Name: a soluble tetrazolium-based reduction assay to evaluate the effect of antibodies on candida tropicalis biofilms
Uploaded: 2022-09-16T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом Рамалингасвами DBT-843-BIO (Департамент биотехнологии, правительство Индии) и премией за ранние карьерные исследования SER-1058-BIO (Совет по научным и инженерным исследованиям, правительство Индии) для S.R. Авторы признают грант ICMR-JRF для P.C и грант DBT-JRF для P.S. Авторы благодарят д-ра Равиканта Ранджана за предложения по рукописи и техническую помощь г-на Прадипа Сингха Тхакура во время SEM.

Мыши BALB/c были размещены в Центре мелких животных в IIT Roorkee. Все животные содержались в цикле 12 ч: 12 ч света: темноты при 25 ° C и были обеспечены гранулированной диетой и водой ad libitum. Все процедуры для животных были одобрены Институциональным комитетом по этике животных (IAEC) IIT Roorkee.
<p cl...

Грибковые инфекции, вызванные видами Candida, связаны с высокими показателями заболеваемости и смертности во всем мире. Растущая угроза инвазивной грибковой инфекции требует раннего лечения таких опасных для жизни заболеваний. Большинство инфекций Candida включают образование би?...

Системный кандидоз является четвертой основной причиной внутрибольничных инфекций, которые связаны с высокими показателями заболеваемости и смертности во всем мире. В глобальном масштабе системный кандидоз поражает примерно 700 000 человек1. Виды Candida, а именно C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata и C. auris, являются наиболее распространенной причиной инвазивных инфекций Candida 2. Виды Candida являются условно-патогенными микроорганизмами, которые производят биопленки3. Биопленки преимущественно связаны с вирулентностью Candida, и Candida может противостоять окислительным и осмотическим стрессовым условиям, индуцируя образование биопленки4. Биопленки дополнительно модулируют экспрессию факторов вирулентности и компонентов клеточной стенки и образуют экзополимерную защитную матрицу, помогая Candida адаптироваться к различным нишам хозяина 4. Биопленки способствуют адгезии дрожжей на тканях хозяина и медицинских инструментах5. Таким образом, образование биопленки связано с преимуществом дрожжей, поскольку дрожжевые клетки в биопленках могут уклоняться от иммунного ответа хозяина6. Образование биопленки также защищает патогенные дрожжи от действия противогрибковых препаратов5. Снижение восприимчивости биопленок C. albicans к амфотерицину B было продемонстрировано Pierce et al.7,8. Кроме того, биопленки демонстрируют устойчивость к флуконазолу к противогрибковым препаратам, что ухудшает эффективное ведение системного кандидоза 9,10.
Микробы имеют внутреннюю тенденцию прилипать к различным биотическим и абиотическим поверхностям, что приводит к образованию биопленки. Candida albicans, которая является диморфным грибом, существует в дрожжевой и гифальной формах, и ее образование биопленки было охарактеризовано в различных модельных системах in vitro и in vivo 11. Этапы образования биопленки включают адгезию клеток Candida к субстрату, нить, пролиферацию и созревание биопленки11. Первоначально дрожжевая форма C. albicans прилипает к субстратам, включая медицинские устройства и ткани человека, за которыми следует нить и пролиферация C. albicans в гифальные и псевдогифальные формы и, наконец, созревание биопленок, встроенных во внеклеточный матрикс11. Образованию биопленки в значительной степени способствует механизмы патогенеза C. albicans 12. Виды Candida образуют устойчивые к лекарствам биопленки, что затрудняет их искоренение13. Небольшое подмножество популяции, продуцирующей биопленку C. albicans , было описано как обладающее высокой устойчивостью к противогрибковым препаратам амфотерицину B и хлоргексидину14. Следует отметить, что дрожжевые клетки в биопленках демонстрируют высокую устойчивость к мультилекарственной терапии по сравнению с дрожжевыми клетками в планктонной фазе и фазе пролиферации14. Было высказано предположение, что дрожжевые клетки, существующие в биопленках, обладают высокой толерантностью к противогрибковым препаратам, что способствует выживанию C. albicans в биопленках14. Сообщалось, что эти существующие клетки являются фенотипическими вариантами C. albicans , а не мутантами14. Кроме того, клетки биопленок Candida , известных как «персистентные клетки», устойчивы к высоким дозам лечения амфотерицином-B и способствуют выживанию Candida , тем самым создавая большое бремя повторяющихся системных инфекций Candida у лиц с высоким риском15.
Увеличение устойчивости к противогрибковым препаратам у штаммов Candida обусловливает необходимость проведения исследований новых противогрибковых средств и иммунотерапии. Как видно из вышеупомянутых исследований, биопленки Candida показывают снижение восприимчивости к противогрибковым препаратам. Поэтому существует необходимость в улучшенной иммунотерапии для контроля образования биопленки Candida . Более ранние исследования показали, что CAGTA может обеспечить эффективную защиту от системных инфекций Candida путем ингибирования образования биопленки C. albicans in vitro16. В другом исследовании сообщалось, что иммунизация мышей белком C. albicans rAls3-N индуцирует высокие титры антител, которые мешают образованию биопленки C. albicans in vitro17. Анти-Als3-N антитела также оказывали ингибирующее действие на рассеивание C. albicans из биопленок17. Вакцина NDV-3A на основе C. albicans в настоящее время находится в стадии клинических испытаний, и было также обнаружено, что сыворотки против NDV-3A уменьшают образование биопленки C. auris 18. Недавнее исследование выявило ингибирование образования биопленки Sap2-антителами в качестве защитного механизма в мышиной модели системного кандидоза19.
В данной работе изложен подробный протокол in vitro для оценки влияния антиген-специфических антител, присутствующих в поликлональной сыворотке, полученной от различных групп вакцинированных Мышей Sap2, на предварительно сформированные биопленки Candida tropicalis . Для достижения этой цели был оптимизирован и разработан в лаборатории метод, основанный на анализе восстановления XTT, который может измерять жизнеспособность биопленки быстрым, чувствительным и высокопроизводительным способом, в присутствии или отсутствии антител.
Анализ XTT используется для измерения клеточной метаболической активности в качестве индикатора жизнеспособности клеток, клеточной пролиферации и цитотоксичности20. Этот колориметрический анализ основан на восстановлении желтой тетразолиевой соли, натрия 3'-[1-(фениламинокарбонил)-3,4-тетразолий]-бис (4-метокси-6-нитро)гидрата бензолсульфоновой кислоты (XTT) до оранжевого формазанного красителя метаболически активными клетками. Поскольку только жизнеспособные клетки могут уменьшить XTT, количество восстановленного XTT формазана пропорционально интенсивности цвета и жизнеспособности клеток. Образующийся краситель формазана является водорастворимым и непосредственно количественно определяется с помощью пластинчатого считывателя. Благодаря своей водорастворимой природе, анализ XTT позволяет изучать интактные биопленки, а также исследовать восприимчивость биопленки к лекарственным средствам без нарушения структуры биопленки21. Кроме того, этот метод реализован в оценках грибковой жизнеспособности Candida из-за его простоты использования, скорости, точности, высокой пропускной способности и высокой степени воспроизводимости 7,22.
В дополнение к анализу восстановления XTT были также определены многочисленные альтернативные методы измерения количества биопленки. Некоторые из них включают использование анализа восстановления MTT, окрашивание кристаллической фиалкой, количественную оценку ДНК, количественную ПЦР, количественную оценку белка, измерение веса сухих клеток и подсчет жизнеспособных колоний. Эти процедуры сильно различаются с точки зрения их требований к времени и стоимости. Taff et al. провели сравнительный анализ семи различных количественных анализов биопленки Candida и обнаружили, что анализ XTT обеспечивает наиболее воспроизводимый, точный и эффективный метод количественной оценки биопленок C. albicans 23. Методы окрашивания, такие как кристаллический фиолетовый, имеют определенные ограничения; кристаллический фиолетовый тест косвенно определяет количество биопленки путем измерения оптической плотности кристаллической фиолетовой матрицы биопленки и клеток. Хотя анализ кристаллической фиалки обеспечивает хорошую меру массы биопленки, он не дает измерения жизнеспособности биопленки, поскольку он окрашивает как микробные клетки, так и внеклеточный матрикс24. Dhale et al. далее сообщили, что анализ восстановления XTT был наиболее чувствительным, воспроизводимым, точным, эффективным и специфическим методом обнаружения производства биопленки по сравнению с анализом кристаллической фиалки25. Литературные отчеты показали, что анализ XTT хорошо коррелирует с параметром CFU/mL в методе подсчета КОЕ. Однако, по сравнению с анализом XTT, метод КОЕ является трудоемким и медленным26. Кроме того, фракция отделившихся живых клеток может не быть репрезентативной для исходной популяции биопленки27. Хотя анализ восстановления XTT кажется лучшим доступным вариантом для количественной оценки жизнеспособности, есть несколько ограничений этого метода. Хотя метод XTT полезен для сравнения с участием одного грибкового штамма, его использование может быть ограничено при сравнении различных грибковых штаммов и видов. Промежуточные сравнения могут быть затруднены в отсутствие детальной стандартизации, поскольку различные штаммы метаболизируют субстраты с различными возможностями21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>546021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>-</td>
			<td>Prepared in lab</td>
			<td>NaCl : 4 g 
			KCl : 0.1 g 
			Na2HPO4:&#160; 0.72 g 
			KH2PO4 : 0.12 g 
			Water 500 mL. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>546041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>442404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Menadione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter Plate Reader</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette and tips</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>460090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringers Lactate</td>
			<td>-</td>
			<td>Prepared in lab</td>
			<td>sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 MOPS</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>AT180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud dextrose Agar</td>
			<td>SRL</td>
			<td>24613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud dextrose Broth</td>
			<td>SRL</td>
			<td>24835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XTT&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>X6493</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a soluble tetrazolium-based reduction assay to evaluate the effect of antibodies on candida tropicalis biofilms

Виды Candida являются четвертой наиболее распространенной причиной системных внутрибольничных инфекций. Системный или инвазивный кандидоз часто включает образование биопленки на имплантированных устройствах или катетерах, что связано с повышенной вирулентностью и смертностью. Биопленки, производимые различными видами Candida , проявляют повышенную устойчивость к различным противогрибковым препаратам. Поэтому существует необходимость в разработке эффективных иммунотерапий или дополнительных методов лечения против биопленок Candida . В то время как роль клеточного иммунитета хорошо известна в антикандидозной защите, роль гуморального иммунитета изучена меньше.
Было выдвинуто предположение, что ингибирование образования и созревания биопленки является одной из основных функций защитных антител, а антитела зародышевой трубки Candida albicans (CAGTA), как было показано, подавляют рост in vitro и образование биопленки C. albicans ранее. В этой статье излагается подробный протокол оценки роли антител на биопленках, образованных C. tropicalis. Методология для этого протокола включает образование биопленки C. tropicalis в 96-луночных микротитрных пластинах, которые затем инкубировали в присутствии или отсутствии антиген-специфических антител с последующим анализом 2,3-бис(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-5-карбоксанилид-2H-тетразолий (XTT) для измерения метаболической активности грибковых клеток в биопленке.
Специфичность была подтверждена с использованием соответствующих сывороточных контролей, включая Sap2-специфическую сыворотку, обедненную антителами. Результаты показывают, что антитела, присутствующие в сыворотке иммунизированных животных, могут ингибировать созревание биопленки Candida in vitro. Таким образом, эта статья дает важную информацию о потенциале антител в разработке новых иммунотерапий и синергетических или дополнительных методов лечения против биопленок во время инвазивного кандидоза. Этот протокол in vitro может быть использован для проверки влияния потенциальных новых противогрибковых соединений на метаболическую активность клеток вида Candida в биопленках.

Биопленки Candida tropicalis выращивали в 96-луночных микротитрных пластинах и визуализировали в 40 раз с помощью инвертированного микроскопа (рисунок 1А). Биопленку дополнительно окрашивали с использованием кристаллического фиолетового цвета и наблюдали в 40 раз с помощью ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms at JoVE.com

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

В настоящем документе описан протокол на основе пластин на основе 96-луночных микротитров с использованием редукционного анализа 2,3-бис(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-5-карбоксанилида-2H-тетразолия (XTT) для изучения влияния антител на биопленки, образованные C. tropicalis. Этот протокол in vitro может быть использован для проверки влияния потенциальных новых противогрибковых соединений на метаболическую активность клеток вида Candida в биопленках.

Растворимый редукционный анализ на основе тетразолия для оценки влияния антител на биопленки Candida tropicalis

Candida species are the fourth-most common cause of systemic nosocomial infections. Systemic or invasive candidiasis frequently involves biofilm formation ...

Этот протокол in vitro на основе 96 пластин может быть использован для проверки ингибирующего действия антител на новые противогрибковые агенты на метаболическую активность грибковых клеток в биопленках Candida. По сравнению с другими методами, это высокочувствительный, точный, высокопроизводительный, воспроизводимый, удобный для пользователя и экономически эффективный метод оценки влияния антител или противогрибковых препаратов на развитие биопленок Candida. Этот анализ может быть использован для оценки эффективности новых лекарственных средств или антител, а также вакцин-кандидатов против биопленок Candida, которые связаны с тяжестью инвазивного кандидоза.Этот метод может быть применен для тестирования эффекта новых противогрибковых агентов или антител во время образования или созревания биопленки в различных условиях с использованием различных грибковых штаммов или источников антител. Продемонстрировать эту процедуру будет г-н Панкадж Чандли, доктор философии, работающий в моей лаборатории. Для начала добавьте 100 микролитров культуры Candida tropicalis в 96-луночную микротитровую пластину.Используя многоканальную пипетку, заполните последние две колонки 100 микролитрами только среды RPMI 1640 MOPS. Накройте микротитровую пластину крышкой и алюминиевой фольгой и инкубируйте пластину в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия в стационарных условиях. На следующий день тщательно аспирируйте среду с помощью многоканальной пипетки.Аккуратно переверните пластину на листах для промокания и постучите, чтобы удалить остаточную среду. Вымойте пластину 200 микролитрами 1X PBS с помощью многоканальной пипетки. Тщательно аспирируйте PBS с помощью многоканальной пипетки и дважды мойте PBS.Чтобы удалить избыток PBS, высушите пластину на воздухе в течение 30 минут при комнатной температуре внутри шкафа биологической безопасности. Подготовка серийных разведений термоинактивированных образцов сыворотки в стерильной среде RPMI 1640 MOPS. Добавьте 100 микролитров выбранного разведения сыворотки в каждую лунку 96-луночной микротитровой пластины.В колонке 10 добавьте только среду RPMI 1640 MOPS для положительного контроля только гриба. Добавьте от одного до 50 разведений сыворотки во все колодцы в колонке 11, чтобы служить в качестве отрицательного контроля без грибка плюс сыворотка. После покрытия пластины крышкой и алюминиевой фольгой, инкубируйте пластину в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия.На следующий день, после тщательного аспирации сыворотки с помощью многоканальной пипетки, осторожно постучите по перевернутой пластине, чтобы удалить остаточную сыворотку. Повторите промывку PBS три раза и высушите пластину на воздухе в течение 30 минут при комнатной температуре внутри шкафа биологической безопасности, чтобы высушить любые излишки PBS. Затем растворите 25 миллиграммов XTT в 50 миллилитрах стерилизованного фильтром лактата Рингера.Аликвот 10 миллилитров в отдельных тубах. Накройте его алюминиевой фольгой и храните при минус 80 градусах Цельсия. Далее растворяют 8,6 миллиграмма менадиона в пяти миллилитрах ацетона.А после распределения 50 микролитров в 100 отдельных микротрубках храните аликвоты при минус 80 градусах Цельсия. Возьмите 10 миллилитров XTT и добавьте один микролитр менадиона, чтобы получить один микромолярный рабочий раствор. Добавьте 100 микролитров раствора менадиона XTT на лунку 96-луночной микротитровой пластины.Далее, после покрытия пластины крышкой и алюминиевой фольгой, высиживают пластину в течение двух часов при 37 градусах Цельсия в темноте. Наконец, перенесите 80 микролитров цветного супернатанта из каждой скважины в свежую 96-луночную пластину и считайте пластину на 490 нанометров. Сыворотка от мышей, иммунизированных Sap2-парапсилезом, может предотвратить созревание предварительно сформированных биопленок Candida tropicalis на 65% по сравнению с 45% в сыворотке от Sap2-альбиканов и на 55% у мышей, иммунизированных Sap2-tropicalis.В целом, ингибирование биопленки иммунной сывороткой Sap2 было значительно выше, чем в фиктивной иммунной сыворотке, что составляет 16% и 13% в преиммунной сыворотке. Ингибирование биопленки было близко к незначительному при использовании PBS и отсутствии сывороточного контроля. При выполнении этапов промывки следует проявлять максимальную осторожность, чтобы предотвратить разрушение биопленок.Раствор XTT должен быть приготовлен непосредственно перед использованием и немедленно добавлен в тарелку. Следуя этой процедуре, пользователи могут оценить эффект новых противогрибковых агентов, вакцин-кандидатов или антител во время формирования и созревания биопленки Candida в различных исследовательских условиях с использованием различных грибковых штаммов.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Сотрудничество культуры Модели Синегнойной палочки Биопленки выращенных на живые человеческие клетки дыхательных путей

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

96 Ну планшет метода, основанного на формировании мониторинга и тестирования Противогрибковые Восприимчивость Candida Albicans Биопленки

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

Бесклеточной системе Пробирной Оценка нейтрализующей способности ГМ-КСФ антител с использованием рекомбинантных растворимых ГМ-КСФ рецептор

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

Синергетический эффект от видимого света и гентамицин на<em&gt; Pseudomona палочки</em&gt; Микроорганизмы

Recently there were several publications on the  bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of  the spectrum (400 nm-500 ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Использование химии Нажмите для оценки влияния вирусной инфекции на клетки-хозяина синтеза РНК

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

Анализ in vitro для оценки влияния иммунорегуляторных Пути на ВИЧ-специфических CD4 Т-клеток эффекторной функцией

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Использование моноцитов монослоя анализе для оценки Fcγ рецептор-опосредованного Фагоцитоз

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

Высокая пропускная способность Совместимость анализа для оценки эффективности против наркотиков пассировать макрофагов<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Флуоресцентный на основе нейраминидазы Анализ ингибирования для оценки восприимчивости вирусов гриппа к нейраминидазы Ингибитор классу противовирусных препаратов

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Роман в Vitro раны исцеления Assay для оценки миграции клеток

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...