Name: multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis
Uploaded: 2022-12-23T13:50:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis at JoVE.com

Een deel van dit onderzoek werd gefinancierd door giften van verschillende donateurs, waaronder Dedert Schilde vzw en de heer Willy Floren. Dit werk wordt gedeeltelijk gefinancierd door de Vlaamse Stichting voor Onderzoek, 12S9221N (A.L.), G044420N (S.V., A.L., E.G), 1S27021N (M.L.), en door het Fonds voor Industrieel Onderzoek van de Universiteit Antwerpen, PS ID 45151 (S.V., A.L., C.D.). Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.

Humaan pancreas ductaal adenocarcinoom (PDAC) patiënt-afgeleide organoïden werden gebruikt. Weefselresectiefragmenten werden verkregen van patiënten die een curatieve operatie ondergingen in het Universitair Ziekenhuis Antwerpen. Van alle patiënten werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen en de studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van het UZA (ref. 14/47/480). Details met betrekking tot alle materialen, reagentia, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt, worden verstrekt in de tabel met materialen. Een overzicht van de workflow is weergegeven in figuur 1. Voorbeeldgegevens worden verstrekt in het aanvullende materiaal om het protocol te reproduceren.
1. Dag 0: Bereiding van 2- of 3-daagse organoïden
<ol><li>Verwarm de microplaten een nacht voor op 37 °C en ontdooi de extracellulaire matrix (ECU) bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid volledig PDAC organoïde kweekmedium voor: supplement ADF +++ (Advanced DMEM / F12, 1% glutaminesupplement, 1% HEPES en 1% penicilline / streptomycine) met 0,5 nM WNT surrogaat-Fc-Fusion-eiwit, 4% Noggin-Fc Fusion Protein geconditioneerd medium, 4% Rpso3-Fc Fusion Protein geconditioneerd medium, 1x B27, 1 mM N-acetylcysteïne (NAC), 5 mM nicotinamide, 500 nM A83-01, 100 ng / ml FGF10 en 10 nM Gastrin).</li>
	<li>Stel de PDTO's vast volgens de gewenste methode. OPMERKING: Een gedetailleerd protocol wordt verstrekt door Driehuis et al., waarin de conventionele methode wordt beschreven om PDO's in ECM-koepels vast te stellen, te kweken en te passeren4.</li>
	<li>Dissociëer de organoïden in ECM-koepels enzymatisch.<ol><li>Aspirateer het medium en was 1x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg dissociatie-enzym toe (bijv. 2 ml in een 6-well microplaat) en pipet 10x op en neer met een pipet van 1 ml om de organoïden en ECM-koepels mechanisch te dissociëren.</li>
		<li>Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C, pipetteer op en neer en controleer of de organoïden zijn gedissocieerd tot afzonderlijke cellen. Herhaal deze stap indien nodig.</li>
		<li>Verzamel de celsuspensie in een buis van 15 ml, voeg ADF +++ toe aan een volume van 10 ml, centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 × g bij kamertemperatuur en aspirateer het supernatant met een Pasteur-pipet en zuigpomp.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet in 100-200 μL vol medium, afhankelijk van de grootte van de pellet en tel het aantal cellen met behulp van de methode van keuze. Bijvoorbeeld: meng 10 μL van de celsuspensie + 10 μL Trypan Blue en tel met een geautomatiseerde celteller.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaat enkele cellen in ECM domes.<ol><li>Verdun de celsuspensie en voeg 2/3 ECU toe volgens tabel 1. Pipetteer tot tien druppeltjes van 20 μL per putje in een voorverwarmde 6-well plaat. Keer de plaat om en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.</li>
		<li>Overlay met volledig medium aangevuld met 10 μM Y-27632 en incubeer gedurende 2-3 dagen in een incubator. OPMERKING: Tien koepels met elk 75.000 cellen zijn meestal voldoende om één 384-well microplaat te vullen in een concentratie van 200 organoïden / put, exclusief de putten aan de rand.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Dag 2 - 3: Oogst en zaai 2- of 3-dagen oude organoïden
<ol><li>Verzamel intacte organoïden uit de ECM-koepels. OPMERKING: Organoïden hebben de neiging om aan plastic oppervlakken te kleven (bijv. Buizen, pipetpunten). Om dit te voorkomen, kan plasticware worden voorgeurineerd met een 0,1% runderserumalbumine (BSA) / PBS-oplossing.<ol><li>Aspirateer het medium en was 1x met PBS. Voeg 1-2 ml koude (4 °C) organoïde oogstoplossing toe aan een 6-wellsplaat, afhankelijk van het aantal ECM-koepels en incubeer op ijs op een schudplatform gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Pipetteer op en neer met een pipet van 1 ml om de ECM-koepels te dissociëren, nog eens 10 minuten op ijs te incuberen en visueel onder een microscoop te controleren of de ECU is gedissocieerd.</li>
		<li>Optioneel: als een meer uniforme maatverdeling de voorkeur heeft, filtert u de suspensie door een celzeef van 70 μm vóór centrifugatie.</li>
		<li>Verzamel de organoïden in een buis van 15 ml, voorgecoat met 0,1% BSA/PBS, voeg ADF+++ toe tot 10 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 × g bij 4 °C. Adem het supernatant aan en resuspendeer de pellet in maximaal 1.000 μL volledig PDAC organoïde medium, afhankelijk van de grootte van de pellet om een concentratie van >6.000 organoïden / ml te verkrijgen.</li>
		<li>Tel de organoïden met behulp van een telmethode naar keuze, bij voorkeur een op afbeeldingen gebaseerde methode.</li>
	</ol></li>
	<li>Zaai de organoïden. OPMERKING: Zie de tabel met materialen voor het minimumvolume/putje voor twee verschillende typen microplaten met 384 putten die in dit protocol worden gebruikt.<ol><li>Koel al het plastic materiaal voor op -20 °C of op ijs gedurende ten minste 20 minuten voor gebruik om stolling van de ECU te voorkomen.</li>
		<li>Bereid de zaaioplossing uit de 1 ml organoïde stamoplossing (stap 2.1.6) met behulp van volledig medium om ~ 200 organoïden per put in 50 μL te zaaien, het minimale volume dat wordt gebruikt om een put te vullen. Gebruik aanvullend bestand 1 om de hoeveelheid organoïde zaaioplossing te berekenen. Voeg een restvolume van 1.500 μL toe bij gebruik van een reservoir van 25 ml en een meerkanaals pipet of pipetteerrobot.</li>
		<li>Zaai de organoïden met behulp van een pipetteerrobot. OPMERKING: Zowel de zaaioplossing als de microplaat moeten tijdens het pipetteren bij 4 °C worden gekoeld om stolling van de ECU te voorkomen. Daarom werden een reservoir van 25 ml en een microplaathouder 3D-geprint om te worden gebruikt in combinatie met de pipetteerrobot die koelelementen kan bevatten die in de materiaaltabel zijn opgenomen. STL-bestanden voor het 3D-printen van de aangepaste labware (aanvullend bestand 2 en aanvullend bestand 3) en aangepaste labware JSON-bestanden voor de pipetteerrobot (aanvullend bestand 4 en aanvullend bestand 5) worden verstrekt.<ol><li>Ontwerp het afgifteprotocol met behulp van de online Protocol Designer Tool. Er wordt een voorbeeld JSON-bestand (Supplementary File 6) verstrekt, waarin de aangepaste labware al is geladen en een achtkanaals p300 (Gen2) pipet met bijbehorende pipetpunten wordt gebruikt.</li>
			<li>Open de pipetteerrobotbesturingsapp, selecteer protocollen, klik op Importeren en sleep aanvullend bestand 6 naar het daarvoor bestemde veld.</li>
			<li>Selecteer het geïmporteerde protocol en plaats alle labware, inclusief koelelementen en plasticware, in de decks volgens de lay-out die wordt weergegeven in het veld Deck Setup . Gebruik de linkersleuf voor het reservoir en het koelelement van 25 ml, zoals weergegeven in aanvullend bestand 7.</li>
			<li>Klik op Protocol uitvoeren en ga verder met instellen. Open het tabblad Labware Setup, klik op Labware Position Check uitvoeren en volg de instructies om de pipetteerrobot te kalibreren naar de nieuwe hardware. OPMERKING: Labware-offsetgegevens kunnen worden opgeslagen voor later, maar het wordt aanbevolen om de labware-positiecontrole vóór elke run uit te voeren.</li>
			<li>Vul het reservoir van 25 ml (bovenop het koelelement geplaatst) met de gekoelde organoïde zaaioplossing en klik op Start Run. OPMERKING: De bovenste en onderste putten worden ook gevuld met organoïde suspensieoplossing door het gebruik van de achtkanaals pipet.</li>
			<li>Centrifugeer de microplaat gedurende 1 minuut bij 100 × g bij 4 °C.</li>
			<li>Incubeer bij 37 °C gedurende ten minste 30 min.</li>
			<li>Vul de buitenste lege putten met ten minste 50 μL H2O om verdamping te voorkomen.</li>
			<li>Incubeer 's nachts bij 37 °C om eventuele bubbels in de put te verwijderen die de beeldanalyse kunnen verstoren.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. Dag 4: Drugsbehandeling en reagens afzien van digitale medicijndispenser
<ol><li>Maak het medicijndoseringsprotocol met behulp van de digitale besturingssoftware voor medicijndispensers.<ol><li>Plaats de muisaanwijzer op Plaat 1 boven de plaatindeling, selecteer plaatkenmerken bewerken en vul het plaattype in: 384 put, extra volume (μL): 50 en DMSO-limiet (%): 1.</li>
		<li>Voeg vloeistoffen toe door op de knop + naast Vloeistoffen te klikken. Dubbelklik op de nieuw gemaakte vloeistof en geef deze een naam; selecteer klasse (DMSO-gebaseerd of waterig+Tween 20) en concentratie. OPMERKING: Alle geneesmiddelen en reagentia moeten worden opgelost in 100% DMSO of 0,3% Tween-20. Een voorraadoplossing van 1-10 mM kan worden gebruikt, rekening houdend met een maximale DMSO-concentratie van < 1%. Tabel 2 geeft voorbeelden van de vereiste verdunningen voor gangbare fluorescerende reagentia en therapieën.</li>
		<li>Plaat lay-out<ol><li>Voor medicijntitratie selecteert u putten en klikt u op Titratie. Selecteer voor vloeistof het medicijn van belang, kies de hoogste concentratie (bijv. 2.000 nM) en de laagste concentratie (bijv. 10 nM); kies voor replica's minimaal 2 en kies het gewenste titratiepatroon. OPMERKING: Het titratiepatroon hangt af van vele factoren, waaronder hoeveel verbinding in een enkele plaat moet worden geplaatst, of de putten moeten worden gerandomiseerd en het aantal replicaties en controles.</li>
			<li>Voor de positieve controle selecteert u drie putten, klikt u op Waarde instellen en vult u 2 μM staurosporine in uit 10 mM voorraad in DMSO, wat maximale celdood zal veroorzaken.</li>
			<li>Selecteer voor Cytotox Green alle gebruikte putten, klik op Waarde instellen en voer 60 nM/put in. OPMERKING: De Cytotox Green fluorescerende kleuring geeft cellen aan die zijn afgestorven en zal daarom niet interfereren met de monitoring van de geneesmiddelrespons. Hier is geen fluorescerende marker voor levende cellen vereist.</li>
			<li>Voor de negatieve controle en DMSO-normalisatie selecteert u alle putten met nog eens vier putjes voor de voertuigbesturing, klikt u met de rechtermuisknop, selecteert u normalisatie, selecteert u de vloeistofklasse normaliseren: dmso-gebaseerd en normaliseert u naar het volume van de hoogste klasse om een gelijke DMSO-concentratie in elke put te verkrijgen. OPMERKING: DMSO-concentraties moeten <1% zijn. Een voorbeeld TDD-titratiedossier (aanvullend dossier 8) wordt verstrekt.</li>
			<li>Klik op de pijl onder Uitvoeren in de linkerbovenhoek, selecteer Altijd simuleren en klik op Simuleren om eventuele fouten te identificeren en de volumes van elk te bereiden medicijn te verkrijgen. OPMERKING: Om een waarschuwing te overwinnen wanneer het initiële doseervolume te laag is, "Dispense Warning well van 30 nL of meer wordt aanbevolen voor elke vloeistof op elke plaat", selecteert u twee putjes aan de rand die zijn gevuld met water, selecteert u Set Value en voert u 10 μM in van het geneesmiddel waarvoor de waarschuwing optreedt. Dit primeert de medicijncartridge met een volume hoger dan 30 nL. Deze zelfde putjes kunnen worden gebruikt om de DMSO-cartridge te primen door een normalisatie in te stellen op % van de totale volumewaarde (bijv. 0,5%).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Verwijder het vinkje bij Altijd simuleren onder de knop Uitvoeren ; klik op Uitvoeren om het medicijndoseringsprotocol te starten en volg de instructies.</li>
	<li>Breng het afdichtingsmembraan aan op de microplaat om verdamping te voorkomen.</li>
	<li>Incubeer de Cytotox Green kleurstof 1-2 uur bij 37 °C in de incubator en ga verder met stap 4.</li>
</ol>4. Verkrijg afbeeldingen met de live-cell imager
OPMERKING: Voor de groeisnelheid en NDR moet een scan op tijdstip 0 (T0 = start de behandeling) 1-2 uur na toevoeging van Cytotox Green worden verkregen.
<ol><li>Open de besturingssoftware voor live-cell imager, selecteer Method Editor New, ga naar bestand > importeren en selecteer het XML-bestand met de voorbeeldmethode (aanvullend bestand 9). U kunt ook een nieuw bestand maken en Plaat selecteren: (CORE384fb_OpticalImaging) - Corning 384 Flat Black (Corning #4588), Geen deksel en Geen vochtigheidscassette; Toepassing: Alleen afbeeldingen; Doel: 4x; Patroon: Centraal; Controleer kanalen Brightfield en Green (Led intensiteit (%) = 40; Belichtingstijd (ms) = 200). OPMERKING: De groene kanaalinstellingen werken goed voor een concentratie van 60 nM Cytotox Green. De live viewer optie kan worden gebruikt om de focus offset en/of de led instellingen in real time aan te passen.</li>
	<li>Klik op Start om het scannen op T0 te starten.</li>
	<li>Herhaal de scan elke 24 uur gedurende maximaal 5 dagen met dezelfde methode. Als u de time-lapse-meting automatisch wilt uitvoeren, past u de methode in de live-cell imager Control-software aan op een kinetisch experiment door op het tabblad Kinetic Loop te klikken en deze naar het methodeveld te slepen. Evenzo moeten de tabbladen Temperatuur en Gas naar het methodeveld worden gesleept om het systeem in te stellen op 37 °C en 5% CO2 om de juiste omstandigheden in de levende celbeeldcamera tijdens het experiment te garanderen.</li>
</ol>5. Beeld- en data-analyse
<ol><li>Gegevens samenvoegen en comprimeren<ol><li>De live-cell imager Control-software genereert een map voor elke scan op elk tijdstip. Maak een nieuwe map, kopieer de afzonderlijke experimentmappen naar deze nieuwe bovenliggende map en voeg _0h, _24h, _48h, _72h, _96h en _120h toe aan de bijbehorende namen van de experimentmap.</li>
		<li>Bereid een XLSX-plaatkaart voor vanuit de digitale medicijndispenser Besturingssoftware door met de rechtermuisknop op de lay-out van de plaatkaart te klikken vanuit het medicijndoseringsprotocol en kopieer alle putten; plak de gegevens in een XLSX-bestand. Verwijder Cytotox Green en staurosporine gegevens en voeg een matrix toe voor Cell Line en Replicate. Voer ctrl- en ctrl+ in. Zie Aanvullend bestand 10 voor een voorbeeldplaatkaart.</li>
		<li>Open de Data Compression Tool, klik op Bladeren, selecteer de bovenliggende map en klik op Uitvoeren om de compressie van afbeeldingsgegevens te starten. Alle TIFF-afbeeldingsbestanden voor de verschillende tijdstippen worden gecomprimeerd tot één HDF5 voor elke put in een nieuwe map met gegevenssets in de map met ouderlijk toezicht.</li>
	</ol></li>
	<li>Beeldanalyse<ol><li>Ga naar het webapp-platform voor beeldanalyse, log in en klik op Nieuw project toevoegen op het tabblad Start . Voer de projectnaam in, ga verder, selecteer Nieuw experiment toevoegen en upload de map met gegevenssets met de HDF5-bestanden.</li>
		<li>Ga na het uploaden naar de project- en experimentmap en klik op Platemap uploaden voor extra functionaliteiten. Klik op Analyse uitvoeren, selecteer Multi-organoïde analyse, Standaardparameters en klik op Analyseren om de beeldanalyse te starten.</li>
		<li>Klik op Resultaten downloaden om de onbewerkte gegevenstabellen te downloaden die de metingen voor elke put bevatten (bijv. Totaal brightfield-gebied, totaal fluorescentiegroen gebied, enz.) en de gesegmenteerde afbeeldingen / video's om de nauwkeurigheid van de analyse en verdere gegevensverwerking te bevestigen.</li>
	</ol></li>
	<li>Op groeisnelheid gebaseerde geneesmiddelresponsstatistieken en genormaliseerde geneesmiddelrespons<ol><li>Selecteer het Raw_NDR.xlsx bestand in de resultatenmap (plaattoewijzing vereist) (aanvullend bestand 11) en laad dit in het Official_NDR_7point R-script (aanvullend bestand 12) om automatisch GR (genormaliseerd naar ctrl-) en NDR (genormaliseerd naar ctrl- en ctrl +) waardetabellen (aanvullend bestand 13, aanvullend bestand 14, aanvullend bestand 15 en aanvullend bestand 16) te genereren ). GR- en NDR-waarden worden berekend op basis van de parameter zoals weergegeven in vergelijking (1) met behulp van het R-script (aanvullend bestand 12). Total Survival Area = Total Brightfield Area - Total Green Area (1) Waarbij 0 < NDR <1 = cytostatisch effect (groeistilstand) en NDR < 0 = cytotoxische respons (celdood). OPMERKING: Het R-schrift is aangepast van Gupta et al.6.</li>
		<li>Haal uit de tabel met clonal_data.xlsx single-organoïde responsgegevens op en plot ze als een bubbelplot.</li>
		<li>Gebruik de Z-factor10 om de medicijnscreeningkwaliteit van een run te beoordelen (zie vergelijking (2)). Een experiment met een Z-factor < 0,5. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64434/64434eq01.jpg" style="margin: auto;">(2)</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Veninga, V., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+organoids:+Opportunities+and+challenges+to+guide+precision+medicine.">Tumor organoids: Opportunities and challenges to guide precision medicine.</a> Cancer Cell. 39 (9), 1190-1201 (2021).</li><li>Le Compte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+as+individual+patient+models+for+chemoradiation+response+prediction+in+gastrointestinal+malignancies.">Patient-derived organoids as individual patient models for chemoradiation response prediction in gastrointestinal malignancies.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 157, 103190 (2021).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li><li>Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+inhibition+metrics+correct+for+confounders+in+measuring+sensitivity+to+cancer+drugs.">Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs.</a> Nature Methods. 13 (6), 521-527 (2016).</li><li>Gupta, A., Gautam, P., Wennerberg, K., Aittokallio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+normalized+drug+response+metric+improves+accuracy+and+consistency+of+anticancer+drug+sensitivity+quantification+in+cell-based+screening.">A normalized drug response metric improves accuracy and consistency of anticancer drug sensitivity quantification in cell-based screening.</a> Communications Biology. 3 (1), 42 (2020).</li><li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+organoids:+a+bright+future+ahead.">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li><li>Deben, C., Cardenas, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrBITS:+label-free+and+time-lapse+monitoring+of+patient+derived+organoids+for+advanced+drug+screening.">OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening.</a> Cellular Oncology. , (2022).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> Bioessays. 39 (8), (2017).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Engel, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+colorectal+cancer+organoids+upregulate+revival+stem+cell+marker+genes+following+chemotherapeutic+treatment.">Patient-derived colorectal cancer organoids upregulate revival stem cell marker genes following chemotherapeutic treatment.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (1), 128 (2020).</li><li>Hennig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+drug+resistance+in+pancreatic+cancer+organoids+guides+optimized+chemotherapy+treatment.">Detecting drug resistance in pancreatic cancer organoids guides optimized chemotherapy treatment.</a> The Journal of Pathology. 257 (5), 607-619 (2022).</li><li>D'Alterio, C., Scala, S., Sozzi, G., Roz, L., Bertolini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+effects+of+chemotherapy+on+tumor+relapse+and+metastasis+promotion.">Paradoxical effects of chemotherapy on tumor relapse and metastasis promotion.</a> Seminars in Cancer Biology. 60, 351-361 (2020).</li><li>Njoroge, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+model+distinct+Vitamin+E+effects+at+different+stages+of+prostate+cancer+evolution.">Organoids model distinct Vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).</li><li>Godet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate-mapping+post-hypoxic+tumor+cells+reveals+a+ROS-resistant+phenotype+that+promotes+metastasis.">Fate-mapping post-hypoxic tumor cells reveals a ROS-resistant phenotype that promotes metastasis.</a> Nature Communications. 10 (1), 4862 (2019).</li><li>Letai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+precision+cancer+medicine-moving+beyond+pure+genomics.">Functional precision cancer medicine-moving beyond pure genomics.</a> Nature Medicine. 23 (9), 1028-1035 (2017).</li></ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Pdto-geneesmiddelenscreening met gemiddelde tot hoge doorvoer is vaak afhankelijk van uitlezingen die slechts een fractie van de informatie extraheren die organoïden mogelijk kunnen bieden. Het is steeds duidelijker geworden dat, om de snel evoluerende organoïde technologie een groter wetenschappelijk en klinisch potentieel te laten realiseren, meer geavanceerde 3D-testen, uitlezingen en analysemethoden van cruciaal belang zijn. Hier wordt een geavanceerde screeningspijplijn beschreven, die niet alleen de reproduceerbaarheid verhoogt, maar ook de klinische vertaalbaarheid aanzienlijk verbetert door een AI-gestuurde, live-cell imaging-uitlezing op te nemen. Naast de in eigen huis ontwikkelde analysesoftware wordt het gebruik van de genormaliseerde drug response metric (NDR) geïmplementeerd, wat duidelijk aantoont dat het in staat is om patiëntspecifieke verschillen in behandelingsresponste definiëren 6. 
De opname van deze normalisatiemaatstaf zal ongetwijfeld van enorme waarde zijn, eraan herinnerend dat talrijke studies gericht zijn op het afbakenen van behandelingsresponsen op basis van kleine verschillen in gebied onder de curve (AUC) of half-maximale remmende concentratie (IC50) (aangezien de meeste dosis-responscurven elkaar overlappen / dicht bij elkaar bevinden)11,12 . Groeisnelheidsstatistieken zijn al geïmplementeerd in organoïde medicijnscreeningprotocollen met behulp van de ATP-gebaseerde test, maar vertrouwen op de normalisatie van referentieputten die op tijdstip 04 zijn gelyseerd. Daarentegen maakt deze methode intrawell-groeisnelheidsnormalisatie mogelijk, wat niet alleen rekening houdt met interpatiente verschillen in PDTO-groeisnelheid, maar ook interwell-verschillen als gevolg van variaties in zaaidichtheid en plaatlocatieafhankelijke effecten om de reproduceerbaarheid te vergroten. Bovendien hebben we de NDR aangepast om de scheiding van interpatlinische PDTO-respons verder te vergroten door een positieve controle voor normalisatieop te nemen 6,8.
Bovendien kan de analyse, die compatibel is met high-throughput en automatiseringsformaten, individuele organoïde reacties nauwkeurig detecteren, waardoor de kwantificering van subklonale resistentie mogelijk wordt - de belangrijkste drijvende kracht achter tumorrecidieven en progressie13. Hoewel PDAC052 en PDAC060 bijvoorbeeld een goede respons op de behandeling in vitro vertoonden (gebaseerd op de NDR), was de aanvullende single-organoïde analyse in staat om een kleine (grotere populatie met PDAC060) populatie van subclonen te detecteren die niet reageren op de behandeling. Interessant is dat dit sterk overeenkwam met de klinische observatie, gezien het feit dat PDAC052 en PDAC060 een duurzame respons hadden (geen tumoractiviteit gedetecteerd) maar uiteindelijk beide werden gediagnosticeerd met lokale tumorprogressie (vanwege de aanwezigheid van resistente klonen). In vergelijking met de conventionele 3D-uitlezingen (ATP-gebaseerde test en grootte / cijfers), wordt verwacht dat deze geavanceerde screeningspijplijn de voorspellende prestaties zal verhogen door meer klinisch relevante informatie uit deze 'patiënten-in-het-laboratorium' te extraheren. Deze hypothese wordt nu getest door klinische PDTO-monsters in het laboratorium van de auteurs te screenen met deze methode om ex vivo te correleren met in vivo respons en klinische uitkomst. 
Om meer inzicht te krijgen in de mechanismen van een geneesmiddelrespons, zijn conventionele fluorescerende levende celbeeldvormende reagentia, naast cytotoxiciteitskleurstoffen, compatibel met deze methode om mechanismen van celdood te bestuderen. We hebben eerder de compatibiliteit van deze methode met het Sartorius Caspase 3/7 Green Reagens aangetoond om caspase-afhankelijke inductie van apoptose na cisplatinebehandelingte bestuderen 8. De compatibiliteit met andere kleurstoffen voor het bestuderen van oxidatieve stress (CellROX-reagentia) of hypoxie (Image-iT Hypoxie-reagentia) moet nog worden getest. Deze reagentia zijn echter al met succes gebruikt in 3D in vitro modellen14,15.
De beeldanalysesoftware is ook compatibel met andere plaatformaten of kweekmethoden (bijv. Microcavity-platen, ECM-koepels) als duidelijke, onscherpe beelden van de organoïden kunnen worden vastgelegd. Dit is vaak een uitdaging voor organoïden gekweekt in koepels, omdat ze in verschillende z-vlakken groeien, wat z-stacking-functionaliteit van de microscoop vereist die niet altijd beschikbaar is. Daarom adviseren wij het gebruik van platte ULA 384-well microplaten om beelden van voldoende kwaliteit te garanderen. 
Bovendien is de analyse compatibel met andere live-cell imaging-systemen, zoals eerder werd getoond voor fasecontrastbeelden die zijn vastgelegd met een IncuCyte ZOOM-systeem8. Een beperking van het Spark Cyto live-cell imaging systeem dat in dit manuscript werd gebruikt, is de capaciteit van één plaat voor kinetische metingen. De Spark Motion-uitbreiding verhoogt echter de capaciteit tot maximaal 40 microplaten die in bulk kunnen worden gescreend. De compatibiliteit van de in eigen huis ontwikkelde software zal worden uitgebreid naar deze en andere systemen om een platform-agnostische oplossing te bieden, met als doel beeld- en data-analysepijplijnen te standaardiseren en te automatiseren. De webgebaseerde applicatie zal ook interactieve grafische tools en geautomatiseerde metrische berekeningen van geneesmiddelen bevatten, zoals weergegeven in dit artikel, om de handmatige analysetijd te verkorten.
Het labelvrije PDTO-segmentatiealgoritme werd getraind en getest op verschillende in eigen huis gekweekte sferoïde- en PDTO-modellen met duidelijke morfologische verschillen (solide, halfvast, cystisch) en kan deze bijgevolg met hoge nauwkeurigheid detecteren8. Een beperking van het model is dat de opname van cystische PDO's de ongewenste detectie van bubbels in de put na het zaaien verhoogde. Nachtelijke incubatie was echter voldoende om de meeste van deze bubbels te verwijderen, waardoor een kwalitatieve tijdspunt 0-scan mogelijk was. De nauwkeurigheid van de organoïde beeldsegmentatie en de methode moet door andere gebruikers worden gevalideerd en op basis van hun feedback kan de software verder worden getraind om een robuust en geautomatiseerd beeldanalysealgoritme te verkrijgen. Daarnaast streven we ernaar meer klinische gegevens te verkrijgen om de ex vivo geneesmiddelrespons die door deze methode wordt gekwantificeerd, te correleren met de klinische respons bij de patiënt om de beste parameters te identificeren om de therapierespons te voorspellen en deze methode voor functionele precisiekankergeneeskunde verder te ontwikkelen16.

In de afgelopen jaren zijn in vitro kankergeneesmiddelontdekking, medicijnscreening en fundamenteel onderzoek overgegaan van het gebruik van traditionele tweedimensionale (2D) kankermodellen met onsterfelijke cellijnen naar meer fysiologisch relevante driedimensionale (3D) kankermodellen. Dit heeft de adoptie van tumorsferoïden met gevestigde kankercellijnen gestimuleerd, die complexere cel-tot-cel interacties en structuren in solide tumoren recreëren. Momenteel zijn patiënt-afgeleide tumororganoïden (PDTO's) het meest geavanceerde en fysiologisch relevante 3D-kankermodel dat beschikbaar is voor in vitro kankeronderzoek, omdat ze extra voordelen bieden ten opzichte van tumorsferoïden, namelijk de heterogeniteit die wordt aangetroffen bij kankerpatiënten1. BOBTO's worden vastgesteld op basis van tumorweefsel afkomstig van kankerpatiënten en behouden daarom zowel het tumorfenotype als het genotype. Als zodanig worden PDTO's van onschatbare waarde voor fundamenteel en translationeel kankeronderzoek en hebben ze het potentieel om precisie-oncologie aanzienlijk te verbeteren2. 
Ondanks hun veelbelovende potentieel worden deze geavanceerde 3D in vitro kankermodellen vaak onderbenut door een gebrek aan geavanceerde analysemethoden. De meest gebruikte assay bepaalt het aantal levensvatbare cellen in de PDTO via de kwantificering van intracellulaire ATP3. Deze assays zijn normaal gesproken single-timepoint, bulkanalyses, waardoor kritische tijdsafhankelijke responsen over het hoofd worden gezien en klonale responsen worden verwaarloosd. In het bijzonder is het vermogen om de groei van PDO's (groeisnelheid) en hun reactie op specifieke therapieën te volgen van groot belang 4,5. De genormaliseerde geneesmiddelrespons (NDR), die de geneesmiddelrespons scoort op basis van de groeisnelheid genormaliseerd tot een positieve (ctrl +) en negatieve controle (ctrl-) aandoening, is onlangs ook gemeld als een cruciale maatstaf voor het evalueren van de gevoeligheid van kankergeneesmiddelen met celgebaseerde screening, hoewel dit voornamelijk werd gedaan voor 2D-cellijnen6. Daarom zijn meer geavanceerde analysemethoden nodig om volledig te profiteren van deze meer klinisch representatieve en complexe 3D-kankermodellen. Microscopie wordt beschouwd als een krachtige benadering om de complexiteit van deze organoïde modellen tebestuderen 7.
Dit artikel beschrijft een methode voor het monitoren van kinetische medicijnresponsen in 3D-kankermodellen, met behulp van conventionele widefield microscopen en live-cell imaging-systemen. Er zijn aanpassingen gedaan aan het protocol beschreven door Driehuis et al.4 om compatibel te zijn met automatisering met behulp van een pipetteerrobot, digitale medicijndispenser en live-cell imaging-systeem om de reproduceerbaarheid te vergroten en het aantal 'hands-on' arbeidsuren te verminderen. Deze methode maakt medium- tot high-throughput geneesmiddelenscreening mogelijk van zowel tumorsferoïden met gevestigde kankercellijnen (zie aanvullende tabel S1 voor geteste cellijnen), als de PDTO's, in een 384-well microplaat en multi-organoïde formaat. Door gebruik te maken van een convolutioneel netwerk machine learning-proces, kon geautomatiseerde identificatie en tracking van individuele tumorsferoïden of PDTO's uitsluitend worden uitgevoerd op basis van brightfield-beeldvorming en zonder het gebruik van fluorescerende levendcellige etiketteringskleurstoffen8. Dit is zeer voordelig, omdat de meeste identificatie met brightfield-beeldvorming handmatige annotatie vereist (wat bewerkelijk en tijdrovend is) of de toevoeging van fluorescerende kleurstoffen vereist, die medicijnreacties met betrekking tot door fotoxicity geïnduceerde oxidatieve stress kunnen verstoren9.
De resulterende beeldanalysesoftware die in eigen huis is ontwikkeld, breidt de functionaliteit van conventionele live-cell imaging-systemen uit, omdat 3D-beeldanalysemodules niet beschikbaar, platformbeperkt of niet compatibel zijn met 384-well microplaten en whole-well imaging. Bovendien zijn deze modules vaak hoog geprijsd en bieden ze beperkte bulk organoïde uitlezingen. Daarom is deze methode zeer relevant voor wetenschappers die toegang hebben tot algemeen beschikbare live-cell imaging-systemen en ernaar streven meer informatie over een medicijnrespons te extraheren in vergelijking met de gouden standaard maar rudimentaire ATP-gebaseerde test. Met de toevoeging van specifieke celdoodindicatoren kunnen cytostatische geneesmiddelresponsen worden onderscheiden van cytotoxische responsen, waardoor meer inzicht wordt verkregen in mechanistische geneesmiddelacties die momenteel onbereikbaar zijn uit single-timepoint-analyse. Ten slotte maakt live-cell imaging het mogelijk om individuele organoïde tracking te verkrijgen om single organoid drug response metrics te verkrijgen om respons heterogeniteit vast te leggen en potentiële resistente subclones te identificeren.
Het doel van deze methode en de bijbehorende beeldanalysesoftware is om goedkope automatisering te implementeren in organoïde geneesmiddelenscreening om gebruikersinterventie te beperken en variabiliteit in verwerking, beeldanalyse en gegevensanalyse te verminderen. Om deze software beschikbaar te maken voor onderzoekers, is het microscoop- en platformonafhankelijk en wordt een cloudgebaseerde applicatie beschikbaar gesteld. Door conventionele live-cell imaging-systemen te ondersteunen, willen we dus ook hun functionaliteit voor 3D-kweektoepassingen en -analyse verbeteren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel p300 (GEN 2) pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom ULA microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4588</td>
			<td>minimum volume 50 &#181;L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom ULA Phenoplate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6057802</td>
			<td>minimum volume 75 &#181;L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A8301</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADF+++</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Advanced DMEM/F12, 1% GlutaMAX, 1% HEPES, 1% penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe easy sealing membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z380059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase 3/7 Green&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Slides for TC10/TC20</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1450017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td>ATP-assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler for 25 mL reservoir</td>
			<td>VWR (Diversified Biotech)</td>
			<td>490006-908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling element 12 x 8 x 3 cm</td>
			<td>Bol.com</td>
			<td>9200000107744702</td>
			<td>For custom microplate holder OT-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Organoid Harvesting Solution</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3700-100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2&#160;</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotox Green</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotox Red</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300e</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Digital drug dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300e Control v3.3.5</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Control software D300e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ADF+++ supplemented with 0.5 nM WNT surrogate-Fc-Fusion protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium, 4% Rpso3-Fc Fusion Protein conditioned medium, 1x B27, 1 mM N-acetyl cysteine (NAC), 5 mM nicotinamide, 500 nM A83-01, 100 ng/mL FGF10, and 10 nM Gastrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemcitabine</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) patient-derived organoids</td>
			<td>Biobank@uza (Antwerp, Belgium; ID: BE71030031000; Belgian Virtual Tumorbank funded by the National Cancer Plan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentrons App v6.0.1</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>OT-2 control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentrons Protocol Designer Tool</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>https://designer.opentrons.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbits data compression tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>www.orbits-oncology.com or contact corresponding author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbits image analysis webapp</td>
			<td>University of Antwerp</td>
			<td></td>
			<td>www.orbits-oncology.com or contact corresponding author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Pipetting robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipette 230 mm&#160;</td>
			<td>Novolab</td>
			<td>A33696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peniciline-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspo3-Fc Fusion Protein conditioned medium</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spark Cyto 600</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell imaging and multi-mode platereader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SparkControl v3.1</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Spark Cyto control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 25 mL reservoir</td>
			<td>VWR (Diversified Biotech)</td>
			<td>10141-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T8 plus cassette</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>233360010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT Surrogate-Fc-Fusion protein</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis

Patiënt-afgeleide tumororganoïden (PDTO's) houden een grote belofte in voor preklinisch en translationeel onderzoek en het voorspellen van de respons op patiënttherapie van ex vivo medicijnscreenings. De huidige op adenosinetrifosfaat (ATP) gebaseerde screeningstests voor geneesmiddelen leggen echter niet de complexiteit vast van een geneesmiddelrespons (cytostatisch of cytotoxisch) en intratumorheterogeniteit waarvan is aangetoond dat deze in PDO's wordt behouden als gevolg van een bulkuitlezing. Live-cell imaging is een krachtig hulpmiddel om dit probleem te overwinnen en medicijnreacties diepgaander te visualiseren. Beeldanalysesoftware is echter vaak niet aangepast aan de driedimensionaliteit van PDO's, vereist fluorescerende levensvatbaarheidskleurstoffen of is niet compatibel met een 384-well microplaatformaat. Dit artikel beschrijft een semi-geautomatiseerde methodologie om PDTO's te zaaien, behandelen en af te beelden in een high-throughput, 384-well-formaat met behulp van conventionele, widefield, live-cell imaging-systemen. Daarnaast hebben we levensvatbaarheidsmarkervrije beeldanalysesoftware ontwikkeld om op groeisnelheid gebaseerde geneesmiddelresponsstatistieken te kwantificeren die de reproduceerbaarheid verbeteren en groeisnelheidsvariaties tussen verschillende PDTO-lijnen corrigeren. Met behulp van de genormaliseerde geneesmiddelresponsmaatstaf, die de geneesmiddelrespons scoort op basis van de groeisnelheid genormaliseerd tot een positieve en negatieve controletoestand, en een fluorescerende celdoodkleurstof, kunnen cytotoxische en cytostatische geneesmiddelresponsen gemakkelijk worden onderscheiden, waardoor de classificatie van responders en non-responders aanzienlijk wordt verbeterd. Bovendien kan heterogeniteit van de geneesmiddelrespons worden gekwantificeerd uit single-organoïde geneesmiddelresponsanalyse om potentiële, resistente klonen te identificeren. Uiteindelijk is deze methode bedoeld om de voorspelling van de klinische therapierespons te verbeteren door een multiparametrische medicijnresponssignatuur vast te leggen, waaronder kinetische groeistilstand en celdoodkwantificering.

Het geautomatiseerde pipetteerprotocol zorgt voor een gelijkmatige verdeling van PDAC_060 BOB's in alle kolommen van de 384-well microplaat (figuur 2A). Zoals verwacht werd een variatie in het aantal en de gemiddelde oppervlakte van BOB's waargenomen tussen de putten (figuur 2A,B). Het totale overlevingsgebied (total brightfield area - total green area) combineert de labelvrije organoïde segmentatie met het op fluorescentie gebaseerde celdoodsignaal en is in onze ervaring de meest robuuste parameter om geneesmiddelresponsen in de loop van de tijd te bestuderen (figuur 2C)8. Om rekening te houden met variaties in celzaaien en organoïde grootte, moeten op groeisnelheid gebaseerde statistieken worden gebruikt om variaties tussen replicaties te verminderen, zoals blijkt uit de verminderde foutbalken in figuur 2D versus figuur 2C, en een hogere Z-factor die wijst op een sterk verbeterde kwaliteit van het geneesmiddelenscherm (figuur 2E).
De NDR-dosisresponscurve (figuur 2G), genormaliseerd naar ctrl- en ctrl+, is duidelijk superieur aan de GR-dosis-responscurve (figuur 2F), genormaliseerd naar ctrl-, omdat het de scheiding van de geneesmiddelresponscurven verhoogt en nauwkeuriger cytotoxische geneesmiddelresponsen weergeeft. Een voorbeeld van de bijbehorende afbeeldingen voor ctrl-, ctrl+, en 400 nM gemcitabine/80 nM paclitaxel-behandelde PDTO is weergegeven in figuur 3. Een interessante observatie is dat het cytotoxische effect van gemcitabine dominant was in de combinatietherapie omdat er geen toegevoegde waarde van paclitaxel werd waargenomen.
Vervolgens werden twee extra PDTO-lijnen, PDAC_052 en PDAC_087, gebruikt. Er werd een duidelijk verschil in groeisnelheid tussen deze lijnen waargenomen (figuur 4A), die het gebruik van GR-statistieken ondersteunt. Opnieuw resulteerden NDR-dosisresponscurven (figuur 4C) in een verhoogd dynamisch bereik en scheiding tussen de drie verschillende patiënten in vergelijking met de GR-curven (figuur 4B). Bovendien maakt het protocol de bepaling van NDR in de loop van de tijd mogelijk en toont het aan dat PDAC_052 en PDAC_060 een zeer vergelijkbare cytostatische geneesmiddelrespons hadden als een lage dosis gem-pac (figuur 4D), terwijl een duidelijk differentieel cytostatisch versus cytotoxische respons kon worden waargenomen voor het midden (figuur 4E) en hoge doses (figuur 4F) van gem-pac. Deze geneesmiddelresponsen waren consistent met de klinische responsen die bij de patiënten werden waargenomen (figuur 4G).
Ten slotte is een groot voordeel van de aanpak en software dat single-organoïde geneesmiddelresponsen kunnen worden gekwantificeerd om responsheterogeniteit te bestuderen en potentieel resistente subclonen te identificeren. Figuur 5 geeft een duidelijk overzicht van de klonale dynamiek van de verschillende patiënten en laat zien dat PDAC-087 de meest resistente subclonen had na de behandeling, wat consistent is met de agressieve en zeer resistente ziekte die bij de patiënt werd waargenomen. Interessant is dat deze patiënt ook het minst gevoelig was voor het ctrl+ staurosporine.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig01.jpg"> Figuur 1: Workflow overzicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig02v2.jpg"> Figuur 2: Zaainauwkeurigheid en geneesmiddelresponsmetingen. (A) Organoïde tellingen / put van PDAC_060 PDTO's gezaaid in een 384-well microplaat met behulp van de pipetteerrobot. Elke stip vertegenwoordigt de telling in een enkele put en percelen worden gescheiden door de 384-well microplaatkolommen. (B) Gemiddeld PDTO-gebied/put. (C) Totaal overlevingsgebied (totaal brightfield-gebied - totaal groen gebied) en (D) groeisnelheid (totaal overlevingsgebied genormaliseerd tot T0 = 1) van PDAC_060 PDTO's behandeld met een 5:1-verhouding van gemcitabine/paclitaxel. (E) Z-factor als maatstaf voor de kwaliteit van de test. (F) Groeisnelheid-dosisresponscurve genormaliseerd naar ctrl- en (G) genormaliseerde geneesmiddelresponscurve genormaliseerd naar ctrl- en ctrl +. Foutbalken geven de gemiddelde ± SD van twee putten aan. Afkortingen: PDAC = pancreas ductaal adenocarcinoom; PDTO = van de patiënt afgeleide tumor organoïde; GR = groeisnelheid; NDR = genormaliseerde geneesmiddelrespons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig02largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig03.jpg"> Figuur 3: Voorbeeldafbeeldingen. Representatieve beelden van PDAC_060 PDTO behandeld met vehiculum (ctrl-), 400 nM gemcitabine/80 nM paclitaxel en 2 μM staurosporine (ctrl+). De linkerkolom toont brightfield-afbeeldingen, de middelste kolom toont het Cytotox Green-fluorescentiesignaal en de rechterkolom toont de labelvrije geannoteerde brightfield-afbeeldingen met behulp van de organoïde analysemodule. Schaalstaven = 100 μm. Afkortingen: PDAC = pancreas ductaal adenocarcinoom; PDTO = van de patiënt afgeleide tumor organoïde; GemPac = gemcitabine/paclitaxel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig04.jpg"> Figuur 4: Vergelijking van interpatiënte geneesmiddelrespons. (A) Vergelijking van de groeisnelheid (op basis van het totale overlevingsgebied) van PDAC_052, PDAC_060 en PDAC_087 PDTO-lijnen. (B) Groeisnelheid-dosisresponscurve genormaliseerd naar ctrl- en (C) genormaliseerde geneesmiddelresponscurve genormaliseerd naar ctrl- en ctrl +. Kinetische NDR van een (D) lage, (E) middelste en (F) hoge dosis gemcitabine/paclitaxel (verhouding 5:1). (G) De klinische kenmerken van PDAC-patiënten. Foutbalken geven de gemiddelde ± SD van twee putten aan. Afkortingen: PDAC = pancreas ductaal adenocarcinoom; PDTO = van de patiënt afgeleide tumor organoïde; GR = groeisnelheid; NDR = genormaliseerde geneesmiddelrespons; FFX = folfirinox. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig05.jpg"> Figuur 5: Enkelvoudige organoïde metrieken. Enkelvoudige organoïde dosisrespons op basis van celdood (groen gebied/brightfieldgebied) en gebied (brightfield) van PDAC_052, PDAC_060 en PDAC_087 PDTO's behandeld met vehikel (ctrl-), 400 nM gemcitabine/80 nM paclitaxel en 2 μM staurosporine (ctrl+). Groene regio's duiden op levensvatbare organoïden; blauwe gebieden geven het x-as-bereik van GemPac- en ctrl+-diagrammen aan. Afkortingen: PDAC = pancreas ductaal adenocarcinoom; PDTO = van de patiënt afgeleide tumor organoïde; GemPac = gemcitabine/paclitaxel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Cel suspensie voorraad</td>
			<td>Cellen/Druppel</td>
			<td># Druppels (20 μL)</td>
			<td>Voorraad (1/3)</td>
			<td>Ecu (2/3)</td>
		</tr><tr><td>1,13 × 107 cellen/ml</td>
			<td>75,000</td>
			<td>10</td>
			<td>75 ML</td>
			<td>150 μL</td>
		</tr><tr><td>1,13 × 107 cellen/ml</td>
			<td>75,000</td>
			<td>5</td>
			<td>40 ml</td>
			<td>80 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Verdunning voor beplating in ECM-koepels. Afkorting: ECM = extracellulaire matrix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Verbinding</td>
			<td>Concentratie van de voorraden</td>
			<td>Verdunning</td>
			<td>Werkconcentratie</td>
			<td>Oplosmiddel</td>
			<td>Put concentratie</td>
			<td>Opmerkingen</td>
		</tr><tr><td>Cytotox Groen</td>
			<td>1 mM (DMSO)</td>
			<td>1/10</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>60 nM</td>
			<td>Celdood marker</td>
		</tr><tr><td>Cytotox Rood</td>
			<td>1 mM (DMSO)</td>
			<td>1/10</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>250 nM</td>
			<td>Celdood marker</td>
		</tr><tr><td>Caspase 3/7 Groen</td>
			<td>5 mM (DMSO)</td>
			<td>1/2</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>2,5 μM</td>
			<td>Apoptotische marker</td>
		</tr><tr><td>Hoechst</td>
			<td>20m (H2O)</td>
			<td>1/200</td>
			<td>100 μM</td>
			<td>0,33% tween/PBS</td>
			<td>50 nM</td>
			<td>Nucleaire marker</td>
		</tr><tr><td>Staurosporine</td>
			<td>10 mM (DMSO)</td>
			<td>/</td>
			<td>1 - 10 mM</td>
			<td>/</td>
			<td>2 – 5 μM</td>
			<td>Positieve controle</td>
		</tr><tr><td>Gemcitabine</td>
			<td>10 mM (DMSO)</td>
			<td>/</td>
			<td>1 - 10 mM</td>
			<td>/</td>
			<td>Titratie</td>
			<td>Chemotherapie</td>
		</tr><tr><td>Paclitaxel</td>
			<td>10 mM (DMSO)</td>
			<td>/</td>
			<td>1 - 10 mM</td>
			<td>/</td>
			<td>Titratie</td>
			<td>Chemotherapie</td>
		</tr><tr><td>Cisplatine</td>
			<td>5 mM (0,9% NaCl)</td>
			<td>1/2</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td>0,6% tween/pbs</td>
			<td>Titratie</td>
			<td>Chemotherapie</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Voorbeeldverdunningen van veelgebruikte geneesmiddelen en fluorescerende reagentia. Elke verbinding moet worden opgelost in 100% DMSO of 0,3% Tween / PBS.
Aanvullende tabel S1: Overzicht van compatibele kankercellijnen. Statisch: sferoïden zijn niet migrerend. Samenvoegen: sferoïden migreren naar elkaar toe en smelten samen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434_SuppTableS1%20(1).xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 1: Organoid seeding solution calculation tool. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%201.xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 2: STL-bestand voor 3D-printen van aangepaste labware 'Microplate Holder'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%202.stl" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 3: STL-bestand voor 3D-printen van aangepaste labware '2 x 25 ml reservoirhouder'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%203.stl" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 4: JSON-bestand voor aangepaste labware pipetteerrobot 'Microplate Holder'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%204.json" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 5: JSON-bestand voor aangepaste labware pipetteerrobot '2 x 25 ml reservoir Holder_WithCooler'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%205.json" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 6: JSON-bestand voor pipetteerrobotprotocol 'Plating_ PDO_384well_Cooled_Row2-23'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%206.json" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 7: Overzicht van de pipetteerrobot bureauopstelling. (A) Koelelementen en (B) reservoir en microplaat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%207.png" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend dossier 8: TDD-bestand voor protocol van de digitale medicijndispenser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%208.tdd" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 9: XML-bestand voor protocol van de live-cell imager voor brightfield- en fluorescentiebeeldvorming. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%209.xml" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 10: Voorbeeldplaatkaart. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2010.xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 11: Voorbeeldinvoerbestand voor NDR R-script. Afkorting: NDR = genormaliseerde geneesmiddelrespons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2011.xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 12: Genormaliseerde drug response NDR R script. Afkorting: NDR = genormaliseerde geneesmiddelrespons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2012.R" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 13: Voorbeelduitvoerbestand van GR-waarden van NDR R-script. Afkortingen: GR = groeisnelheid; NDR = genormaliseerde geneesmiddelrespons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2013.csv" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 14: Voorbeelduitvoerbestand van NDR R-script met GR-waarden getransponeerd. Afkortingen: GR = groeisnelheid; NDR = genormaliseerde geneesmiddelrespons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2014.csv" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Upplementary File 15: Voorbeelduitvoerbestand van NDR R-script NDR-waarden. Afkorting: NDR = genormaliseerde geneesmiddelrespons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2015.csv" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 16: Voorbeelduitvoerbestand van NDR R-script met NDR-waarden getransponeerd. Afkorting: NDR = genormaliseerde geneesmiddelrespons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2016.csv" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis at JoVE.com

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Dit protocol beschrijft een semi-geautomatiseerde methode voor medium- tot high-throughput organoïde medicijnscreenings en microscoop-agnostische, geautomatiseerde beeldanalysesoftware om multiparametrische, single-organoïde geneesmiddelresponsen te kwantificeren en te visualiseren om intratumor heterogeniteit vast te leggen.

Multiparametrische tumor organoïde drug screening met behulp van Widefield Live-Cell Imaging voor bulk en single-organoïde analyse

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Dit protocol stelt onderzoekers niet alleen in staat om hun analysepijplijn te stroomlijnen, maar het stelt hen ook in staat om meer informatie uit hun organoïde stroom te halen, waardoor de translationele relevantie wordt verbeterd. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het een gestroomlijnde workflow combineert met een geautomatiseerde en klinisch relevante analysepijplijn, waardoor onderzoekers een overtuigende hoeveelheid informatie uit één enkel organoïde scherm kunnen verkrijgen. Deze techniek kan worden gebruikt om de klinische therapierespons voor kankerpatiënten te voorspellen op basis van deze ex vivo organoïde geneesmiddelenscreenings met veelbelovende vroege resultaten.Het doel is om het softwareoplossingsplatform agnostisch te maken, zodat onderzoekers een live-cell imaging-instrument kunnen gebruiken dat voor hen beschikbaar is. Begin met het enzymatisch dissociëren van de van de patiënt afgeleide tumororganoïden, of PDO's, in de extracellulaire matrix, of ECM, koepels in de zes-well microplaat. Hiervoor aspirateer eerst het medium en was de ECM-koepels eenmaal met PBS.Voeg vervolgens twee milliliter van het dissociatie-enzym toe aan de put. Pipetteer de inhoud 10 keer op en neer met behulp van een pipet van één milliliter om de organoïden in de koepels mechanisch te dissociëren voordat u de plaat gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius incubeert. Pipetteer na de incubatie de inhoud op en neer en controleer op de juiste dissociatie van de organoïden naar afzonderlijke cellen met behulp van een microscoop.Verzamel de celsuspensie in een buis van 15 milliliter en maak het volume tot 10 milliliter door ADF + Centrifugeer de buis op 450 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en aspirateer het supernatant met behulp van een Pasteur-pipet en zuigpomp. Resuspendeer de pellet in 100 tot 200 microliter van het volledige pancreaskanaal adenocarcinoom, of PDAC, organoïde kweekmedium, afhankelijk van de grootte van de pellet voordat u het aantal cellen telt met behulp van een methode naar keuze. Om de afzonderlijke cellen in ECM-koepels te plaatsen, verdunt u de juiste hoeveelheid celsuspensie door de vereiste hoeveelheid ontdooide ECU toe te voegen.Pipetteer vervolgens tot 10 druppeltjes van 20 microliter per put in een plaat met zes putten die is voorverwarmd tot 37 graden Celsius. Keer de plaat om en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Bedek vervolgens de putten met het volledige medium aangevuld met 10-micromolair Y-27632 en incubeer gedurende twee tot drie dagen in een incubator.Om de twee tot drie dagen oude organoïden te oogsten, aspirateer je eerst het medium en was je de organoïden eenmaal met PBS. Voeg vervolgens een tot twee milliliter organoïde-oogstoplossing, voorgekoeld tot vier graden Celsius, toe aan een put van de zesputtenplaat, afhankelijk van het aantal ECU-koepels. Incubeer de plaat die 10 minuten op ijs wordt bewaard, op een schuddend platform.Dissociëer nu de ECM-koepels door de inhoud in de putten op en neer te pipetteren met een pipet van één milliliter. Incubeer de organoïden nogmaals gedurende 10 minuten op ijs voordat u de dissociatie van de ECM-koepels visueel bevestigt onder een microscoop. Verzamel de organoïden in een buis van 15 milliliter, vooraf gecoat met 0,1% BSA in PBS, en vul het volume aan tot 10 milliliter door de buis toe te voegen bij 200 g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Zuig vervolgens het supernatant aan en resuspenseer de pellet, afhankelijk van de grootte ervan, in maximaal één milliliter volledig PDAC organoïde medium tot de gewenste uiteindelijke organoïde concentratie. Open de pipetteerrobotbesturingstoepassing, selecteer Protocollen en klik op Importeren voordat u het meegeleverde aanvullende bestand 6 naar het aangewezen veld sleept en neerzet. Selecteer het geïmporteerde protocol.En volgens de lay-out die wordt weergegeven in het veld Deck Setup, plaatst u alle labware, inclusief koelelementen en plasticware, in de decks. Gebruik de linkersleuf voor het reservoir en het koelelement van 25 milliliter. Klik vervolgens op Protocol uitvoeren en Ga verder met instellen.Open het tabblad Labware Setup, klik op Labware Position Check uitvoeren en volg de instructies om de pipetteerrobot te kalibreren naar de nieuwe hardware. Vul het reservoir van 25 milliliter, dat bovenop het koelelement is geplaatst, met de gekoelde organoïde zaaioplossing en klik op Start Run om de pipetteerrobot in actie te brengen. Centrifugeer vervolgens de microplaat met een snelheid van 100 g gedurende één minuut bij vier graden Celsius.Als u het medicijndoseringsprotocol wilt maken met behulp van de digitale besturingssoftware voor medicijndispensers, plaatst u de muisaanwijzer op plaat 1 boven de lay-out van de plaat. Selecteer Plaatkenmerken bewerken en vul het plaattype in als 384 put, het extra volume als 50 microliter en de DMSO-limiet als 1% Voeg vloeistoffen toe door op de toevoegingsknop naast Vloeistoffen te klikken en dubbelklik op de nieuw gemaakte vloeistof om deze een naam te geven. Selecteer vervolgens de klasse als DMSO-gebaseerd of waterig plus Tween 20 en vul de concentratie in.Om de plaatlay-out voor medicijntitratie te maken, selecteert u Putten en klikt u op Titratie. Selecteer voor vloeistof het medicijn van belang, samen met de gewenste hoogste concentratie en laagste concentratie. Voor replicaties selecteert u minimaal twee en kiest u het gewenste titratiepatroon.Om de plaatlay-out voor de positieve controle te maken, selecteert u drie putten, klikt u op Waarde instellen en vult u twee micromolaire staurosporine in uit een 10-millilar voorraad in DMSO om maximale celdood te induceren. Selecteer voor Cytotox Green alle gebruikte putten, klik op Waarde instellen en voer een waarde van 60 nanomolair per put in. Voor de negatieve controle en DMSO-normalisatie selecteert u alle putten met nog eens vier putten voor de voertuigbesturing.Klik nu met de rechtermuisknop en selecteer Normalisatie voordat u de genormaliseerde vloeistofklasse toewijst als DMSO-gebaseerd. Normaliseer vervolgens naar het volume van de hoogste klasse om een gelijke DMSO-concentratie in elke put te verkrijgen. Klik vervolgens op de pijl onder Uitvoeren in de linkerbovenhoek en selecteer Altijd simuleren, gevolgd door op Simuleren te klikken om eventuele fouten te identificeren en de volumes van elk te bereiden medicijn te verkrijgen.Schakel nu Altijd simuleren onder de knop Uitvoeren uit voordat u op Uitvoeren klikt om het protocol voor het verstrekken van geneesmiddelen te starten en volg de instructies. Breng het afdichtingsmembraan aan op de microplaat om verdamping te voorkomen. Open de besturingssoftware voor live-cell imagers en selecteer Methode-editor nieuw voordat u naar Bestand gaat om het XML-bestand van de voorbeeldmethode te importeren.U kunt ook de instructies in het manuscript volgen om een nieuw bestand te maken. Klik vervolgens op Start om het scannen te starten op T0.To de gegevens samen te voegen en te comprimeren, een nieuwe bovenliggende map te maken voor het overbrengen van alle afzonderlijke experimentmappen die op elk tijdstip voor elke scan zijn gegenereerd door de live-cell imager-besturingssoftware en de respectieve mappen een naam te geven door de instructies in het manuscript te volgen. Bereid een XLSX-plaatkaart voor in de digitale besturingssoftware voor medicijndispensers door met de rechtermuisknop op de lay-out van de plaatkaart te klikken vanuit het medicijndoseringsprotocol en alle putten te kopiëren om de gegevens in een XLSX-bestand te plakken.Verwijder Cytotox Green en staurosporine gegevens, voeg een matrix voor cellijn toe en voer een negatieve controle en positieve controle in. Open het hulpprogramma voor gegevenscompressie. Klik op Zoeken, selecteer de bovenliggende map en klik op Comprimeren om de compressie van afbeeldingsgegevens te starten.Alle TIFF-afbeeldingsbestanden worden gecomprimeerd tot één HDF5 voor elke put in een nieuwe map met gegevenssets in de map met ouderlijk toezicht. Om de afbeeldingen te analyseren, gaat u naar het web-app-platform voor beeldanalyse, logt u in en klikt u op Nieuw project toevoegen op het tabblad Start. Voer de projectnaam in, druk op Doorgaan en selecteer Nieuw experiment toevoegen voordat u de map met gegevenssets met de HDF5-bestanden uploadt.Ga na het uploaden naar de project- en experimentmap om op Plate Map uploaden te klikken voor extra functionaliteiten. Klik vervolgens achtereenvolgens op Analyse uitvoeren, selecteer Multi-organoïde analyse, Standaardparameters en ten slotte Analyseren om de beeldanalyse te starten. Klik op Resultaten downloaden om de onbewerkte gegevenstabellen te downloaden, die de metingen voor elke put en de gesegmenteerde afbeeldingen of video's bevatten voordat u de nauwkeurigheid van de analyse voor verdere gegevensverwerking bevestigt.Om rekening te houden met de variaties in organoïde zaaidichtheid en -grootte, werden op groeisnelheid gebaseerde statistieken gebruikt om variaties tussen de replicaties te verminderen, zoals aangegeven door de verminderde foutbalken. De beelden voor de negatieve controle, de positieve controle en de gecombineerde gemcitabine en paclitaxel-behandelde PDTO toonden aan dat de therapie voornamelijk groeistilstand veroorzaakte met een beperkte hoeveelheid celdood, overeenkomend met genormaliseerde geneesmiddelrespons, of NDR, waarde net onder nul. Bij het gebruik van twee extra lijnen, PDAC_052 en PDAC_087, werd een duidelijk verschil in groeisnelheid tussen de drie lijnen waargenomen, wat het gebruik van GR-statistieken ondersteunt.De NDR-dosis-responscurven resulteerden in een verhoogd dynamisch bereik en scheiding tussen de drie verschillende patiënten, in vergelijking met de GR-curven. Bepaling van NDR in de loop van de tijd toonde aan dat PDAC_052 en PDAC_060 een zeer vergelijkbare cytostatische geneesmiddelrespons hadden op een lage dosis gemcitabine-paclitaxel, terwijl een duidelijke differentiële cytostatische versus cytotoxische respons kon worden waargenomen voor de overeenkomstige middelste en hoge doses. Deze geneesmiddelresponsen waren consistent met de klinische responsen die bij de patiënten werden waargenomen.De klonale dynamiek onthulde dat PDAC_087 de meest resistente subclonen hadden na de behandeling, wat consistent is met de agressieve aard van de ziekte waargenomen bij de patiënt, die, interessant genoeg, ook het minst gevoelig was voor de positieve controle staurosporine. Het belangrijkste aspect van het protocol is om alle oplossingen met ECM gekoeld te houden tijdens het zaaien, omdat onjuiste stollen van de ECU de downstream beeldanalyse kan verstoren. De automatisering van het natte laboratoriumwerk, de beeldanalyse en de downstream gegevensverwerking kunnen nuttig zijn om het onderzoek te versnellen en nieuwe combinatietherapieën gemakkelijker te identificeren.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Eenvoudige en snelle methode om kwalitatief hoogwaardige Tumor DNA uit klinisch-pathologische monsters met behulp van Touch Impressum cytologie

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuclide-fluorescentie Reporter Gene Imaging als u wilt bijhouden van de Tumor progressie in knaagdier Tumor modellen

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generatie van High-Throughput driedimensionale Tumor spheroïden voor Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-cel Imaging tests studie Glioblastoma Brain Tumor stamcel migratie en invasie

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

Analyse van kanker cel invasie en anti-metastatische Drug Screening met behulp van Hydrogel Micro-kamer Array (HMCA)-op basis van platen

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Een eenvoudige migratie/invasie Workflow met behulp van een geautomatiseerde Live-cel Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Oprichting en karakterisering van de neuro-endocriene tumor Spheroids van de kleine darm

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Een nieuwe Stromal Fibroblast-Gemoduleerde 3D Tumor Sferoïde Model voor het bestuderen van Tumor-Stroma Interactie en Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening van primaire patiënt afgeleid tumor Xenografts bij zebravissen

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...