Name: multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis
Uploaded: 2022-12-23T13:50:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis at JoVE.com

En del af denne forskning blev finansieret af donationer fra forskellige donorer, herunder Dedert Schilde vzw og Willy Floren. Dette arbejde finansieres delvist af Flamish Research Foundation, 12S9221N (A.L.), G044420N (S.V., A.L., E.G.), 1S27021N (M.L.) og af Industrial Research Fund ved universitetet i Antwerpen, PS ID 45151 (S.V., A.L., C.D.). Figur 1 blev oprettet med BioRender.com.

Human pancreas ductal adenocarcinom (PDAC) patientafledte organoider blev anvendt. Vævsresektionsfragmenter blev opnået fra patienter, der gennemgik helbredende kirurgi på Antwerp Universitetshospital. Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra alle patienter, og undersøgelsen blev godkendt af UZA Ethical Committee (ref. 14/47/480). Detaljer relateret til alle materialer, reagenser, udstyr og software, der anvendes i denne protokol, findes i materialetabellen. En oversigt over arbejdsgangen er vist i figur 1. Eksempler på data er angivet i det supplerende materiale for at gengive protokollen.
1. Dag 0: Tilberedning af 2- eller 3-dages gamle organoider
<ol><li>Forvarm mikropladerne ved 37 °C natten over, og optø den ekstracellulære matrix (ECM) ved 4 °C.</li>
	<li>Forbered fuld PDAC organoid kultur medium: supplement ADF +++ (Advanced DMEM / F12, 1% glutamin supplement, 1% HEPES, og 1% penicillin / streptomycin) med 0,5 nM WNT surrogat-Fc-Fusion protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein konditioneret medium, 4% Rpso3-Fc fusionsprotein konditioneret medium, 1x B27, 1 mM N-acetylcystein (NAC), 5 mM nicotinamid, 500 nM A83-01, 100 ng / ml FGF10, og 10 nM Gastrin).</li>
	<li>Fastlæg PDTO'erne i henhold til den valgte metode. BEMÆRK: En detaljeret protokol leveres af Driehuis et al., som beskriver den konventionelle metode til at etablere, dyrke og passere PDTO'er i ECM-kupler4.</li>
	<li>Enzymatisk dissociere organoiderne i ECM-kupler.<ol><li>Opsug mediet og vask 1x med fosfatbufret saltvand (PBS). Tilsæt dissociationsenzym (f.eks. 2 ml i en 6-brønds mikroplade) og pipette op og ned 10x med en 1 ml pipette for mekanisk at adskille organoiderne og ECM-kuplerne.</li>
		<li>Der inkuberes i 10 minutter ved 37 °C, pipetteres op og ned, og det kontrolleres, om organoiderne dissocieres til enkeltceller. Gentag dette trin, hvis det er nødvendigt.</li>
		<li>Celleopslæmningen opsamles i et 15 ml glas, der tilsættes ADF+++ til et volumen på 10 ml, centrifugeres i 5 minutter ved 450 × g ved stuetemperatur, og supernatanten suges til aspiratering med en Pasteur-pipette og sugepumpe.</li>
		<li>Resuspender pellet i 100-200 μL fuldt medium afhængigt af pelletens størrelse og tæl antallet af celler ved hjælp af den valgte metode. For eksempel: bland 10 μL af cellesuspensionen + 10 μL Trypan Blue og tæl med en automatiseret celletæller.</li>
	</ol></li>
	<li>Plade enkeltceller i ECM-kupler.<ol><li>Fortynd cellesuspensionen og tilsæt 2/3 ECM i henhold til tabel 1. Pipette op til ti 20 μL dråber pr. brønd i en forvarmet 6-brønds plade. Vend pladen på hovedet, og inkubér den i 30 minutter ved 37 °C.</li>
		<li>Overlay med fuldt medium suppleret med 10 μM Y-27632 og inkuberes i 2-3 dage i en inkubator. BEMÆRK: Ti kupler indeholdende 75.000 celler hver er normalt nok til at fylde en 384-brønds mikroplade i en koncentration på 200 organoider / brønd, eksklusive brøndene ved kanten.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Dag 2 - 3: Høst og frø 2- eller 3-dages gamle organoider
<ol><li>Saml intakte organoider fra ECM-kuplerne. BEMÆRK: Organoider har tendens til at klæbe til plastoverflader (f.eks. Rør, pipettespidser). For at undgå dette kan plastvarer forskylles med en 0,1% bovin serumalbumin (BSA) / PBS-opløsning.<ol><li>Opsug mediet og vask 1x med PBS. Tilsæt 1-2 ml kold (4 °C) organoid høstopløsning til en 6-brønds plade afhængigt af antallet af ECM-kupler og inkuber på is på en rysteplatform i 10 minutter.</li>
		<li>Pipetter op og ned med en 1 ml pipette for at adskille ECM-kuplerne, inkubere i yderligere 10 minutter på is og visuelt kontrollere under et mikroskop, om ECM er dissocieret.</li>
		<li>Valgfrit: Hvis en mere ensartet størrelsesfordeling foretrækkes, filtreres suspensionen gennem en 70 μm cellesi før centrifugering.</li>
		<li>Organoiderne opsamles i et 15 ml rør, der er præcoatet med 0,1 % BSA/PBS, tilsættes ADF+++ op til 10 ml og centrifugeres i 5 minutter ved 200 × g ved 4 °C. Supernatanten suges op, og pelletpen resuspenderes i op til 1.000 μl fuldt PDAC-organoidmedium afhængigt af pellets størrelse for at opnå en koncentration på >6.000 organoider/ml.</li>
		<li>Tæl organoiderne ved hjælp af en hvilken som helst valgt tællemetode, helst en billedbaseret.</li>
	</ol></li>
	<li>Frø organoiderne. BEMÆRK: Se materialetabellen for minimumsvolumen/brønd for to forskellige typer mikroplader med 384 brønde, der anvendes i denne protokol.<ol><li>Forafkøl alle plastvarer ved -20 °C eller på is i mindst 20 minutter før brug for at undgå størkning af ECM.</li>
		<li>Såopløsningen fremstilles af 1 ml organisk stamopløsning (trin 2.1.6) med fuldt substrat til frø ~200 organoider pr. hul i 50 μL, det mindste volumen, der anvendes til at fylde en brønd. Brug supplerende fil 1 til at beregne mængden af organoid såopløsning. Tilføj et restvolumen på 1.500 μL, når du bruger en 25 ml beholder og multikanalpipette eller pipetteringsrobot.</li>
		<li>Frø organoiderne ved hjælp af en pipetteringsrobot. BEMÆRK: Både såopløsningen og mikropladen skal afkøles ved 4 °C under pipettering for at undgå størkning af ECM. Derfor blev der 3D-printet et 25 ml reservoir og en mikropladeholder til brug i kombination med pipetteringsrobotten, der kan rumme køleelementer, der er anført i materialetabellen. STL-filer til 3D-udskrivning, de brugerdefinerede labware (supplerende fil 2 og supplerende fil 3) og brugerdefinerede labware JSON-filer til pipetteringsrobotten (supplerende fil 4 og supplerende fil 5) leveres.<ol><li>Design dispenseringsprotokollen ved hjælp af online Protocol Designer Tool. Der findes et eksempel på en JSON-fil (supplerende fil 6), hvor det brugerdefinerede labware allerede er indlæst, og der anvendes en ottekanals p300 (Gen2) pipette med tilsvarende pipettespidser.</li>
			<li>Åbn pipetteringsrobotstyringsappen, vælg protokoller, klik på Importer, og træk og slip supplerende fil 6 i det udpegede felt.</li>
			<li>Vælg den importerede protokol, og placer alt laboratorieudstyr, herunder køleelementer og plastvarer, i kortene i henhold til layoutet vist i feltet Dækopsætning . Brug den venstre åbning til 25 ml beholderen og køleelementet som vist i supplerende fil 7.</li>
			<li>Klik på Kør protokol og fortsæt til opsætning. Åbn fanen Labware-opsætning, klik på Kør Labware-positionskontrol, og følg instruktionerne for at kalibrere pipetteringsrobotten til den nye hardware. BEMÆRK: Labware-forskydningsdata kan gemmes til senere, men det anbefales at køre labware-positionskontrollen før hver kørsel.</li>
			<li>Fyld 25 ml reservoiret (placeret oven på køleelementet) med den afkølede organoidsåningsopløsning, og klik på Start kørsel. BEMÆRK: De øverste og nederste huller bliver også fyldt med organoid suspensionsopløsning på grund af brugen af ottekanalpipetten.</li>
			<li>Mikropladen centrifugeres i 1 min ved 100 × g ved 4 °C.</li>
			<li>Der inkuberes ved 37 °C i mindst 30 minutter.</li>
			<li>De ydre huller til blindprøven fyldes med mindst 50 μL H2O for at undgå fordampning.</li>
			<li>Der inkuberes ved 37 °C natten over for at fjerne eventuelle bobler i brønden, der kan forstyrre billedanalysen.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. Dag 4: Lægemiddelbehandling og reagensdispenser med digital medicindispenser
<ol><li>Opret lægemiddeludleveringsprotokollen ved hjælp af den digitale lægemiddeldispenserstyringssoftware.<ol><li>Hold markøren over plade 1 over pladelayoutet, vælg rediger pladeattributter, og udfyld pladetype: 384 brønd, ekstra volumen (μL): 50 og DMSO-grænse (%): 1.</li>
		<li>Tilføj væsker ved at klikke på knappen + ved siden af Væsker. Dobbeltklik på den nyoprettede væske og navngiv den; vælg klasse (DMSO-baseret eller vandig + Tween 20) og koncentration. BEMÆRK: Alle lægemidler og reagenser skal opløses i 100% DMSO eller 0,3% Tween-20. En 1-10 mM stamopløsning kan anvendes under hensyntagen til en maksimal DMSO-koncentration på <1%. Tabel 2 giver eksempler på de nødvendige fortyndinger for almindelige fluorescerende reagenser og terapier.</li>
		<li>Plade layout<ol><li>For lægemiddeltitrering skal du vælge brønde og klikke på Titrering. For væske skal du vælge det interessante lægemiddel, vælge den højeste koncentration (f.eks. 2.000 nM) og den laveste koncentration (f.eks. 10 nM); For replikater skal du vælge mindst 2 og vælge det ønskede titreringsmønster. BEMÆRK: Titreringsmønsteret afhænger af mange faktorer, herunder hvor meget forbindelse der skal være plads til i en enkelt plade, om hullerne skal randomiseres og antallet af replikater og kontroller.</li>
			<li>For den positive kontrol skal du vælge tre huller, klikke på Indstil værdi og udfylde 2 μM staurosporin fra 10 mM lager i DMSO, hvilket vil inducere maksimal celledød.</li>
			<li>For Cytotox Green skal du vælge alle de brugte brønde, klikke på Indstil værdi og indtaste 60 nM / brønd. BEMÆRK: Cytotox Green fluorescerende farvning indikerer celler, der er døde, og vil derfor ikke forstyrre overvågningen af lægemiddelrespons. Her kræves ingen fluorescerende markør for levende celler.</li>
			<li>For den negative kontrol og DMSO-normalisering skal du vælge alle brønde med yderligere fire brønde til køretøjsstyringen, højreklikke, vælge normalisering, vælge normaliser væskeklasse: DMSO-baseret og normalisere til det højeste klassevolumen for at opnå en lige DMSO-koncentration i hver brønd. BEMÆRK: DMSO-koncentrationer bør være <1%. Der findes et eksempel på TDD-lægemiddeltitreringsfil (supplerende fil 8).</li>
			<li>Klik på pilen under Kør i øverste venstre hjørne, vælg Simuler altid, og klik på Simuler for at identificere eventuelle fejl og få mængderne af hvert lægemiddel, der skal fremstilles. BEMÆRK: For at overvinde en advarsel, når det oprindelige dispenservolumen er for lavt, anbefales "Dispenseringsadvarselsbrønd på 30 nL eller derover for hver væske på hver plade", vælg to huller på kanten, der er fyldt med vand, vælg Indstil værdi, og indtast 10 μM af det lægemiddel, som advarslen forekommer for. Dette primer lægemiddelpatronen med et volumen højere end 30 nL. De samme huller kan bruges til at prime DMSO-patronen ved at indstille en normalisering til % af den samlede volumenværdi (f.eks. 0,5%).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Fjern markeringen af Simuler altid under knappen Kør ; klik på Kør for at starte lægemiddeludleveringsprotokollen og følg instruktionerne.</li>
	<li>Påfør tætningsmembranen på mikropladen for at forhindre fordampning.</li>
	<li>Cytotox Green-farvestoffet inkuberes 1-2 timer ved 37 °C i inkubatoren og fortsæt til trin 4.</li>
</ol>4. Hent billeder med live-cell imager
BEMÆRK: For væksthastighed og NDR skal en scanning på tidspunktet 0 (T0 = start behandling) erhverves 1-2 timer efter tilsætning af Cytotox Green.
<ol><li>Åbn live-cell imager Control software, vælg Method Editor New, gå til fil > import, og vælg eksemplet metode XML-fil (supplerende fil 9). Du kan også oprette en ny fil og vælge Plade: (CORE384fb_OpticalImaging) - Corning 384 Flat Black (Corning #4588), Ingen låg og Ingen fugtighedskassette; Anvendelse: Kun billeder; Målsætning: 4x; Mønster: Central; Kontroller kanalerne Brightfield og Green (LED-intensitet (%) = 40; Eksponeringstid (ms) = 200). BEMÆRK: De grønne kanalindstillinger fungerer godt for en koncentration på 60 nM cytotox Green. Live viewer-indstillingen kan bruges til at justere fokusforskydningen og / eller LED-indstillingerne i realtid.</li>
	<li>Klik på Start for at starte scanningen ved T0.</li>
	<li>Gentag scanningen hver 24. time i op til 5 dage ved hjælp af den samme metode. Hvis du vil køre timelapsemålingen automatisk, kan du også justere metoden i live-cell imager Control-softwaren til et kinetisk eksperiment ved at klikke og trække fanen Kinetisk sløjfe til metodefeltet . På samme måde skal fanerne Temperatur og Gas trækkes ind i metodefeltet for at indstille systemet til 37 °C og 5 % CO2 for at sikre de korrekte forhold i live-celle-billeddanneren under eksperimentet.</li>
</ol>5. Billed- og dataanalyse
<ol><li>Fletning og komprimering af data<ol><li>Live-cell imager Control-softwaren genererer en mappe for hver scanning på hvert tidspunkt. Opret en ny mappe, kopiér de enkelte eksperimentmapper til denne nye overordnede mappe, og føj _0h, _24h, _48h, _72h, _96h og _120h til de tilsvarende eksperimentmappenavne.</li>
		<li>Forbered et XLSX-pladekort fra den digitale lægemiddeldispenserstyringssoftware ved at højreklikke på pladekortlayoutet fra lægemiddeldispenseringsprotokollen og kopier alle brøndene; indsæt dataene i en XLSX-fil. Fjern Cytotox Green og staurosporin data og tilføj en matrix for cellelinje og replikate. Indtast ctrl- og ctrl+. Se supplerende fil 10 for et eksempel på pladekort.</li>
		<li>Åbn datakomprimeringsværktøjet, klik på Gennemse, vælg den overordnede mappe, og klik på Kør for at starte billeddatakomprimering. Alle TIFF-billedfiler for de forskellige tidspunkter komprimeres til en enkelt HDF5 for hver brønd i en ny datasætmappe i den overordnede mappe.</li>
	</ol></li>
	<li>Billedanalyse<ol><li>Gå til billedanalysewebapp-platformen, log ind, og klik på Tilføj nyt projekt på fanen Hjem . Angiv projektnavnet, fortsæt, vælg Tilføj nyt eksperiment, og upload mappen datasæt, der indeholder HDF5-filerne.</li>
		<li>Efter upload skal du gå til projekt - og eksperimentmappen og klikke på Upload Platemap for yderligere funktioner. Klik på Kør analyse, vælg Multiorganoidanalyse, Standardparametre, og klik på Analysér for at starte billedanalyse.</li>
		<li>Klik på Download resultater for at downloade de rå datatabeller, der indeholder målingerne for hver brønd (f.eks. Samlet lysstyrkeareal, samlet fluorescensgrønt område osv.) og de segmenterede billeder/videoer for at bekræfte nøjagtigheden af analysen og yderligere databehandling.</li>
	</ol></li>
	<li>Vækstratebaserede lægemiddelresponsmålinger og normaliseret lægemiddelrespons<ol><li>Vælg Raw_NDR.xlsx-filen fra resultatmappen (pladeoversigt påkrævet) (supplerende fil 11), og indlæs den i Official_NDR_7point R-script (supplerende fil 12) for automatisk at generere GR (normaliseret til ctrl-) og NDR (normaliseret til ctrl- og ctrl+) værditabeller (supplerende fil 13, supplerende fil 14, supplerende fil 15 og supplerende fil 16 ). GR- og NDR-værdier beregnes ud fra parameteren som vist i ligning (1) ved hjælp af R-scriptet (supplerende fil 12). Samlet overlevelsesområde = Samlet Brightfield-område - Samlet grønt område (1) Hvor 0 < NDR <1 = cytostatisk virkning (vækststop), og NDR < 0 = cytotoksisk respons (celledød). BEMÆRK: R-scriptet blev tilpasset fra Gupta et al.6.</li>
		<li>Fra clonal_data.xlsx-tabellen skal du hente enkeltorganoidresponsdata og plotte dem som et bobleplot.</li>
		<li>Brug Z-faktor10 til at vurdere lægemiddelskærmens kvalitet af et løb (se ligning (2)). Kassér et eksperiment med en Z-faktor < 0,5. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64434/64434eq01.jpg" style="margin: auto;">(2)</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Veninga, V., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+organoids:+Opportunities+and+challenges+to+guide+precision+medicine.">Tumor organoids: Opportunities and challenges to guide precision medicine.</a> Cancer Cell. 39 (9), 1190-1201 (2021).</li><li>Le Compte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+as+individual+patient+models+for+chemoradiation+response+prediction+in+gastrointestinal+malignancies.">Patient-derived organoids as individual patient models for chemoradiation response prediction in gastrointestinal malignancies.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 157, 103190 (2021).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li><li>Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+inhibition+metrics+correct+for+confounders+in+measuring+sensitivity+to+cancer+drugs.">Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs.</a> Nature Methods. 13 (6), 521-527 (2016).</li><li>Gupta, A., Gautam, P., Wennerberg, K., Aittokallio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+normalized+drug+response+metric+improves+accuracy+and+consistency+of+anticancer+drug+sensitivity+quantification+in+cell-based+screening.">A normalized drug response metric improves accuracy and consistency of anticancer drug sensitivity quantification in cell-based screening.</a> Communications Biology. 3 (1), 42 (2020).</li><li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+organoids:+a+bright+future+ahead.">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li><li>Deben, C., Cardenas, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrBITS:+label-free+and+time-lapse+monitoring+of+patient+derived+organoids+for+advanced+drug+screening.">OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening.</a> Cellular Oncology. , (2022).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> Bioessays. 39 (8), (2017).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Engel, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+colorectal+cancer+organoids+upregulate+revival+stem+cell+marker+genes+following+chemotherapeutic+treatment.">Patient-derived colorectal cancer organoids upregulate revival stem cell marker genes following chemotherapeutic treatment.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (1), 128 (2020).</li><li>Hennig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+drug+resistance+in+pancreatic+cancer+organoids+guides+optimized+chemotherapy+treatment.">Detecting drug resistance in pancreatic cancer organoids guides optimized chemotherapy treatment.</a> The Journal of Pathology. 257 (5), 607-619 (2022).</li><li>D'Alterio, C., Scala, S., Sozzi, G., Roz, L., Bertolini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+effects+of+chemotherapy+on+tumor+relapse+and+metastasis+promotion.">Paradoxical effects of chemotherapy on tumor relapse and metastasis promotion.</a> Seminars in Cancer Biology. 60, 351-361 (2020).</li><li>Njoroge, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+model+distinct+Vitamin+E+effects+at+different+stages+of+prostate+cancer+evolution.">Organoids model distinct Vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).</li><li>Godet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate-mapping+post-hypoxic+tumor+cells+reveals+a+ROS-resistant+phenotype+that+promotes+metastasis.">Fate-mapping post-hypoxic tumor cells reveals a ROS-resistant phenotype that promotes metastasis.</a> Nature Communications. 10 (1), 4862 (2019).</li><li>Letai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+precision+cancer+medicine-moving+beyond+pure+genomics.">Functional precision cancer medicine-moving beyond pure genomics.</a> Nature Medicine. 23 (9), 1028-1035 (2017).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Medium til høj gennemstrømning PDTO-lægemiddelscreening er ofte afhængig af udlæsninger, der kun udtrækker en brøkdel af information, som organoider potentielt kan give. Det er blevet mere og mere klart, at for at den hurtigt udviklende organoidteknologi kan realisere større videnskabeligt og klinisk potentiale, er mere avancerede 3D-assays, aflæsninger og analysemetoder kritisk påkrævet. Her beskrives en avanceret screeningspipeline, som ikke kun øger reproducerbarheden, men også forbedrer den kliniske oversættelighed betydeligt ved at inkorporere en AI-drevet, live-celle-billeddannelsesaflæsning. Ud over analysesoftware, der er udviklet internt, implementeres brugen af den normaliserede lægemiddelresponsmetrik (NDR), hvilket tydeligt demonstrerer dens evne til at definere patientspecifikke forskelle i behandlingsrespons6. 
Inkluderingen af denne normaliseringsmetrik vil utvivlsomt være af enorm værdi, idet det erindres, at adskillige undersøgelser sigter mod at afgrænse behandlingsrespons baseret på mindre forskelle i areal under kurven (AUC) eller halvmaksimal hæmmende koncentration (IC50) (da de fleste dosis-responskurver overlapper hinanden/er placeret tæt på hinanden)11,12 . Væksthastighedsmålinger er allerede implementeret i screeningsprotokoller for organoidlægemidler ved hjælp af det ATP-baserede assay, men er afhængige af normalisering af referencebrønde lyseret på tidspunktet 04. I modsætning hertil tillader denne metode normalisering af intrawells væksthastighed, som ikke kun tegner sig for interpatientforskelle i PDTO-væksthastighed, men også interwell-forskelle som følge af variationer i såtæthed og pladeplaceringsafhængige virkninger for at øge reproducerbarheden. Desuden tilpassede vi NDR for yderligere at øge adskillelsen af interpatient PDTO-respons ved at inkludere en positiv kontrol for normalisering 6,8.
Desuden kan analysen, som er kompatibel med high-throughput og automatiseringsformater, nøjagtigt detektere individuelle organoidresponser, hvilket muliggør kvantificering af subklonal resistens - den største drivkraft for tumortilbagefald og progression13. For eksempel, selvom PDAC052 og PDAC060 viste et godt respons på behandlingen in vitro (baseret på NDR), var den yderligere enkeltorganoidanalyse i stand til at detektere en lille (større population med PDAC060) population af subkloner, der ikke reagerer på behandlingen. Interessant nok svarede dette meget til den kliniske observation, da PDAC052 og PDAC060 havde et varigt respons (ingen tumoraktivitet detekteret), men til sidst begge blev diagnosticeret med lokal tumorprogression (på grund af tilstedeværelsen af resistente kloner). Sammenlignet med de konventionelle 3D-aflæsninger (ATP-baseret analyse og størrelse/tal) forventes denne avancerede screeningspipeline at øge den prædiktive ydeevne ved at udtrække mere klinisk relevant information ud af disse 'patienter-i-laboratoriet'. Denne hypotese testes nu ved screening af kliniske PDTO-prøver i forfatternes laboratorium med denne metode for at korrelere ex vivo med in vivo-respons og klinisk resultat. 
For at opnå mere indsigt i mekanismerne for et lægemiddelrespons er konventionelle fluorescerende levende cellebilleddannelsesreagenser ud over cytotoksicitetsfarvestoffer kompatible med denne metode til at studere mekanismer for celledød. Vi har tidligere vist kompatibiliteten af denne metode med Sartorius Caspase 3/7 Green Reagens til undersøgelse af caspaseafhængig induktion af apoptose efter cisplatinbehandling8. Kompatibiliteten med andre farvestoffer til undersøgelse af oxidativ stress (CellROX-reagenser) eller hypoxi (Image-iT Hypoxi-reagenser) skal stadig testes. Imidlertid er disse reagenser allerede med succes blevet anvendt i 3D in vitro-modeller 14,15.
Billedanalysesoftwaren er også kompatibel med andre pladeformater eller dyrkningsmetoder (f.eks. Mikrokavitetsplader, ECM-kupler), hvis der kan tages klare billeder i fokus af organoiderne. Dette er ofte udfordrende for organoider, der dyrkes i kupler, da de vokser i forskellige z-planer, hvilket kræver z-stablingsfunktionalitet i mikroskopet, der ikke altid er tilgængelig. Derfor anbefaler vi brugen af fladbundede ULA 384-brønds mikroplader for at sikre billeder af tilstrækkelig kvalitet. 
Derudover er analysen kompatibel med andre live-celle-billeddannelsessystemer, som tidligere vist for fasekontrastbilleder taget med et IncuCyte ZOOM-system8. En begrænsning af Spark Cyto live-cellebilleddannelsessystemet, der blev brugt i dette manuskript, er enpladekapaciteten til kinetiske målinger. Spark Motion-udvidelsen øger dog sin kapacitet til op til 40 mikroplader, der kan screenes i bulk. Kompatibiliteten af den software, der udvikles internt, vil blive udvidet til disse og andre systemer for at tilbyde en platformagnostisk løsning med det formål at standardisere og automatisere billed- og dataanalyserørledninger. Den webbaserede applikation vil også omfatte interaktive grafværktøjer og automatiserede lægemiddelmetriske beregninger, som vist i dette papir, for at reducere manuel analysetid.
Den etiketfri PDTO-segmenteringsalgoritme blev trænet og testet på forskellige internt dyrkede sfæroid- og PDTO-modeller med forskellige morfologiske forskelle (fast, halvfast, cystisk) og kan derfor detektere disse med høj nøjagtighed8. En begrænsning af modellen er, at inkluderingen af cystiske PDTO'er øgede den uønskede påvisning af bobler, der var til stede i brønden efter såning. Imidlertid var inkubation natten over tilstrækkelig til at fjerne de fleste af disse bobler, hvilket muliggjorde en kvalitativ tidspunkt 0-scanning. Nøjagtigheden af organoidbilledsegmenteringen og metoden skal valideres af andre brugere, og baseret på deres feedback kan softwaren trænes yderligere for at opnå en robust og automatiseret billedanalysealgoritme. Derudover sigter vi mod at opnå flere kliniske data for at korrelere ex vivo-lægemiddelresponset kvantificeret ved denne metode til det kliniske respons hos patienten for at identificere de bedste parametre til at forudsige behandlingsrespons og videreudvikle denne metode til funktionel præcisionskræftmedicin16.

I de senere år har in vitro kræftlægemiddelopdagelse, lægemiddelscreening og grundforskning skiftet fra brugen af traditionelle todimensionelle (2D) kræftmodeller med udødeliggjorte cellelinjer til mere fysiologisk relevante tredimensionelle (3D) kræftmodeller. Dette har ansporet vedtagelsen af tumorsfæroider med etablerede kræftcellelinjer, som genskaber mere komplekse celle-til-celle-interaktioner og strukturer, der findes i solide tumorer. I øjeblikket er patientafledte tumororganoider (PDTO'er) den mest avancerede og fysiologisk relevante 3D-kræftmodel, der er tilgængelig til in vitro-kræftforskning , da de giver yderligere fordele i forhold til tumorsfæroider, nemlig heterogeniteten, der findes hos kræftpatienter1. PDTO'er etableres fra tumorvæv, der stammer fra kræftpatienter, og bevarer derfor både tumorfænotypen og genotypen. Som sådan bliver PDTO'er uvurderlige for grundlæggende og translationel kræftforskning og har potentialet til i høj grad at forbedre præcisionsonkologi2. 
På trods af deres lovende potentiale er disse sofistikerede 3D in vitro-kræftmodeller ofte underudnyttet på grund af mangel på avancerede analysemetoder. Det mest almindeligt anvendte assay bestemmer antallet af levedygtige celler i PDTO via kvantificering af intracellulær ATP3. Disse analyser er normalt enkelttids-, bulkanalyser, hvorved kritiske tidsafhængige svar overses og klonale responser forsømmes. Specifikt er evnen til at overvåge væksten af PDTO'er (vækstrate) og deres respons på specifikke terapier af høj interesse 4,5. Det normaliserede lægemiddelrespons (NDR), som scorer lægemiddelrespons baseret på vækstraten normaliseret til en positiv (ctrl +) og negativ kontrol (ctrl-) tilstand, er også for nylig blevet rapporteret at være en afgørende måling til evaluering af kræftlægemiddelfølsomhed med cellebaseret screening, selvom dette overvejende blev gjort for 2D-cellelinjer6. Derfor er der behov for mere sofistikerede analysemetoder for fuldt ud at drage fordel af disse mere klinisk repræsentative og komplekse 3D-kræftmodeller. Mikroskopi betragtes som en stærk tilgang til at studere kompleksiteten af disse organoidmodeller7.
Dette papir beskriver en metode til overvågning af kinetiske lægemiddelresponser i 3D-kræftmodeller ved hjælp af konventionelle widefield-mikroskoper og levende cellebilleddannelsessystemer. Der blev foretaget tilpasninger af protokollen beskrevet af Driehuis et al.4 for at være kompatibel med automatisering ved hjælp af en pipetteringsrobot, digital lægemiddeldispenser og levende cellebilleddannelsessystem for at øge reproducerbarheden og reducere antallet af 'hands-on' arbejdstimer. Denne metode muliggør medium til høj gennemstrømning lægemiddelscreening af både tumorsfæroider med etablerede kræftcellelinjer (se supplerende tabel S1 for testede cellelinjer) såvel som PDTO'erne i et 384-brønds mikroplade- og multiorganoidformat. Ved at bruge en convolutional netværksmaskinlæringsproces kunne automatiseret identifikation og sporing af individuelle tumorsfæroider eller PDTO'er udføres udelukkende fra brightfield-billeddannelse og uden brug af fluorescerende levende cellemærkningsfarvestoffer8. Dette er yderst fordelagtigt, da de fleste identifikation med brightfield-billeddannelse kræver manuel annotering (hvilket er besværligt og tidskrævende) eller kræver tilsætning af fluorescerende farvestoffer, som kan forvirre lægemiddelresponser relateret til fotoksicitetsinduceret oxidativt stress9.
Den resulterende billedanalysesoftware, der er udviklet internt, udvider funktionaliteten af konventionelle live-cellebilleddannelsessystemer, da 3D-billedanalysemoduler enten ikke er tilgængelige, platformbegrænsede eller ikke er kompatible med 384-brønds mikroplader og helbrøndsbilleddannelse. Derudover er disse moduler ofte meget dyre og tilbyder begrænsede organoidaflæsninger. Derfor er denne metode yderst relevant for forskere, der har adgang til bredt tilgængelige levende cellebilleddannelsessystemer og sigter mod at udtrække mere information om et lægemiddelrespons sammenlignet med guldstandarden, men rudimentært ATP-baseret assay. Med tilføjelsen af specifikke celledødsindikatorer kan cytostatiske lægemiddelresponser skelnes fra cytotoksiske reaktioner, hvilket giver yderligere indsigt i mekanistiske lægemiddelhandlinger, der i øjeblikket ikke kan opnås fra enkeltpunktsanalyse. Endelig giver levende cellebilleddannelse mulighed for individuel organoidsporing for at opnå enkeltorganoid lægemiddelresponsmålinger for at fange responsheterogenitet og identificere potentielle resistente subkloner.
Målet med denne metode og den tilhørende billedanalysesoftware er at implementere billig automatisering i organoid lægemiddelscreening for at begrænse brugerintervention og reducere variabilitet i håndtering, billedanalyse og dataanalyse. For at gøre denne software tilgængelig for forskere er den mikroskop- og platformagnostisk, og en skybaseret applikation stilles til rådighed. Ved at understøtte konventionelle levende cellebilleddannelsessystemer sigter vi således også mod at forbedre deres funktionalitet til 3D-dyrkningsapplikationer og -analyser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel p300 (GEN 2) pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom ULA microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4588</td>
			<td>minimum volume 50 &#181;L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom ULA Phenoplate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6057802</td>
			<td>minimum volume 75 &#181;L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A8301</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADF+++</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Advanced DMEM/F12, 1% GlutaMAX, 1% HEPES, 1% penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe easy sealing membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z380059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase 3/7 Green&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Slides for TC10/TC20</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1450017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td>ATP-assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler for 25 mL reservoir</td>
			<td>VWR (Diversified Biotech)</td>
			<td>490006-908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling element 12 x 8 x 3 cm</td>
			<td>Bol.com</td>
			<td>9200000107744702</td>
			<td>For custom microplate holder OT-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Organoid Harvesting Solution</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3700-100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2&#160;</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotox Green</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotox Red</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300e</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Digital drug dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300e Control v3.3.5</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Control software D300e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ADF+++ supplemented with 0.5 nM WNT surrogate-Fc-Fusion protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium, 4% Rpso3-Fc Fusion Protein conditioned medium, 1x B27, 1 mM N-acetyl cysteine (NAC), 5 mM nicotinamide, 500 nM A83-01, 100 ng/mL FGF10, and 10 nM Gastrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemcitabine</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) patient-derived organoids</td>
			<td>Biobank@uza (Antwerp, Belgium; ID: BE71030031000; Belgian Virtual Tumorbank funded by the National Cancer Plan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentrons App v6.0.1</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>OT-2 control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentrons Protocol Designer Tool</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>https://designer.opentrons.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbits data compression tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>www.orbits-oncology.com or contact corresponding author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbits image analysis webapp</td>
			<td>University of Antwerp</td>
			<td></td>
			<td>www.orbits-oncology.com or contact corresponding author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Pipetting robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipette 230 mm&#160;</td>
			<td>Novolab</td>
			<td>A33696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peniciline-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspo3-Fc Fusion Protein conditioned medium</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spark Cyto 600</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell imaging and multi-mode platereader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SparkControl v3.1</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Spark Cyto control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 25 mL reservoir</td>
			<td>VWR (Diversified Biotech)</td>
			<td>10141-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T8 plus cassette</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>233360010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT Surrogate-Fc-Fusion protein</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis

Patientafledte tumororganoider (PDTO'er) har et stort løfte om præklinisk og translationel forskning og forudsigelse af patientterapirespons fra ex vivo-lægemiddelscreeninger. Imidlertid fanger nuværende adenosintrifosfat (ATP) -baserede lægemiddelscreeningsassays ikke kompleksiteten af et lægemiddelrespons (cytostatisk eller cytotoksisk) og intratumorheterogenitet, der har vist sig at blive bevaret i PDTO'er på grund af en bulkaflæsning. Levende cellebilleddannelse er et kraftfuldt værktøj til at overvinde dette problem og visualisere lægemiddelresponser mere dybtgående. Imidlertid er billedanalysesoftware ofte ikke tilpasset PDTO'ernes tredimensionalitet, kræver fluorescerende levedygtighedsfarvestoffer eller er ikke kompatibel med et 384-brønds mikropladeformat. Dette papir beskriver en semi-automatiseret metode til såning, behandling og billede af PDTO'er i et højkapacitetsformat med 384 brønde ved hjælp af konventionelle, widefield, live-cellebilleddannelsessystemer. Derudover udviklede vi software til billedanalyse uden levedygtighedsmarkører til at kvantificere væksthastighedsbaserede lægemiddelresponsmålinger, der forbedrer reproducerbarheden og korrigerer væksthastighedsvariationer mellem forskellige PDTO-linjer. Ved hjælp af den normaliserede lægemiddelresponsmetrik, som scorer lægemiddelrespons baseret på væksthastigheden normaliseret til en positiv og negativ kontroltilstand, og et fluorescerende celledødsfarvestof, kan cytotoksiske og cytostatiske lægemiddelresponser let skelnes, hvilket dybt forbedrer klassificeringen af respondenter og ikke-respondenter. Derudover kan lægemiddelresponsheterogenitet kvantificeres fra enkeltorganoid lægemiddelresponsanalyse for at identificere potentielle, resistente kloner. I sidste ende sigter denne metode mod at forbedre forudsigelsen af klinisk terapirespons ved at fange en multiparametrisk lægemiddelresponssignatur, som inkluderer kinetisk vækststop og kvantificering af celledød.

Den automatiserede pipetteringsprotokol sikrer en jævn fordeling af PDAC_060 PDTO'er i alle kolonnerne i mikropladen med 384 brønde (figur 2A). Som forventet blev der observeret en variation i antallet og det gennemsnitlige areal af PDTO'er mellem brøndene (figur 2A,B). Det samlede overlevelsesområde (samlet brightfield-areal - totalt grønt område) kombinerer den etiketfrie organoidsegmentering med det fluorescensbaserede celledødssignal og er efter vores erfaring den mest robuste parameter til at studere lægemiddelresponser over tid (figur 2C)8. For at tage højde for variationer i cellesåning og organoidstørrelse bør væksthastighedsbaserede målinger anvendes til at reducere variationer mellem replikater, som vist ved de reducerede fejlbjælker i figur 2D versus figur 2C og en højere Z-faktor, der indikerer en stærkt forbedret lægemiddelskærmkvalitet (figur 2E).
NDR-dosis-responskurven (figur 2G), normaliseret til ctrl- og ctrl+, er klart bedre end GR-dosis-responskurven (figur 2F), normaliseret til ctrl-, da den øger adskillelsen af lægemiddelresponskurverne og mere præcist repræsenterer cytotoksiske lægemiddelresponser. Et eksempel på de tilknyttede billeder for ctrl-, ctrl+ og 400 nM gemcitabin/80 nM paclitaxel-behandlet PDTO er vist i figur 3. En interessant observation er, at gemcitabins cytotoksiske virkning var dominerende i kombinationsbehandlingen, da der ikke blev observeret nogen merværdi af paclitaxel.
Dernæst blev der brugt to yderligere PDTO-linjer, PDAC_052 og PDAC_087. Der blev observeret en klar forskel i væksthastigheden mellem disse linjer (figur 4A), hvilket understøtter brugen af GR-målinger. Igen resulterede NDR-dosis-responskurver (figur 4C) i et øget dynamisk område og adskillelse mellem de tre forskellige patienter sammenlignet med GR-kurverne (figur 4B). Desuden giver protokollen mulighed for bestemmelse af NDR over tid og viser, at PDAC_052 og PDAC_060 havde et meget lignende cytostatisk lægemiddelrespons på en lav dosis gem-pac (figur 4D), mens et klart differentielt cytostatisk versus cytotoksisk respons kunne observeres for de midterste (figur 4E) og høje doser (figur 4F) af gem-pac. Disse lægemiddelresponser var i overensstemmelse med det kliniske respons, der blev observeret hos patienterne (figur 4G).
Endelig er en stor fordel ved tilgangen og softwaren, at enkeltorganoide lægemiddelresponser kan kvantificeres for at studere responsheterogenitet og identificere potentielt resistente subkloner. Figur 5 giver et klart overblik over de forskellige patienters klonale dynamik og viser, at PDAC-087 havde de mest resistente subkloner efter behandling, hvilket er i overensstemmelse med den aggressive og meget resistente sygdom, der blev observeret hos patienten. Interessant nok var denne patient også den mindst følsomme over for ctrl+ staurosporin.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig01.jpg"> Figur 1: Oversigt over arbejdsgang. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig02v2.jpg"> Figur 2: Seeding nøjagtighed og drug response metrics . (A) Organoidtællinger/brønd for PDAC_060 PDTO'er podet i en mikroplade med 384 brønde ved hjælp af pipetteringsrobotten. Hver prik repræsenterer antallet i en enkelt brønd, og plottene adskilles af mikropladekolonnerne med 384 brønde. (B) Gennemsnitlig PDTO-areal/brønd. (C) Samlet overlevelsesareal (samlet brightfieldareal - samlet grønt areal) og (D) væksthastighed (samlet overlevelsesareal normaliseret til T0 = 1) af PDAC_060 PDTO'er behandlet med et 5:1-forhold mellem gemcitabin og paclitaxel. E) Z-faktor som målestok for analysekvalitet. (F) Væksthastighed-dosis-responskurve normaliseret til ctrl- og (G) normaliseret lægemiddelresponskurve normaliseret til ctrl- og ctrl+. Fejlbjælker angiver gennemsnitlig ± SD for to brønde. Forkortelser: PDAC = pancreas ductal adenocarcinom; PDTO = patientafledt tumororganoid; GR = vækstrate; NDR = normaliseret lægemiddelrespons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig02largev2.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig03.jpg"> Figur 3: Eksempler på billeder. Repræsentative billeder af PDAC_060 PDTO behandlet med vehikel (ctrl-), 400 nM gemcitabin/80 nM paclitaxel og 2 μM staurosporin (ctrl+). Den venstre kolonne viser brightfield-billeder, den midterste kolonne viser Cytotox Green-fluorescerende signal, og den højre kolonne viser de etiketfrie kommenterede brightfield-billeder ved hjælp af organoidanalysemodulet. Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: PDAC = pancreas ductal adenocarcinom; PDTO = patientafledt tumororganoid; GemPac = gemcitabin/paclitaxel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig04.jpg"> Figur 4: Sammenligning af lægemiddelrespons mellem patienter. (A) Sammenligning af væksthastighed (baseret på det samlede overlevelsesareal) for PDAC_052, PDAC_060 og PDAC_087 PDTO-linjer. (B) Vækstrate-dosis-responskurve normaliseret til ctrl- og (C) normaliseret lægemiddelresponskurve normaliseret til ctrl- og ctrl+. Kinetisk NDR af en (D) lav, (E) mellem og (F) høj dosis gemcitabin/paclitaxel (5:1 forhold). G) PDAC-patienters kliniske karakteristika. Fejlbjælker angiver gennemsnitlig ± SD for to brønde. Forkortelser: PDAC = pancreas ductal adenocarcinom; PDTO = patientafledt tumororganoid; GR = vækstrate; NDR = normaliseret lægemiddelrespons; FFX = folfirinox. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig05.jpg"> Figur 5: Enkelte organoidmålinger. Respons med enkelt organoid dosis baseret på celledød (grønt område/brightfield-område) og areal (brightfield) af PDAC_052, PDAC_060 og PDAC_087 PDTO'er behandlet med vehikel (ctrl-), 400 nM gemcitabin/80 nM paclitaxel og 2 μM staurosporin (ctrl+). Grønne regioner angiver levedygtige organoider; blå områder angiver x-as-området for GemPac- og ctrl+-plots. Forkortelser: PDAC = pancreas ductal adenocarcinom; PDTO = patientafledt tumororganoid; GemPac = gemcitabin/paclitaxel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Cellesuspensionsmateriale</td>
			<td>Celler/fald</td>
			<td># Dråber (20 μL)</td>
			<td>Lager (1/3)</td>
			<td>ECM (2/3)</td>
		</tr><tr><td>1,13 × 107 celler/ml</td>
			<td>75,000</td>
			<td>10</td>
			<td>75 uL</td>
			<td>150 μL</td>
		</tr><tr><td>1,13 × 107 celler/ml</td>
			<td>75,000</td>
			<td>5</td>
			<td>40 uL</td>
			<td>80 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Fortynding til plettering i ECM-kupler. Forkortelse: ECM = ekstracellulær matrix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Forbindelse</td>
			<td>Lagerkoncentration</td>
			<td>Fortynding</td>
			<td>Arbejdskoncentration</td>
			<td>Opløsningsmiddel</td>
			<td>Godt koncentration</td>
			<td>Kommentarer</td>
		</tr><tr><td>Cytotox Grøn</td>
			<td>1 mM (DMSO)</td>
			<td>1/10</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>60 nM</td>
			<td>Celledødsmarkør</td>
		</tr><tr><td>Cytotox rød</td>
			<td>1 mM (DMSO)</td>
			<td>1/10</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>250 nM</td>
			<td>Celledødsmarkør</td>
		</tr><tr><td>Caspase 3/7 Grøn</td>
			<td>5 mM (DMSO)</td>
			<td>1/2</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>2,5 μM</td>
			<td>Apoptotisk markør</td>
		</tr><tr><td>Hoechst</td>
			<td>20 mM (H2O)</td>
			<td>1/200</td>
			<td>100 μM</td>
			<td>0,33% Tween/PBS</td>
			<td>50 nM</td>
			<td>Nuklear markør</td>
		</tr><tr><td>Staurosporin</td>
			<td>10 mM (DMSO)</td>
			<td>/</td>
			<td>1 - 10 mM</td>
			<td>/</td>
			<td>2 – 5 μM</td>
			<td>Positiv kontrol</td>
		</tr><tr><td>Gemcitabin</td>
			<td>10 mM (DMSO)</td>
			<td>/</td>
			<td>1 - 10 mM</td>
			<td>/</td>
			<td>Titrering</td>
			<td>Kemoterapi</td>
		</tr><tr><td>Paclitaxel</td>
			<td>10 mM (DMSO)</td>
			<td>/</td>
			<td>1 - 10 mM</td>
			<td>/</td>
			<td>Titrering</td>
			<td>Kemoterapi</td>
		</tr><tr><td>Cisplatin</td>
			<td>5 mM (0,9% NaCl)</td>
			<td>1/2</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td>0,6% Tween/PBS</td>
			<td>Titrering</td>
			<td>Kemoterapi</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Eksempel på fortyndinger af hyppigt anvendte lægemidler og fluorescerende reagenser. Hver forbindelse skal opløses i enten 100% DMSO eller 0,3% Tween/PBS.
Supplerende tabel S1: Oversigt over kompatible kræftcellelinjer. Statisk: sfæroider er ikke migrerende. Flet: sfæroider migrerer mod hinanden og smelter sammen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434_SuppTableS1%20(1).xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 1: Beregningsværktøj til organoid såopløsning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%201.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 2: STL-fil til 3D-udskrivning brugerdefineret labware 'Microplate Holder'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%202.stl" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 3: STL-fil til 3D-udskrivning brugerdefineret labware '2 x 25 ml reservoirholder'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%203.stl" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 4: JSON-fil til brugerdefineret labware pipetteringsrobot 'Microplate Holder'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%204.json" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 5: JSON-fil til brugerdefineret labware pipetting robot '2 x 25 ml Reservoir Holder_WithCooler'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%205.json" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 6: JSON-fil til pipetteringsrobotprotokol 'Plating_ PDO_384well_Cooled_Row2-23'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%206.json" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 7: Oversigt over opsætning af pipetteringsrobotbord. (A) Køleelementer og (B) reservoir og mikroplade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%207.png" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 8: TDD-fil til protokol for den digitale lægemiddeldispenser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%208.tdd" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 9: XML-fil til protokol for live-cell imager til brightfield og fluorescensbilleddannelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%209.xml" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 10: Eksempel på pladekort. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2010.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 11: Eksempel på inputfil til NDR R-script. Forkortelse: NDR = normaliseret lægemiddelrespons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2011.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 12: Normaliseret lægemiddelrespons NDR R-script. Forkortelse: NDR = normaliseret lægemiddelrespons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2012.R" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 13: Eksempel på outputfil med NDR R-script GR-værdier. Forkortelser: GR = vækstrate; NDR = normaliseret lægemiddelrespons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2013.csv" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 14: Eksempel på outputfil af NDR R-script med GR-værdier transponeret. Forkortelser: GR = vækstrate; NDR = normaliseret lægemiddelrespons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2014.csv" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
S upplementary File 15: Eksempel på outputfil med NDR R-script NDR-værdier. Forkortelse: NDR = normaliseret lægemiddelrespons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2015.csv" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 16: Eksempel på outputfil for NDR R-script med NDR-værdier transponeret. Forkortelse: NDR = normaliseret lægemiddelrespons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2016.csv" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis at JoVE.com

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Denne protokol beskriver en semi-automatiseret metode til medium- til high-throughput organoid drug screenings og mikroskop-agnostisk, automatiseret billedanalyse software til kvantificering og visualisering af multiparametriske, enkeltorganoide lægemiddelresponser til at fange intratumor heterogenitet.

Multiparametrisk tumororganoid lægemiddelscreening ved hjælp af widefield levende cellebilleddannelse til bulk- og enkeltorganoidanalyse

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Denne protokol vil give forskere mulighed for ikke kun at strømline deres analysepipeline, men det vil også give dem mulighed for at udtrække mere information ud af deres organoidstrøm og derved øge translationel relevans. Den største fordel ved denne protokol er, at den kombinerer en strømlinet arbejdsgang med en automatiseret og klinisk relevant analysepipeline, hvilket gør det muligt for forskere at få en overbevisende mængde information ud af en enkelt organoid skærm. Denne teknik kan bruges til at forudsige klinisk behandlingsrespons for kræftpatienter fra disse ex vivo organoid lægemiddelscreeninger med meget lovende tidlige resultater.Målet er at gøre softwareløsningsplatformen agnostisk, så forskere kan bruge et live-celle-billeddannelsesinstrument, der er tilgængeligt for dem. Begynd med enzymatisk dissociering af de patientafledte tumororganoider eller PDTO'er i den ekstracellulære matrix eller ECM, kupler i mikropladen med seks brønde. Til dette skal du først aspirere mediet og vaske ECM-kuplerne en gang med PBS.Derefter tilsættes to ml af dissociationsenzymet i brønden. Pipetter indholdet op og ned 10 gange ved hjælp af en milliliter pipette til mekanisk dissociering af organoiderne i kuplerne, før pladen inkuberes i 10 minutter ved 37 grader Celsius. Efter inkubation pipetteres indholdet op og ned, og kontroller for korrekt dissociation af organoiderne til enkeltceller ved hjælp af et mikroskop.Cellesuspensionen opsamles i et 15 ml glas, og volumen op til 10 ml tilsættes ADF + centrifuger røret ved 450 g i fem minutter ved stuetemperatur, og sug supernatanten ved hjælp af en Pasteur-pipette og sugepumpe. Resuspender pellet i 100 til 200 mikroliter af det fulde pancreas ductal adenocarcinom eller PDAC, organoid kulturmedium afhængigt af pelletens størrelse, før antallet af celler tælles ved hjælp af en valgt metode. For at plade enkeltcellerne i ECM-kupler fortyndes den passende mængde cellesuspension ved at tilsætte den nødvendige mængde optøet ECM.Derefter pipetteres op til 10 dråber på 20 mikroliter pr. brønd i en plade med seks brønde, der er forvarmet til 37 grader Celsius. Vend pladen og inkuber i 30 minutter ved 37 grader Celsius. Derefter overlejres brøndene med det fulde medium suppleret med 10-mikromolær Y-27632 og inkuberes i to til tre dage i en inkubator.For at høste de to til tre dage gamle organoider skal du først aspirere mediet og vaske organoiderne en gang med PBS. Derefter tilsættes en til to milliliter organoidhøstningsopløsning, forkølet til fire grader Celsius, til en brønd på seksbrøndpladen afhængigt af antallet af ECM-kupler. Inkuber pladen holdt på is på en rysteplatform i 10 minutter.Afbryd nu ECM-kuplerne ved at pipettere indholdet i brøndene op og ned med en milliliter pipette. Endnu en gang inkuberes organoiderne i 10 minutter på is, før de visuelt bekræfter dissociationen af ECM-kuplerne under et mikroskop. Saml organoiderne i et 15 ml rør, forbelagt med 0,1% BSA i PBS, og fyld op til 10 ml ved at tilsætte ADF + centrifuger røret ved 200 g i fem minutter ved fire grader Celsius.Derefter aspireres supernatanten, og pellet resuspenderes afhængigt af dens størrelse i op til en milliliter fuldt PDAC-organoidmedium til den ønskede endelige organoidkoncentration. Åbn pipetteringsrobotstyringsapplikationen, vælg Protokoller, og klik på Importer, før du trækker og slipper den medfølgende supplerende fil 6 i det angivne felt. Vælg den importerede protokol.Og i henhold til layoutet vist i feltet Deck Setup skal du placere alt labware, inklusive køleelementer og plastvarer, i dækkene. Brug den venstre åbning til 25 ml reservoiret og køleelementet. Klik derefter på Kør protokol og fortsæt til opsætning.Åbn fanen Labware-opsætning, klik på Kør Labware-positionskontrol, og følg instruktionerne for at kalibrere pipetteringsrobotten til den nye hardware. Fyld 25 ml reservoiret, der er placeret oven på køleelementet, med den afkølede organoidsåningsopløsning, og klik på Start Kør for at sætte pipetteringsrobotten i gang. Derefter centrifugeres mikropladen med en hastighed på 100 g i et minut ved fire grader Celsius.For at oprette lægemiddeludleveringsprotokollen ved hjælp af den digitale lægemiddeldispenserstyringssoftware skal du holde markøren over plade 1 over pladelayoutet. Vælg Rediger pladeattributter, og udfyld pladetypen som 384 brønd, den ekstra volumen som 50 mikroliter og DMSO-grænsen som 1%Tilføj væsker ved at klikke på additionsknappen ved siden af Væsker, og dobbeltklik på den nyoprettede væske for at navngive den. Vælg derefter klassen som DMSO-baseret eller vandig plus Tween 20, og udfyld koncentrationen.For at oprette pladelayoutet til lægemiddeltitrering skal du vælge Wells og klikke på Titrering. For væske skal du vælge lægemidlet af interesse sammen med den ønskede højeste koncentration og laveste koncentration. For replikater skal du vælge mindst to og vælge det ønskede titreringsmønster.For at oprette pladelayoutet til den positive kontrol skal du vælge tre huller, klikke på Indstil værdi og udfylde to-mikromolær staurosporin fra en 10-millimolær bestand i DMSO for at fremkalde maksimal celledød. For Cytotox Green skal du vælge alle de brugte brønde, klikke på Indstil værdi og indtaste en værdi på 60 nanomolær pr. Brønd. For negativ kontrol og DMSO-normalisering skal du vælge alle brønde med yderligere fire brønde til køretøjsstyringen.Højreklik nu og vælg Normalisering, før du tildeler den normaliserede væskeklasse som DMSO-baseret. Normaliser derefter til det højeste klassevolumen for at opnå en lige DMSO-koncentration i hver brønd. Klik derefter på pilen under Kør i øverste venstre hjørne, og vælg Simuler altid, efterfulgt af at klikke på Simuler for at identificere eventuelle fejl og få mængderne af hvert lægemiddel, der skal fremstilles.Fjern nu markeringen af Simuler altid under knappen Kør, før du klikker på Kør for at starte lægemiddeldispenseringsprotokollen, og følg instruktionerne. Påfør tætningsmembranen på mikropladen for at forhindre fordampning. Åbn live-cell imager-kontrolsoftwaren, og vælg Method Editor New, før du går til File for at importere eksempelmetoden XML-fil.Du kan også følge instruktionerne i manuskriptet for at oprette en ny fil. Klik derefter på Start for at starte scanningen ved T0.To flette og komprimere dataene, oprette en ny overordnet mappe til overførsel af alle de individuelle eksperimentmapper, der genereres for hver scanning på hvert tidspunkt af live-cell imager-kontrolsoftwaren, og navngiv de respektive mapper ved at følge instruktionerne i manuskriptet. Forbered et XLSX-pladekort i den digitale lægemiddeldispenserstyringssoftware ved at højreklikke på pladekortlayoutet fra lægemiddeldispenseringsprotokollen og kopiere alle brøndene for at indsætte dataene i en XLSX-fil.Fjern Cytotox Green og staurosporin data, tilføj en matrix for cellelinje, og indtast en negativ kontrol og positiv kontrol. Åbn datakomprimeringsværktøjet. Klik på Søg, vælg den overordnede mappe, og klik på Komprimer for at starte komprimering af billeddata.Alle TIFF-billedfiler komprimeres til en enkelt HDF5 for hver brønd i en ny datasætmappe i den overordnede mappe. For at analysere billederne skal du gå til billedanalysewebappplatformen, logge ind og klikke på Tilføj nyt projekt på fanen Hjem. Angiv projektnavnet, tryk på Fortsæt, og vælg Tilføj nyt eksperiment, før du uploader mappen datasæt, der indeholder HDF5-filerne.Efter upload skal du gå til projekt- og eksperimentmappen for at klikke på Upload pladekort for yderligere funktioner. Klik derefter sekventielt på Kør analyse, vælg Multiorganoidanalyse, Standardparametre og til sidst Analysér for at starte billedanalyse. Klik på Download resultater for at downloade de rå datatabeller, som indeholder målingerne for hver brønd og de segmenterede billeder eller videoer, før du bekræfter nøjagtigheden af analysen til yderligere databehandling.For at tage højde for variationerne i organoid såtæthed og størrelse blev væksthastighedsbaserede målinger brugt til at reducere variationer mellem replikaterne, som angivet med de reducerede fejlbjælker. Billederne for den negative kontrol, den positive kontrol og den kombinerede gemcitabin og paclitaxel-behandlede PDTO viste, at terapien overvejende inducerede vækststop med en begrænset mængde celledød, svarende til normaliseret lægemiddelrespons eller NDR-værdi lige under nul. Ved brug af to yderligere linjer, PDAC_052 og PDAC_087, blev der observeret en klar forskel i væksthastigheden mellem de tre linjer, hvilket understøtter brugen af GR-målinger.NDR-dosis-responskurverne resulterede i et øget dynamisk område og adskillelse mellem de tre forskellige patienter sammenlignet med GR-kurverne. Bestemmelse af NDR over tid viste, at PDAC_052 og PDAC_060 havde et meget ens cytostatisk lægemiddelrespons på en lav dosis gemcitabin-paclitaxel, mens et klart differentialcytostatisk versus cytotoksisk respons kunne observeres for de tilsvarende mellem- og høje doser. Disse lægemiddelresponser var i overensstemmelse med det kliniske respons, der blev observeret hos patienterne.Den klonale dynamik afslørede, at PDAC_087 havde de mest resistente subkloner efter behandling, hvilket er i overensstemmelse med sygdommens aggressive karakter observeret hos patienten, som interessant nok også var den mindst følsomme over for den positive kontrol staurosporin. Det vigtigste aspekt af protokollen er at holde alle opløsninger, der indeholder ECM, afkølet under såningen, fordi forkert størkning af ECM kan forstyrre downstream-billedanalysen. Automatiseringen af vådlaboratoriearbejdet, billedanalysen og downstream-databehandlingen kan være nyttige til at fremskynde forskningen og lettere identificere nye kombinationsbehandlinger.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Enkel og hurtig metode til at opnå høj kvalitet Tumor DNA fra klinisk-patologisk prøvemateriale ved hjælp af Touch aftryk cytologi

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionukleid-fluorescens Reporter gen Imaging for at spore Tumor Progression i gnavere Tumor modeller

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generation af høj overførselshastighed tredimensionale Tumor Spheroids for narkotika-Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging Assays til undersøgelse glioblastom hjerne Tumor stamcelle Migration og Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

Analyse af kræft celle Invasion og anti-metastatisk stof Screening ved hjælp af Hydrogel mikro-kammer Array (HMCA)-baseret plader

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

En simpel Migration/Invasion arbejdsgang ved hjælp af en automatiseret Live-celle Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Etablering og karakterisering af små tarm neuroendokrine tumor Sfæroider

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

En roman Stromal Fibroblast-Moduleret 3D Tumor Spheroid Model for at studere Tumor-Stroma Interaktion og Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening af primære patient afledt tumor xenografts i Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...