Name: a soluble tetrazolium-based reduction assay to evaluate the effect of antibodies on candida tropicalis biofilms
Uploaded: 2022-09-16T14:15:00
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Este trabajo fue apoyado por la subvención Ramalingaswami DBT-843-BIO (Departamento de Biotecnología, Gobierno de la India) y el Premio de Investigación de Carrera Temprana SER-1058-BIO (Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería, Gobierno de la India) a S.R. Los autores reconocen una subvención ICMR-JRF a P.C y una subvención DBT-JRF a P.S. Los autores agradecen al Dr. Ravikant Ranjan por las sugerencias sobre el manuscrito y la asistencia técnica del Sr. Pradeep Singh Thakur durante SEM.

Los ratones BALB/c fueron alojados en la Instalación de Pequeños Animales en IIT Roorkee. Todos los animales se mantuvieron en un ciclo de luz:oscuridad de 12 h:12 h a 25 °C y se les proporcionó una dieta de pellets y agua ad libitum. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Ética Animal (IAEC) del IIT Roorkee.
1. Preparación de C. tropicalis
NOTA: El hongo Candida tropicalis</e...

Las infecciones fúngicas causadas por especies de Candida se asocian con altas tasas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La creciente amenaza de infección fúngica invasiva requiere el manejo temprano de tales enfermedades potencialmente mortales. La mayoría de las infecciones por Candida involucran la formación de biofilms, que se adhieren a una variedad de dispositivos médicos y son responsables de la persistencia y recurrencia de infecciones fúngicas en entornos hospitalarios<sup class...

La candidiasis sistémica es la cuarta causa principal de infecciones nosocomiales, que se asocian con altas tasas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. A nivel mundial, la candidiasis sistémica afecta a aproximadamente 700.000 individuos1. Las especies de Candida, a saber, C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata y C. auris, son la causa más común de infecciones invasivas por Candida 2. Las especies de Candida son patógenos oportunistas que producen biopelículas3. Las biopelículas se asocian predominantemente con la virulencia de Candida, y Candida puede soportar condiciones de estrés oxidativo y osmótico al inducir la formación de biopelículas4. Los biofilms modulan aún más la expresión de factores de virulencia y componentes de la pared celular y forman una matriz protectora exopolimérica, ayudando a Candida a adaptarse a diferentes nichos de huésped4. Las biopelículas contribuyen a la adherencia de la levadura en los tejidos del huésped y los instrumentos médicos5. Como tal, la formación de biopelículas se asocia con una ventaja para las levaduras, ya que las células de levadura dentro de las biopelículas pueden evadir la respuesta inmune del huésped6. La formación de biopelículas también protege a las levaduras patógenas de la acción de los fármacos antifúngicos5. La disminución de la susceptibilidad de los biofilms de C. albicans a la anfotericina B ha sido demostrada por Pierce et al.7,8. Además, los biofilms demuestran resistencia a los fármacos antifúngicos al fluconazol, lo que perjudica el manejo eficaz de la candidiasis sistémica 9,10.
Los microbios tienen una tendencia intrínseca a adherirse a diversas superficies bióticas y abióticas, lo que resulta en la formación de biopelículas. Candida albicans, que es un hongo dimórfico, existe en formas de levadura e hifales, y su formación de biofilm ha sido caracterizada en varios sistemas modelo in vitro e in vivo 11. Los pasos de la formación del biofilm incluyen la adhesión de las células de Candida al sustrato, la filamentación, la proliferación y la maduración del biofilm11. Inicialmente, la forma de levadura de C. albicans se adhiere a sustratos, incluidos dispositivos médicos y tejido humano, seguida de filamentación y proliferación de C. albicans en formas hifales y pseudohifales, y finalmente la maduración de biopelículas incrustadas en la matriz extracelular11. La formación de biopelículas contribuye en gran medida a los mecanismos de patogénesis de C. albicans 12. Las especies de Candida forman biopelículas resistentes a los medicamentos, lo que hace que su erradicación sea un desafío13. Un pequeño subconjunto de la población productora de biopelícula de C. albicans ha sido descrito como altamente resistente a los fármacos antifúngicos anfotericina B y clorhexidina14. Cabe destacar que las células de levadura en biopelículas exhiben una alta resistencia a la terapia multifármaco en comparación con las células de levadura en la fase planctónica y la fasede proliferación 14. Se ha sugerido que las células de levadura existentes en las biopelículas son altamente tolerantes a los fármacos antifúngicos, lo que contribuye a la supervivencia de C. albicans en biopelículas14. Estas células existentes fueron reportadas como variantes fenotípicas de C. albicans y no mutantes14. Además, las células de biofilms de Candida conocidas como "células persistentes" son tolerantes a altas dosis de tratamiento con anfotericina-B y contribuyen a la supervivencia de Candida, lo que representa una gran carga de infecciones sistémicas recurrentes por Candida en individuos de alto riesgo15.
El aumento de la resistencia a los medicamentos antifúngicos en las cepas de Candida requiere la investigación de nuevos agentes antifúngicos e inmunoterapias. Como se desprende de los estudios mencionados anteriormente, las biopelículas de Candida muestran una menor susceptibilidad a los medicamentos antimicóticos. Por lo tanto, existe la necesidad de inmunoterapias mejoradas para controlar la formación de biopelículas de Candida. Estudios anteriores han demostrado que CAGTA puede proporcionar una protección eficaz contra las infecciones sistémicas por Candida mediante la inhibición de la formación de biopelículas de C. albicans in vitro16. Otro estudio informó que la inmunización de ratones con la proteína C. albicans rAls3-N induce altos títulos de anticuerpos que interfieren con la formación de biopelículas de C. albicans in vitro17. Los anticuerpos anti-Als3-N también ejercieron un efecto inhibitorio sobre la dispersión de C. albicans de biofilms17. La vacuna NDV-3A basada en C. albicans se encuentra actualmente en ensayo clínico y también se encontró que los sueros anti-NDV-3A reducen la formación de biopelículas de C. auris 18. Un estudio reciente identificó la inhibición de la formación de biopelículas por anticuerpos Sap2 como un mecanismo de protección en un modelo murino de candidiasis sistémica19.
Este documento describe un protocolo in vitro detallado para evaluar el efecto de los anticuerpos antígeno-específicos presentes en el suero policlonal obtenido de diferentes grupos de ratones vacunados con Sap2 en biopelículas preformadas de Candida tropicalis . Para lograr esto, se optimizó y desarrolló en el laboratorio un método basado en un ensayo de reducción XTT, que puede medir la viabilidad del biofilm de manera rápida, sensible y de alto rendimiento, en presencia o ausencia de anticuerpos.
El ensayo XTT se utiliza para medir la actividad metabólica celular como un indicador de viabilidad celular, proliferación celular y citotoxicidad20. Este ensayo colorimétrico se basa en la reducción de una sal amarilla de tetrazolio, 3'-[1-(fenililaminocarbonil)-3,4-tetrazolio]-bis (4-metoxi-6-nitro) benceno sulfónico hidrato de ácido sulfónico (XTT) a un colorante formazán naranja por células metabólicamente activas. Dado que solo las células viables pueden reducir XTT, la cantidad de formazan XTT reducida es proporcional a la intensidad del color y la viabilidad celular. El colorante formazán formado es soluble en agua y se cuantifica directamente utilizando un lector de placas. Debido a su naturaleza soluble en agua, el ensayo XTT permite el estudio de biofilms intactos, así como el examen de la susceptibilidad a los medicamentos biofilm, sin interrupción de la estructura del biofilm21. Además, este método se implementa en las evaluaciones de viabilidad fúngica de Candida debido a su facilidad de uso, velocidad, precisión, alto rendimiento y alto grado de reproducibilidad 7,22.
Además del ensayo de reducción XTT, también se han identificado numerosas técnicas alternativas para la medición de la cantidad de biofilm. Algunos de estos incluyen el uso del ensayo de reducción de MTT, tinción de violeta cristalina, cuantificación de ADN, PCR cuantitativa, cuantificación de proteínas, medición del peso de células secas y conteo de colonias viables. Estos procedimientos varían ampliamente en términos de sus requisitos de tiempo y costo. Taff et al. realizaron un análisis comparativo de siete ensayos diferentes de cuantificación de biopelículas de Candida y encontraron que el ensayo XTT proporcionó el método más reproducible, preciso y eficiente para la estimación cuantitativa de biopelículas de C. albicans 23. Las técnicas de tinción como el cristal violeta tienen ciertas limitaciones; La prueba de violeta de cristal determina indirectamente la cantidad de biopelícula midiendo la densidad óptica de la matriz y las células de la biopelícula teñida de violeta de cristal. Aunque el ensayo de violeta cristalina proporciona una buena medida de la masa del biofilm, no da una medida de viabilidad del biofilm, ya que tiñe tanto las células microbianas como la matriz extracelular24. Dhale et al. informaron además que el ensayo de reducción XTT fue el método más sensible, reproducible, preciso, eficiente y específico para detectar la producción de biopelícula en comparación con el ensayo de violeta cristal25. Los informes de la literatura han demostrado que el ensayo XTT se correlaciona bien con el parámetro UFC/ml en el método de conteo de UFC. Sin embargo, en comparación con el ensayo XTT, el método CFU es laborioso y lento26. Además, la fracción de células vivas separadas puede no ser representativa de la población inicial de biofilm27. Aunque el ensayo de reducción XTT parece la mejor opción disponible para cuantificar la viabilidad, existen algunas limitaciones de esta técnica. Si bien el método XTT es útil para comparaciones que involucran una cepa de hongos, su uso puede ser limitado cuando se comparan diferentes cepas y especies de hongos. Las comparaciones entre cepas pueden ser difíciles en ausencia de una estandarización detallada, ya que diferentes cepas metabolizan sustratos con diferentes capacidades21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>546021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>-</td>
			<td>Prepared in lab</td>
			<td>NaCl : 4 g 
			KCl : 0.1 g 
			Na2HPO4:&#160; 0.72 g 
			KH2PO4 : 0.12 g 
			Water 500 mL. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>546041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>442404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Menadione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter Plate Reader</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette and tips</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>460090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringers Lactate</td>
			<td>-</td>
			<td>Prepared in lab</td>
			<td>sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 MOPS</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>AT180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud dextrose Agar</td>
			<td>SRL</td>
			<td>24613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud dextrose Broth</td>
			<td>SRL</td>
			<td>24835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XTT&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>X6493</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a soluble tetrazolium-based reduction assay to evaluate the effect of antibodies on candida tropicalis biofilms

Las especies de Candida son la cuarta causa más común de infecciones nosocomiales sistémicas. La candidiasis sistémica o invasiva con frecuencia implica la formación de biopelículas en dispositivos implantados o catéteres, lo que se asocia con un aumento de la virulencia y la mortalidad. Las biopelículas producidas por diferentes especies de Candida exhiben una mayor resistencia contra varios medicamentos antifúngicos. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar inmunoterapias efectivas o tratamientos adyuvantes contra las biopelículas de Candida . Si bien el papel de la inmunidad celular está bien establecido en la protección contra Candida , el papel de la inmunidad humoral se ha estudiado menos.
Se ha planteado la hipótesis de que la inhibición de la formación y maduración de biopelículas es una de las principales funciones de los anticuerpos protectores, y se ha demostrado que los anticuerpos del tubo germinal de Candida albicans (CAGTA) suprimen el crecimiento in vitro y la formación de biopelículas de C. albicans antes. Este documento describe un protocolo detallado para evaluar el papel de los anticuerpos en las biopelículas formadas por C. tropicalis. La metodología para este protocolo implica la formación de biopelículas de C. tropicalis en placas de microtitulación de 96 pocillos, que luego se incubaron en presencia o ausencia de anticuerpos específicos de antígeno, seguido de un ensayo de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carboxanilida-2H-tetrazolio (XTT) para medir la actividad metabólica de las células fúngicas en la biopelícula.
La especificidad se confirmó mediante el uso de controles séricos apropiados, incluido el suero con depleción de anticuerpos específicos de Sap2. Los resultados demuestran que los anticuerpos presentes en el suero de animales inmunizados pueden inhibir la maduración del biofilm de Candida in vitro. En resumen, este documento proporciona información importante sobre el potencial de los anticuerpos en el desarrollo de nuevas inmunoterapias y tratamientos sinérgicos o adyuvantes contra las biopelículas durante la candidiasis invasiva. Este protocolo in vitro se puede utilizar para comprobar el efecto de posibles nuevos compuestos antifúngicos sobre la actividad metabólica de las células de especies de Candida en biopelículas.

Las biopelículas de Candida tropicalis se cultivaron en placas de microtitulación de 96 pocillos y se obtuvieron imágenes a 40x utilizando un microscopio invertido (Figura 1A). La biopelícula se tiñó aún más con cristal violeta y se observó a 40x utilizando un microscopio invertido (Figura 1B). La microscopía electrónica de barrido muestra una imagen representativa de la biopelícula de C. tropicalis (Figura 1C</...

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A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

En el presente documento se describe un protocolo basado en placas de microtitulación de 96 pocillos que utiliza un ensayo de reducción de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carboxanilida-2H-tetrazolio (XTT), para estudiar los efectos de los anticuerpos en las biopelículas formadas por C. tropicalis. Este protocolo in vitro se puede utilizar para comprobar el efecto de posibles nuevos compuestos antifúngicos sobre la actividad metabólica de las células de especies de Candida en biopelículas.

Un ensayo de reducción soluble a base de tetrazolio para evaluar el efecto de los anticuerpos en las biopelículas de Candida tropicalis

Candida species are the fourth-most common cause of systemic nosocomial infections. Systemic or invasive candidiasis frequently involves biofilm formation ...

Este protocolo in vitro, basado en placas de 96 pocillos, se puede utilizar para probar el efecto inhibitorio de los anticuerpos sobre nuevos agentes antifúngicos sobre la actividad metabólica de las células fúngicas en biopelículas de Candida. En comparación con otros métodos, esta es una técnica altamente sensible, precisa, de alto rendimiento, reproducible, fácil de usar y rentable para evaluar el efecto de los anticuerpos o antifúngicos en el desarrollo de biopelículas de Candida. Este ensayo se puede utilizar para evaluar la eficacia de nuevas terapias basadas en fármacos o anticuerpos, así como candidatos a vacunas contra biopelículas de Candida, que están asociadas con la gravedad de la candidiasis invasiva.Este método se puede aplicar para probar el efecto de nuevos agentes antifúngicos o anticuerpos durante la formación o maduración de biopelículas en diferentes entornos utilizando diferentes cepas de hongos o fuentes de anticuerpos. Demostrando este procedimiento estará el Sr. Pankaj Chandley, un investigador de doctorado que trabaja en mi laboratorio. Para comenzar, agregue 100 microlitros de cultivo de Candida tropicalis a una placa de microtitulación de 96 pocillos.Con una pipeta multicanal, llene las dos últimas columnas con 100 microlitros de medio RPMI 1640 MOPS solo. Cubra la placa de microtitulación con una tapa y papel de aluminio e incube la placa durante 24 horas a 37 grados centígrados en condiciones estacionarias. Al día siguiente, aspire el medio cuidadosamente con una pipeta multicanal.Invierta la placa suavemente en las hojas secantes y toque para eliminar cualquier medio residual. Lave el plato con 200 microlitros de 1X PBS utilizando una pipeta multicanal. Aspirar el PBS cuidadosamente con una pipeta multicanal y lavar dos veces con PBS.Para eliminar el exceso de PBS, seque al aire la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente dentro de un gabinete de seguridad biológica. Preparar diluciones seriadas de muestras de suero inactivado por calor en medio estéril RPMI 1640 MOPS. Agregue 100 microlitros de la dilución sérica seleccionada a cada pocillo de la placa de microtitulación de 96 pocillos.En la columna 10, agregue solo el medio RPMI 1640 MOPS para el control positivo solo de hongos. Agregue una dilución de uno a 50 de suero a todos los pocillos en la columna 11 para que sirva como control negativo sin hongos más suero. Después de cubrir la placa con una tapa y papel de aluminio, incubar la placa durante 24 horas a 37 grados centígrados.Al día siguiente, después de aspirar el suero cuidadosamente con una pipeta multicanal, golpee suavemente la placa invertida para eliminar cualquier suero residual. Repita el lavado de PBS tres veces y seque al aire la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente dentro de un gabinete de seguridad biológica para secar cualquier exceso de PBS. Luego, disuelva 25 miligramos de XTT en 50 mililitros de lactato de Ringer esterilizado por filtro.Alícuota 10 mililitros en tubos separados. Cúbralo con papel de aluminio y guárdelo a menos 80 grados centígrados. A continuación, disuelva 8.6 miligramos de menadiona en cinco mililitros de acetona.Y después de distribuir 50 microlitros en 100 microtubos separados, guarde las alícuotas a menos 80 grados centígrados. Tome 10 mililitros de XTT y agregue un microlitro de menadiona para obtener una solución de trabajo de un micromolar. Agregue 100 microlitros de la solución de menadiona XTT por pocillo de la placa de microtitulación de 96 pocillos.Luego, después de cubrir la placa con una tapa y papel de aluminio, incube la placa durante dos horas a 37 grados centígrados en la oscuridad. Finalmente, transfiera 80 microlitros del sobrenadante coloreado de cada pozo a una placa fresca de 96 pocillos y lea la placa a 490 nanómetros. El suero de ratones inmunizados con Sap2-parapsilosis podría prevenir la maduración de biopelículas preformadas de Candida tropicalis en un 65% en comparación con el 45% en suero de Sap2-albicans y el 55% en ratones inmunizados con Sap2-tropicalis.En general, la inhibición de la biopelícula por el suero inmune Sap2 fue significativamente mayor que la del suero inmune simulado, que es del 16% y 13% en el suero preinmune. La inhibición de la biopelícula fue casi insignificante en el uso de PBS y ningún control sérico. Se debe tener el máximo cuidado al realizar los pasos de lavado para evitar la interrupción de las biopelículas.La solución XTT debe prepararse justo antes de su uso y agregarse a la placa inmediatamente. Después de este procedimiento, los usuarios pueden evaluar el efecto de nuevos agentes antifúngicos, candidatos a vacunas o anticuerpos durante la formación y maduración de la biopelícula Candida en diferentes entornos de investigación utilizando diferentes cepas de hongos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Investigación

Inmunología e Infección

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A 96 de microtitulación y placa basada en el método para la formación de Control y pruebas de sensibilidad antifúngica Candida albicans Las biopelículas

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