AirID является ценным ферментом для белок-белкового взаимодействия, и он создает меньшую токсичность и меньшую погрешность в процессах, затрачиваемых на время, чем другие ферменты, мечущие близость. Представлен пошаговый протокол проведения эксперимента по мечению близости у огурца или Cucumis sativus с использованием AT4G18020 качестве модели белка APRR2-AirID. Процедуру будут демонстрировать Ахмад Зада, Имран Хан, Юйтин Чэн и Мин Чжан из моей лаборатории.
Начните с переноса семян Cucumis sativus или огурцов в воду, инкубируйте их при температуре 50 градусов Цельсия в течение 20 минут, а затем поместите семена на фильтровальную бумагу на планшете Петри на 12-16 часов. Позже пересадите семена в горшки с почвой и выращивайте их в климатической камере при температуре 23 градуса Цельсия в течение 16 часов при свете и 18 часах в темноте в течение трех-четырех недель. Перенесите 2,5 мкл плазмиды EarleyGate 100 в компетентные клетки штамма agrobacterium tumefaciens GV3101.
Инкубируйте пробирку на льду в течение 30 минут, прежде чем перенести ее в жидкий азот в течение трех минут. Чтобы вызвать тепловой шок, перенесите пробирку в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на пять минут. Затем поместите трубку на лед на две минуты.
Добавьте 1 000 микролитров среды Luria Bertani или LB к клеткам агробактерий, находящихся в тепловом шоке. После инкубации клеток при температуре 30 градусов Цельсия и 118 об/мин в течение одного часа центрифугируют их при 3000 G в течение двух минут при четырех градусах Цельсия. Затем выбросьте 800 микролитров надосадочной жидкости и смешайте оставшийся раствор.
Нанесите его на среду LB, добавив 50 микрограммов на миллилитр канамицина и гентамицина каждый и 25 микрограммов на миллилитр рифампицина. Выдерживайте тарелки при температуре 30 градусов Цельсия в течение 48 часов. Соберите несколько колоний бактерий с тарелок.
Поместите их в жидкие среды LB, дополненные соответствующими антибиотиками, и инкубируйте жидкие LB при температуре 30 градусов Цельсия и 218 об/мин в течение 36-48 часов. После двух минут центрифугирования при 3 000 G при четырех градусах Цельсия повторно суспендируйте гранулу в агроинфильтрационном буфере, чтобы отрегулировать оптическую плотность до одной на длине волны 600 нанометров. С помощью безыгольной шприца объемом один миллилитр инфильтрируют весь эпидермис абаксиальной поверхности 1,5 миллилитрами ресуспендированного агробактериального посевного материала.
Поддерживайте растения в климатической камере при температуре 23 градуса Цельсия при освещении 75 микромолей на квадратный метр в секунду в течение 16 часов в темноте в течение восьми часов Через 36 часов инфильтрируйте один миллилитр пяти микрограммов биотина в уже отфильтрованные листья. После 4-12 часов проникновения биотина срежьте листья и быстро перенесите их в жидкий азот, чтобы избежать разложения белка. Измельчите листья с помощью пестика и ступки и быстро добавьте два миллилитра PBS BSA с pH 7,4 с последующим медленным измельчением.
Перелейте смесь образцов в коническую пробирку объемом 15 миллилитров через фильтр для быстрого фильтрующего материала, расположенный поверх нее, и держите пробирку на льду. Переложите образцы в двухмиллилитровую пробирку. Добавьте коктейль из 1%-ного ингибитора белка и перемешайте содержимое, повернув пробирку вверх и вниз семь-восемь раз, прежде чем центрифугировать ее.
После этого перелейте надосадочную жидкость в новую двухмиллилитровую пробирку и добавьте 10% бета-D-мальтозида. Поместите пробирку на лед на пять минут, а затем центрифугируйте при 20 000 G на 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Чтобы уравновесить обессоливающую колонну, отметьте одну сторону колонны и центрифугируйте ее отмеченной стороной наружу.
Снимите верхнюю и нижнюю крышки колонки и снова центрифугируйте при 1 000 G в течение двух минут при температуре четыре градуса Цельсия. Выбросьте жидкий раствор из сборной трубки колонны и промойте пробирку пятью миллилитрами буфера PBS центрифугированием, как было продемонстрировано ранее, не менее пяти раз. Добавьте один миллилитр PBS BSA к 50 микролитрам магнитных шариков, конъюгированных стрептавидин-С1, в пробирке объемом 1,5 миллилитра и тщательно перемешайте.
Поместите трубку на магнитную подставку на три минуты, чтобы шарики впитались к одной стороне трубки. Слейте надосадочную жидкость с другой стороны и повторите эту промывку PBS BSA трижды. Чтобы обогатить биотинилированный белок, добавьте в колонку два миллилитра образцов.
После центрифугирования колонки при 1000 G в течение восьми минут при четырех градусах Цельсия добавьте один миллилитр обессоленного белкового экстракта к 50 микролитрам магнитных шариков, конъюгированных стрептавидин-С1. Тщательно перемешайте раствор, поместив пробирку с магнитными шариками на вращатель при нормальной скорости и комнатной температуре на 30 минут. Затем поместите бусины на магнитную стойку на три минуты при комнатной температуре или пока они не соберутся на одной стороне трубки.
Аккуратно удалите надосадочную жидкость и добавьте один миллилитр промывочного буфера. Вращайте пробирку в течение двух минут на вращателе и повторите шаг, выполняемый на магнитной стойке, чтобы удалить надосадочную жидкость. Точно так же выполните промывку одним миллилитром промывочных буферов номер два и три, как было показано ранее.
Затем удалите моющее средство из буферов для стирки, добавив 1,7 миллилитра 50 миллимолярного трис гидрохлорида и повторив шаг, выполняемый на магнитной стойке. Сделайте шесть стирок по две минуты каждая, используя один миллилитр 50-миллимолярного буфера бикарбоната аммония. После этого добавьте к гранулам 50 микролитров белкового экстракта, содержащего 50 миллимолярных трис гидрохлорида, 12% сахарозы, 2% лаурилсульфата лития и 1,5% дитиотрейтола, и поместите пробирку в инкубатор при температуре 100 градусов Цельсия на пять минут, чтобы вызвать тепловой шок.
После повторения шага на магнитной стойке храните надосадочную жидкость при температуре минус 80 градусов Цельсия для анализа LCMS/MS. Вестерн-блоттинг-анализ экстрагированных белков показал успешную экспрессию белка и биотинилирование в инфильтрированных листьях огурца. Более высокий уровень экспрессии меченых белков и дополнительных полос по сравнению с контролем подтвердил успешное мечение белков-мишеней интересующего гена AirID.
Результаты были подтверждены с помощью антител Anti-Flag и Anti-Mass, показывающих целевую полосу с антителами Anti-Flag во всех трансформированных образцах. После обогащения биотинилированных белков магнитными шариками, конъюгированными стрептавидин-С1, наблюдалось несколько белков разного размера. Из всех полученных результатов был сделан вывод, что AirID является новым и идеальным ферментом для анализа белок-белковых взаимодействий в растениях.
Во время эксперимента по мечению близости важно помнить, что идеальным вариантом является пять микромолярных биотинов и продолжительность ЧСС. Протокол описывает пошаговую настройку бесконтактной маркировки на основе AirID в растении, включая подготовку образца листьев, удаление пребиотина, количественное определение белка экстракта и обогащение биотинилированных белков. Прогнозируется, что AirID повысит точность независимого от ИПП биотинилирования в комбинации.
Сделан вывод о том, что AirID идеально подходит для анализа ИПП в растениях.
