Name: a soluble tetrazolium-based reduction assay to evaluate the effect of antibodies on candida tropicalis biofilms
Uploaded: 2022-09-16T14:15:00
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この研究は、ラマリンガスワミ助成金DBT-843-BIO(インド政府バイオテクノロジー省)および早期キャリア研究賞SER-1058-BIO(インド政府科学技術研究委員会)によってS.R.に支援されました。著者らは、ICMR-JRFのP.C.への助成金とDBT-JRFのP.S.への助成金を認めている。著者らは、SEM中のPradeep Singh Thakur氏による原稿と技術支援に関する提案について、Ravikant Ranjan博士に感謝する。

BALB/cマウスはIITルールキーの小動物施設に収容された。すべての動物を25°Cで12時間:12時間の明暗サイクルで維持し、ペレット食と水を 自由に与えました。すべての動物の手順は、IITルールキーの制度的動物倫理委員会(IAEC)によって承認されました。
1. C.トロピカリスの調製
注:真菌 カンジダトロピカリスは リスクグ?...

カンジダ種によって引き起こされる真菌感染症は、世界中で高い罹患率と死亡率に関連しています。侵襲性真菌感染症の脅威の高まりは、そのような生命を脅かす病気の早期管理を必要とします。ほとんどのカンジダ感染症は、さまざまな医療機器に付着し、病院環境での真菌感染症の持続と再発の原因となるバイオフィルムの形成を伴います31。バイオフィ?...

全身性カンジダ症は院内感染の4番目の主要な原因であり、世界中で高い罹患率と死亡率に関連しています。世界的に、全身性カンジダ症は約70万人に影響を及ぼします1。カンジダ種、すなわちC.アルビカンス、C.トロピカリス、C.パラプシロシス、C.グラブラタ、およびC.アウリスは、侵襲性カンジダ感染症の最も一般的な原因です2。 カンジダ種は、バイオフィルム3を産生する日和見病原体です。バイオフィルムは主にカンジダの病原性に関連しており、カンジダはバイオフィルム形成を誘導することにより酸化的および浸透圧ストレス条件に耐えることができます4。バイオフィルムは、病原性因子と細胞壁成分の発現をさらに調節し、高分子外保護マトリックスを形成し、カンジダがさまざまな宿主ニッチに適応するのを助けます4。バイオフィルムは、宿主組織や医療機器への酵母の接着に貢献します5。このように、バイオフィルム内の酵母細胞が宿主の免疫応答を回避できるため、バイオフィルム形成は酵母にとって有利である6。バイオフィルム形成はまた、抗真菌薬の作用から病原性酵母を保護します5。C.アルビカンスバイオフィルムのアムホテリシンBに対する感受性の低下は、Pierceらによって実証されています7,8。さらに、バイオフィルムはフルコナゾールに対する抗真菌薬耐性を示し、全身性カンジダ症の効果的な管理を損ないます9,10。
微生物は、さまざまな生物的および非生物的表面に付着する固有の傾向があり、その結果、バイオフィルムが形成されます。二形性真菌であるカンジダ・アルビカンスは、酵母および菌糸の形で存在し、そのバイオフィルム形成は、さまざまなin vitroおよびin vivoモデルシステムで特徴付けられています11。バイオフィルム形成のステップには、基質へのカンジダ細胞の接着、フィラメント形成、増殖、およびバイオフィルム成熟が含まれる11。最初に、酵母型のC.アルビカンスは、医療機器およびヒト組織を含む基質に接着し、続いてC.アルビカンスの糸状化および菌糸および偽菌糸形態への増殖、そして最後に細胞外マトリックスに埋め込まれたバイオフィルムの成熟が続く11。バイオフィルム形成は、C. albicansの病因メカニズムに大きく寄与しています12。カンジダ種は薬剤耐性バイオフィルムを形成するため、根絶が困難になります13。C.アルビカンスのバイオフィルム産生集団の小さなサブセットは、抗真菌薬アムホテリシンBおよびクロルヘキシジン14に対して非常に耐性があると説明されています。注目すべきことに、バイオフィルム中の酵母細胞は、プランクトン期および増殖期14の酵母細胞と比較して、多剤併用療法に対して高い耐性を示す。バイオフィルム中に存在する酵母細胞は抗真菌薬に対する耐性が高く、バイオフィルム中のC. albicansの生存に寄与していることが示唆されています14。これらの既存の細胞は、変異体ではなくC.アルビカンスの表現型変異体であると報告された14。さらに、「持続性細胞」として知られるカンジダバイオフィルムの細胞は、高用量のアムホテリシンB治療に耐性があり、カンジダの生存に寄与するため、高リスクの個人に再発する全身性カンジダ感染の大きな負担をもたらします15。
カンジダ株における抗真菌薬耐性の増加は、新しい抗真菌剤および免疫療法の研究を必要とする。上記の研究から明らかなように、カンジダバイオフィルムは抗真菌薬に対する感受性の低下を示しています。したがって、カンジダバイオフィルム形成を制御するための改善された免疫療法が必要である。以前の研究では、CAGTAがin vitroでC.アルビカンスのバイオフィルム形成を阻害することにより、全身性カンジダ感染症に対する効果的な保護を提供できることが示されています16。別の研究では、マウスにC.アルビカンスrAls3-Nタンパク質を免疫すると、インビトロでのC.アルビカンスのバイオフィルム形成を妨げる高い抗体価が誘導されることが報告されています17。 抗Als3-N抗体は、バイオフィルムからのC.アルビカンス分散に対しても阻害効果を発揮した17。C.アルビカンスに基づくNDV-3Aワクチンは現在臨床試験中であり、抗NDV-3A血清もC.オーリスバイオフィルム形成を減少させることが見出された18。最近の研究では、全身性カンジダ症のマウスモデルにおける保護メカニズムとして、Sap2抗体によるバイオフィルム形成の阻害が特定されました19。
この論文は、Sap2ワクチン接種マウスのさまざまなグループから得られたポリクローナル血清に存在する抗原特異的抗体が、事前に形成されたカンジダトロピカリスバイオフィルムに及ぼす影響を評価するための詳細なin vitroプロトコルの概要を示しています。これを達成するために、XTT還元アッセイに基づく方法が実験室で最適化および開発され、抗体の有無にかかわらず、バイオフィルムの生存率を高速、高感度、およびハイスループットの方法で測定できます。
XTTアッセイは、細胞生存率、細胞増殖、および細胞毒性の指標として細胞代謝活性を測定するために使用されます20。この比色アッセイは、代謝活性細胞による黄色テトラゾリウム塩ナトリウム3'-[1-(フェニルアミノカルボニル)-3,4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホン酸水和物(XTT)のオレンジホルマザン色素への還元に基づいています。生存細胞のみがXTTを減少させることができるので、減少したXTTホルマザンの量は、色の強度および細胞生存率に比例する。形成されたホルマザン色素は水溶性であり、プレートリーダーを使用して直接定量されます。その水溶性の性質により、XTTアッセイは、バイオフィルム構造を破壊することなく、無傷のバイオフィルムの研究、ならびにバイオフィルムの薬物感受性の検査を可能にする21。さらに、この方法は、その使いやすさ、速度、精度、高スループット、および高い再現性のために、カンジダ菌の生存率評価に実装されています7,22。
XTT還元アッセイに加えて、バイオフィルム量の測定のための多数の代替技術も同定されている。これらのいくつかには、MTT還元アッセイ、クリスタルバイオレット染色、DNA定量、定量PCR、タンパク質定量、乾燥細胞重量測定、および生菌コロニーカウントの使用が含まれます。これらの手順は、時間とコストの要件の点で大きく異なります。Taffらは、7つの異なるカン ジダ バイオフィルム定量アッセイの比較分析を実施し、XTTアッセイが C.アルビカンス バイオフィルムの定量的推定のための最も再現性があり、正確で、効率的な方法を提供することを発見しました23。クリスタルバイオレットなどの染色技術には特定の制限があります。クリスタルバイオレット試験は、クリスタルバイオレット染色されたバイオフィルムマトリックスと細胞の光学密度を測定することにより、バイオフィルムの量を間接的に決定します。クリスタルバイオレットアッセイはバイオフィルム質量の良好な尺度を提供するが、微生物細胞および細胞外マトリックス24の両方を染色するので、バイオフィルム生存率の尺度を与えない。Dhaleらはさらに、XTT還元アッセイは、クリスタルバイオレットアッセイと比較して、バイオフィルム産生を検出するための最も感度が高く、再現性があり、正確で、効率的で、特異的な方法であると報告しました25。文献報告によると、XTTアッセイはCFU計数法のCFU/mLパラメータとよく相関しています。ただし、XTTアッセイと比較して、CFU法は労働集約的で遅い26。さらに、分離された生細胞の画分は、初期のバイオフィルム集団27を代表するものではないかもしれない。XTT還元アッセイは、生存率を定量化するための最良の選択肢のようですが、この手法にはいくつかの制限があります。XTT法は、1つの真菌株を含む比較には有用ですが、異なる真菌株および種を比較する場合、その使用が制限される可能性があります。異なる株が異なる能力を持つ基質を代謝するため、詳細な標準化がない場合、菌株間比較は困難な場合があります21。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>546021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>-</td>
			<td>Prepared in lab</td>
			<td>NaCl : 4 g 
			KCl : 0.1 g 
			Na2HPO4:&#160; 0.72 g 
			KH2PO4 : 0.12 g 
			Water 500 mL. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>546041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>442404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Menadione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter Plate Reader</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette and tips</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>460090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringers Lactate</td>
			<td>-</td>
			<td>Prepared in lab</td>
			<td>sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 MOPS</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>AT180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud dextrose Agar</td>
			<td>SRL</td>
			<td>24613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud dextrose Broth</td>
			<td>SRL</td>
			<td>24835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XTT&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>X6493</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a soluble tetrazolium-based reduction assay to evaluate the effect of antibodies on candida tropicalis biofilms

カンジダ 種は、全身性院内感染の4番目に一般的な原因です。全身性または侵襲性カンジダ症は、埋め込み型デバイスまたはカテーテルでのバイオフィルム形成を伴うことが多く、これは病原性および死亡率の増加と関連している。異なる カンジダ 種によって産生されたバイオフィルムは、様々な抗真菌薬に対する耐性が増強される。したがって、 カンジダ バイオフィルムに対する効果的な免疫療法または補助療法を開発する必要があります。細胞性免疫の役割は抗カンジダ 防御において十分に確立されているが、体液性免疫の役割はあまり研究されていない。
バイオフィルム形成と成熟の阻害は防御抗体の主要な機能の1つであると仮定されており、カンジダ・アルビカンス生殖管抗体(CAGTA)は、C.アルビカンスのin vitro増殖とバイオフィルム形成を早期に抑制することが示されています。この論文は、C. tropicalisによって形成されたバイオフィルム上の抗体の役割を評価するための詳細なプロトコルを概説します。このプロトコルの方法論では、96ウェルマイクロタイタープレートでC. tropicalisバイオフィルムを形成し、抗原特異的抗体の存在下または非存在下でインキュベートした後、バイオフィルム中の真菌細胞の代謝活性を測定するための2,3-ビス(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-5-カルボキシアニリド-2H-テトラゾリウム(XTT)アッセイを行います。
特異性は、Sap2特異的抗体枯渇血清を含む適切な血清コントロールを用いて確認した。結果は、免疫動物の血清中に存在する抗体がin vitroでカンジダバイオフィルム成熟を阻害できることを示しています。要約すると、この論文は、侵襲性カンジダ症中のバイオフィルムに対する新しい免疫療法および相乗的または補助的治療の開発における抗体の可能性に関する重要な洞察を提供します。このin vitroプロトコルは、バイオフィルム中のカンジダ種細胞の代謝活性に対する潜在的な新しい抗真菌化合物の効果を確認するために使用できます。

カンジダ・トロピカリスのバイオフィルムを96ウェルマイクロタイタープレートで増殖させ、倒立顕微鏡を用いて40倍で画像化した(図1A)。バイオフィルムをさらにクリスタルバイオレットを用いて染色し、倒立顕微鏡を用いて40倍で観察した(図1B)。走査型電子顕微鏡は、C.トロピカリスバイオフィルムの代表的な画像を示す(<strong class=...

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A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

C. tropicalisによって形成されるバイオフィルムに対する抗体の影響を研究するために、2,3-ビス(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-5-カルボキシアニリド-2H-テトラゾリウム(XTT)還元アッセイを使用した96ウェルマイクロタイタープレートベースのプロトコルが本明細書に記載されています。このin vitroプロトコルは、バイオフィルム中のカンジダ種細胞の代謝活性に対する潜在的な新しい抗真菌化合物の効果を確認するために使用できます。

カンジダ・トロピカリス・バイオフィルムに対する抗体の効果を評価するための可溶性テトラゾリウムベースの還元アッセイ

Candida species are the fourth-most common cause of systemic nosocomial infections. Systemic or invasive candidiasis frequently involves biofilm formation ...

このin vitroの96ウェルプレートベースのプロトコルを使用して、カンジダバイオフィルム中の真菌細胞の代謝活性に対する新規抗真菌剤に対する抗体の阻害効果を試験することができます。他の方法と比較して、これはカンジダバイオフィルムの発生に対する抗体または抗真菌剤の効果を評価するための高感度、正確、ハイスループット、再現性、ユーザーフレンドリー、および費用効果の高い技術です。このアッセイは、侵襲性カンジダ症の重症度に関連するカンジダバイオフィルムに対するワクチン候補だけでなく、新規薬物ベースまたは抗体ベースの治療薬の有効性を評価するために使用できます。この方法は、異なる真菌株または抗体源を使用して、異なる設定でのバイオフィルム形成または成熟中の新規抗真菌剤または抗体の効果を試験するために適用することができる。この手順を実演するのは、私の研究室で働いている博士課程の研究員であるパンカジ・チャンドリー氏です。まず、100マイクロリットルのカンジダトロピカリス培養物を96ウェルマイクロタイタープレートに追加します。マルチチャンネルピペットを使用して、最後の2列に100マイクロリットルのRPMI 1640 MOPS培地のみを入れます。マイクロタイタープレートを蓋とアルミホイルで覆い、定常条件下で摂氏37度で24時間インキュベートします。翌日、マルチチャンネルピペットを使用して培地を注意深く吸引します。プレートを吸い取りシート上でそっと反転させ、軽くたたいて残留培地を取り除きます。マルチチャンネルピペットを使用して、200マイクロリットルの1X PBSでプレートを洗浄します。マルチチャンネルピペットを使用してPBSを注意深く吸引し、PBSで2回洗浄します。余分なPBSを除去するには、生物学的安全キャビネット内でプレートを室温で30分間風乾します。熱不活化血清サンプルの段階希釈液を滅菌RPMI 1640 MOPS培地で調製します。選択した血清希釈液100マイクロリットルを96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加えます。列10に、真菌のみのポジティブコントロール用のRPMI 1640 MOPS培地のみを追加します。11列目のすべてのウェルに1〜50希釈の血清を追加して、真菌なしと血清陰性対照として機能します。プレートを蓋とアルミホイルで覆った後、プレートを摂氏37度で24時間インキュベートします。翌日、マルチチャンネルピペットを使用して血清を注意深く吸引した後、倒立プレートを軽くたたいて残留血清を取り除きます。PBS洗浄を3回繰り返し、生物学的安全キャビネット内でプレートを室温で30分間風乾して、余分なPBSを乾燥させます。次に、25ミリグラムのXTTを50ミリリットルのフィルター滅菌リンゲル乳酸塩に溶解します。別々のチューブに10ミリリットルを分注します。アルミホイルで覆い、マイナス80°Cで保管してください。次に、8.6ミリグラムのメナジオンを5ミリリットルのアセトンに溶かします。そして、50マイクロリットルを100本の別々のマイクロチューブに分配した後、アリコートを摂氏マイナス80度で保管します。10ミリリットルのXTTを取り、1マイクロリットルのメナジオンを加えて1マイクロモルの作業溶液を得る。96ウェルマイクロタイタープレートのウェルあたり100マイクロリットルのXTTメナジオン溶液を追加します。次に、プレートを蓋とアルミホイルで覆った後、暗所で摂氏37度で2時間インキュベートします。最後に、各ウェルから80マイクロリットルの着色上清を新しい96ウェルプレートに移し、490ナノメートルでプレートを読み取ります。Sap2-パラプシロシス免疫マウスの血清は、Sap2-アルビカンス由来の血清の45%、およびSap2-トロピカリス免疫マウスの55%と比較して、事前に形成されたカンジダトロピカリスバイオフィルムの成熟を65%防止することができました。一般に、Sap2免疫血清によるバイオフィルム阻害は、偽免疫血清によるバイオフィルム阻害よりも有意に高く、免疫前血清では16%および13%でした。バイオフィルム阻害は、PBSを使用し、血清コントロールを使用しない場合、無視できる程度でした。バイオフィルムの破壊を防ぐために、洗浄手順を実行する際には細心の注意を払う必要があります。XTT溶液は使用直前に調製し、すぐにプレートに追加する必要があります。この手順に続いて、ユーザーは、さまざまな真菌株を使用したさまざまな研究環境で、カンジダバイオフィルムの形成および成熟中の新しい抗真菌剤、ワクチン候補、または抗体の効果を評価できます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

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共培養モデルの緑膿菌</emライブヒト気道細胞上に成長した>バイオフィルム

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

監視形成との抗真菌薬感受性試験のための96ウェルマイクロタイタープレートベースの方法カンジダアルビカンスバイオフィルム

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

組換え可溶性GM - CSF受容体を用いてGM - CSF抗体の中和能を推定する無細胞アッセイシステム

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

上の可視光およびゲンタマイシンの相乗効果<em&gt; Pseudomona緑膿菌</em&gt;微生物

Recently there were several publications on the  bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of  the spectrum (400 nm-500 ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

宿主細胞のRNA合成でウイルス感染の効果を測定するためにクリックケミストリーを用いた

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

インビトロアッセイで HIV特異的CD4 T細胞エフェクター機能に対する免疫調節経路の影響を評価する

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Fcγ受容体媒介食作用を評価するために、単球単層アッセイの使用

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性<em&gt;結核菌</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

蛍光ベースのノイラミニダーゼ阻害アッセイ抗ウイルスのノイラミニダーゼ阻害剤クラスにインフルエンザウイルスの感受性を評価します

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

新規In Vitro細胞移動を評価する癒しのアッセイを傷

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...