的协同作用<em&gt;假单胞菌假单胞菌</em&gt;微生物

Recently there were several publications on the  bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of  the spectrum (400 nm-500 ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

使用点击化学测量的影响，病毒感染宿主细胞RNA合成

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

在体外试验 ，以评估免疫调节途径对HIV特异性CD4 + T细胞效应功能的影响

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

单核细胞单层试验中用于评估Fcγ受体介导的吞噬作用

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

高通量兼容检测，以评估对巨噬细胞传代药物疗效<em&gt;结核分枝杆菌</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

荧光为基础的神经氨酸酶抑制测定流感病毒的易感性评估抗病毒药的神经氨酸酶抑制剂类

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

一种新的体外创面愈合试验评价细胞迁移

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

一种基于四唑的可溶性还原测定，用于评估抗体对 热带念珠菌 生物膜的影响

一种基于四唑的可溶性还原测定，用于评估抗体对热带念珠菌生物膜的影响