Name: multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis
Uploaded: 2022-12-23T13:50:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis at JoVE.com

Une partie de cette recherche a été financée par des dons de différents donateurs, dont Dedert Schilde vzw et M. Willy Floren. Ce travail est partiellement financé par la Fondation flamande pour la recherche, 12S9221N (A.L.), G044420N (S.V., A.L., E.G), 1S27021N (M.L), et par le Fonds de recherche industrielle de l’Université d’Anvers, PS ID 45151 (S.V., A.L., C.D.). La figure 1 a été créée avec BioRender.com.

<ol>
	<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Veninga, V., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+organoids:+Opportunities+and+challenges+to+guide+precision+medicine.">Tumor organoids: Opportunities and challenges to guide precision medicine.</a> Cancer Cell. 39 (9), 1190-1201 (2021).</li><li>Le Compte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+as+individual+patient+models+for+chemoradiation+response+prediction+in+gastrointestinal+malignancies.">Patient-derived organoids as individual patient models for chemoradiation response prediction in gastrointestinal malignancies.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 157, 103190 (2021).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li><li>Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+inhibition+metrics+correct+for+confounders+in+measuring+sensitivity+to+cancer+drugs.">Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs.</a> Nature Methods. 13 (6), 521-527 (2016).</li><li>Gupta, A., Gautam, P., Wennerberg, K., Aittokallio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+normalized+drug+response+metric+improves+accuracy+and+consistency+of+anticancer+drug+sensitivity+quantification+in+cell-based+screening.">A normalized drug response metric improves accuracy and consistency of anticancer drug sensitivity quantification in cell-based screening.</a> Communications Biology. 3 (1), 42 (2020).</li><li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+organoids:+a+bright+future+ahead.">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li><li>Deben, C., Cardenas, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrBITS:+label-free+and+time-lapse+monitoring+of+patient+derived+organoids+for+advanced+drug+screening.">OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening.</a> Cellular Oncology. , (2022).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> Bioessays. 39 (8), (2017).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Engel, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+colorectal+cancer+organoids+upregulate+revival+stem+cell+marker+genes+following+chemotherapeutic+treatment.">Patient-derived colorectal cancer organoids upregulate revival stem cell marker genes following chemotherapeutic treatment.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (1), 128 (2020).</li><li>Hennig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+drug+resistance+in+pancreatic+cancer+organoids+guides+optimized+chemotherapy+treatment.">Detecting drug resistance in pancreatic cancer organoids guides optimized chemotherapy treatment.</a> The Journal of Pathology. 257 (5), 607-619 (2022).</li><li>D'Alterio, C., Scala, S., Sozzi, G., Roz, L., Bertolini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+effects+of+chemotherapy+on+tumor+relapse+and+metastasis+promotion.">Paradoxical effects of chemotherapy on tumor relapse and metastasis promotion.</a> Seminars in Cancer Biology. 60, 351-361 (2020).</li><li>Njoroge, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+model+distinct+Vitamin+E+effects+at+different+stages+of+prostate+cancer+evolution.">Organoids model distinct Vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).</li><li>Godet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate-mapping+post-hypoxic+tumor+cells+reveals+a+ROS-resistant+phenotype+that+promotes+metastasis.">Fate-mapping post-hypoxic tumor cells reveals a ROS-resistant phenotype that promotes metastasis.</a> Nature Communications. 10 (1), 4862 (2019).</li><li>Letai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+precision+cancer+medicine-moving+beyond+pure+genomics.">Functional precision cancer medicine-moving beyond pure genomics.</a> Nature Medicine. 23 (9), 1028-1035 (2017).</li></ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Le dépistage des médicaments PDTO à débit moyen à élevé repose souvent sur des lectures qui n’extraient qu’une fraction des informations que les organoïdes pourraient potentiellement fournir. Il est devenu de plus en plus clair que, pour que la technologie organoïde en évolution rapide réalise un plus grand potentiel scientifique et clinique, des tests 3D, des lectures et des méthodes d’analyse plus avancés sont absolument nécessaires. Ici, un pipeline de criblage avancé est décrit, ce qui non seulement augmente la reproductibilité, mais améliore également considérablement la translatabilité clinique en intégrant une lecture d’imagerie de cellules vivantes pilotée par l’IA. En plus du logiciel d’analyse développé à l’interne, l’utilisation de la mesure de réponse normalisée aux médicaments (NDR) est mise en œuvre, ce qui démontre clairement sa capacité à définir les différences spécifiques au patient dans la réponse au traitement6. 
L’inclusion de cette mesure de normalisation sera sans aucun doute d’une valeur considérable, si l’on se souvient que de nombreuses études visent à délimiter les réponses au traitement en fonction de différences mineures d’aire sous la courbe (ASC) ou de concentration inhibitrice demi-maximale (IC50) (car la plupart des courbes dose-réponse se chevauchent/sont situées à proximité les unes des autres)11,12 . Des mesures du taux de croissance ont déjà été mises en œuvre dans des protocoles de criblage de médicaments organoïdes utilisant le test basé sur l’ATP, mais reposent sur la normalisation des puits de référence lysés au point temporel 04. En revanche, cette méthode permet la normalisation du taux de croissance intrapuits, ce qui tient compte non seulement des différences interpatients dans le taux de croissance PDTO, mais aussi des différences entre puits résultant des variations de la densité de semis et des effets dépendants de l’emplacement des plaques pour augmenter la reproductibilité. De plus, nous avons adapté la NDR pour augmenter davantage la séparation de la réponse PDTO interpatiente en incluant un contrôle positif pour la normalisation 6,8.
En outre, l’analyse, qui est compatible avec les formats à haut débit et d’automatisation, peut détecter avec précision les réponses organoïdes individuelles, permettant de quantifier la résistance sous-clonale, la principale force motrice de la rechute et de la progression tumorales13. Par exemple, bien que PDAC052 et PDAC060 aient montré une bonne réponse au traitement in vitro (basée sur le NDR), l’analyse mono-organoïde supplémentaire a permis de détecter une petite population (plus grande population avec PDAC060) de sous-clones qui ne répondent pas au traitement. Fait intéressant, cela correspondait fortement à l’observation clinique, étant donné que PDAC052 et PDAC060 avaient une réponse durable (aucune activité tumorale détectée) mais ont finalement été diagnostiqués avec une progression tumorale locale (en raison de la présence de clones résistants). Par rapport aux lectures 3D conventionnelles (test basé sur l’ATP et taille/nombre), ce pipeline de dépistage avancé devrait augmenter les performances prédictives en extrayant des informations plus pertinentes sur le plan clinique de ces « patients en laboratoire ». Cette hypothèse est actuellement testée en criblant des échantillons cliniques PDTO dans le laboratoire des auteurs avec cette méthode pour corréler ex vivo avec la réponse in vivo et les résultats cliniques. 
Pour mieux comprendre les mécanismes d’une réponse aux médicaments, les réactifs d’imagerie de cellules vivantes fluorescentes conventionnels, en plus des colorants de cytotoxicité, sont compatibles avec cette méthode pour étudier les mécanismes de la mort cellulaire. Nous avons précédemment montré la compatibilité de cette méthode avec le réactif vert Sartorius Caspase 3/7 pour étudier l’induction de l’apoptose dépendante de la caspase après un traitement au cisplatine8. La compatibilité avec d’autres colorants pour étudier le stress oxydatif (réactifs CellROX) ou l’hypoxie (réactifs Image-iT Hypoxia) reste à tester. Cependant, ces réactifs ont déjà été utilisés avec succès dans des modèles in vitro 3D14,15.
Le logiciel d’analyse d’images est également compatible avec d’autres formats de plaques ou méthodes de culture (par exemple, plaques à microcavités, dômes ECM) si des images claires et nettes des organoïdes peuvent être capturées. Ceci est souvent difficile pour les organoïdes cultivés dans des dômes car ils poussent dans différents plans z, ce qui nécessite une fonctionnalité d’empilement z du microscope qui n’est pas toujours disponible. Par conséquent, nous conseillons l’utilisation de microplaques ULA 384 puits à fond plat pour garantir des images de qualité suffisante. 
De plus, l’analyse est compatible avec d’autres systèmes d’imagerie de cellules vivantes, comme indiqué précédemment pour les images à contraste de phase capturées avec un système IncuCyte ZOOM8. Une limitation du système d’imagerie de cellules vivantes Spark Cyto qui a été utilisé dans ce manuscrit est la capacité d’une plaque pour les mesures cinétiques. Cependant, l’extension Spark Motion augmente sa capacité jusqu’à 40 microplaques qui peuvent être criblées en vrac. La compatibilité du logiciel développé en interne sera étendue à ces systèmes et à d’autres afin d’offrir une solution indépendante de la plate-forme, dans le but de normaliser et d’automatiser les pipelines d’analyse d’images et de données. L’application Web comprendra également des outils graphiques interactifs et des calculs automatisés de mesures des médicaments, comme le montre le présent document, afin de réduire le temps d’analyse manuelle.
L’algorithme de segmentation PDTO sans marquage a été formé et testé sur divers modèles sphéroïdes et PDTO cultivés en interne avec des différences morphologiques distinctes (solide, semi-solide, kystique), et peut par conséquent les détecter avec une grande précision8. Une limite du modèle est que l’inclusion de PDTO kystiques a augmenté la détection indésirable des bulles présentes dans le puits suivant l’ensemencement. Cependant, l’incubation nocturne a été suffisante pour éliminer la plupart de ces bulles, permettant un balayage qualitatif du point de temps 0. La précision de la segmentation de l’image organoïde et de la méthode doit être validée par d’autres utilisateurs, et en fonction de leurs commentaires, le logiciel peut être formé davantage pour obtenir un algorithme d’analyse d’image robuste et automatisé. En outre, nous visons à obtenir plus de données cliniques pour corréler la réponse ex vivo au médicament quantifiée par cette méthode à la réponse clinique chez le patient afin d’identifier les meilleurs paramètres pour prédire la réponse thérapeutique et de développer davantage cette méthode pour la médecine fonctionnelle de précision du cancer16.

Au cours des dernières années, la découverte in vitro de médicaments contre le cancer, le dépistage de médicaments et la recherche fondamentale sont passés de l’utilisation de modèles de cancer bidimensionnels traditionnels (2D) avec des lignées cellulaires immortalisées à des modèles de cancer tridimensionnels (3D) plus pertinents sur le plan physiologique. Cela a stimulé l’adoption de sphéroïdes tumoraux avec des lignées cellulaires cancéreuses établies, qui recréent des interactions et des structures de cellule à cellule plus complexes présentes dans les tumeurs solides. Actuellement, les organoïdes tumoraux dérivés de patients (PDTO) sont le modèle de cancer 3D le plus avancé et physiologiquement pertinent disponible pour la recherche in vitro sur le cancer, car ils offrent des avantages supplémentaires par rapport aux sphéroïdes tumoraux, à savoir l’hétérogénéité trouvée chez les patients cancéreux1. Les PDTO sont établis à partir de tissus tumoraux provenant de patients cancéreux et conservent donc à la fois le phénotype tumoral et le génotype. En tant que tels, les PDTO deviennent inestimables pour la recherche fondamentale et translationnelle sur le cancer et ont le potentiel d’améliorer considérablement la précision de l’oncologie2. 
Malgré leur potentiel prometteur, ces modèles 3D sophistiqués de cancer in vitro sont souvent sous-utilisés en raison d’un manque de méthodes d’analyse avancées. Le test le plus couramment utilisé détermine le nombre de cellules viables dans le PDTO via la quantification de l’ATP3 intracellulaire. Ces tests sont normalement des analyses globales à point temporel unique, négligeant ainsi les réponses critiques dépendantes du temps et négligeant les réponses clonales. Plus précisément, la capacité de surveiller la croissance des PDTO (taux de croissance) et leur réponse à des thérapies spécifiques présente un grand intérêt 4,5. La réponse normalisée aux médicaments (NDR), qui évalue la réponse au médicament en fonction du taux de croissance normalisé à une condition positive (ctrl+) et de contrôle négatif (ctrl-), a également été récemment considérée comme une mesure cruciale pour évaluer la sensibilité aux médicaments anticancéreux avec le dépistage cellulaire, bien que cela ait été principalement fait pour les lignées cellulaires2D 6. Par conséquent, des méthodes d’analyse plus sophistiquées sont nécessaires pour tirer pleinement parti de ces modèles de cancer 3D plus représentatifs et plus complexes sur le plan clinique. La microscopie est considérée comme une approche puissante pour étudier la complexité de ces modèles organoïdes7.
Cet article décrit une méthode de surveillance des réponses cinétiques aux médicaments dans des modèles 3D de cancer, à l’aide de microscopes à grand champ conventionnels et de systèmes d’imagerie de cellules vivantes. Des adaptations ont été apportées au protocole décrit par Driehuis et al.4 pour être compatible avec l’automatisation à l’aide d’un robot de pipetage, d’un distributeur numérique de médicaments et d’un système d’imagerie de cellules vivantes afin d’augmenter la reproductibilité et de réduire le nombre d’heures de travail « pratique ». Cette méthode permet le criblage médicamenteux à débit moyen à élevé des sphéroïdes tumoraux avec des lignées cellulaires cancéreuses établies (voir le tableau supplémentaire S1 pour les lignées cellulaires testées), ainsi que des PDTO, dans un format microplaque et multi-organoïde à 384 puits. En utilisant un processus d’apprentissage automatique en réseau convolutionnel, l’identification et le suivi automatisés des sphéroïdes tumoraux individuels ou PDTO pourraient être effectués uniquement à partir de l’imagerie en fond clair et sans l’utilisation de colorants fluorescents pour le marquage des cellules vivantes8. Ceci est très avantageux, car la plupart des identifications avec l’imagerie en fond clair nécessitent une annotation manuelle (ce qui est laborieux et prend beaucoup de temps) ou nécessitent l’ajout de colorants fluorescents, ce qui peut confondre les réponses médicamenteuses liées au stress oxydatif induit par la photoxicité9.
Le logiciel d’analyse d’images qui en résulte, développé en interne, étend les fonctionnalités des systèmes d’imagerie de cellules vivantes conventionnels, car les modules d’analyse d’images 3D ne sont pas disponibles, limités par la plate-forme ou ne sont pas compatibles avec les microplaques 384 puits et l’imagerie de puits entiers. De plus, ces modules sont souvent très chers et offrent des lectures organoïdes en vrac limitées. Par conséquent, cette méthode est très pertinente pour les scientifiques qui ont accès à des systèmes d’imagerie de cellules vivantes largement disponibles et visent à extraire plus d’informations sur une réponse médicamenteuse par rapport au test de référence mais rudimentaire basé sur l’ATP. Avec l’ajout d’indicateurs spécifiques de mort cellulaire, les réponses cytostatiques aux médicaments peuvent être distinguées des réponses cytotoxiques, fournissant ainsi un aperçu supplémentaire des actions mécanistes des médicaments actuellement inaccessibles à partir d’une analyse ponctuelle unique. Enfin, l’imagerie de cellules vivantes permet un suivi organoïde individuel pour obtenir des mesures de réponse aux médicaments organoïdes uniques afin de saisir l’hétérogénéité de la réponse et d’identifier les sous-clones potentiellement résistants.
L’objectif de cette méthode et du logiciel d’analyse d’images associé est de mettre en œuvre une automatisation à faible coût dans le dépistage de médicaments organoïdes afin de limiter l’intervention des utilisateurs et de réduire la variabilité dans la manipulation, l’analyse d’images et l’analyse de données. Pour mettre ce logiciel à la disposition des chercheurs, il est indépendant du microscope et de la plate-forme, et une application basée sur le cloud est mise à disposition. Ainsi, en prenant en charge les systèmes conventionnels d’imagerie de cellules vivantes, nous visons également à améliorer leur fonctionnalité pour les applications et l’analyse de culture 3D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel p300 (GEN 2) pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom ULA microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4588</td>
			<td>minimum volume 50 &#181;L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom ULA Phenoplate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6057802</td>
			<td>minimum volume 75 &#181;L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A8301</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADF+++</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Advanced DMEM/F12, 1% GlutaMAX, 1% HEPES, 1% penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe easy sealing membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z380059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase 3/7 Green&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Slides for TC10/TC20</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1450017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td>ATP-assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler for 25 mL reservoir</td>
			<td>VWR (Diversified Biotech)</td>
			<td>490006-908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling element 12 x 8 x 3 cm</td>
			<td>Bol.com</td>
			<td>9200000107744702</td>
			<td>For custom microplate holder OT-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Organoid Harvesting Solution</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3700-100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2&#160;</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotox Green</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotox Red</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300e</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Digital drug dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300e Control v3.3.5</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Control software D300e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ADF+++ supplemented with 0.5 nM WNT surrogate-Fc-Fusion protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium, 4% Rpso3-Fc Fusion Protein conditioned medium, 1x B27, 1 mM N-acetyl cysteine (NAC), 5 mM nicotinamide, 500 nM A83-01, 100 ng/mL FGF10, and 10 nM Gastrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemcitabine</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) patient-derived organoids</td>
			<td>Biobank@uza (Antwerp, Belgium; ID: BE71030031000; Belgian Virtual Tumorbank funded by the National Cancer Plan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentrons App v6.0.1</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>OT-2 control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentrons Protocol Designer Tool</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>https://designer.opentrons.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbits data compression tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>www.orbits-oncology.com or contact corresponding author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbits image analysis webapp</td>
			<td>University of Antwerp</td>
			<td></td>
			<td>www.orbits-oncology.com or contact corresponding author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Pipetting robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipette 230 mm&#160;</td>
			<td>Novolab</td>
			<td>A33696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peniciline-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspo3-Fc Fusion Protein conditioned medium</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spark Cyto 600</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell imaging and multi-mode platereader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SparkControl v3.1</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Spark Cyto control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 25 mL reservoir</td>
			<td>VWR (Diversified Biotech)</td>
			<td>10141-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T8 plus cassette</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>233360010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT Surrogate-Fc-Fusion protein</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis

Les organoïdes tumoraux dérivés du patient (PDTO) sont très prometteurs pour la recherche préclinique et translationnelle et la prédiction de la réponse thérapeutique du patient à partir de criblages de médicaments ex vivo . Cependant, les tests actuels de dépistage de médicaments basés sur l’adénosine triphosphate (ATP) ne saisissent pas la complexité d’une réponse médicamenteuse (cytostatique ou cytotoxique) et l’hétérogénéité intratumorale qui s’est avérée retenue dans les PDTO en raison d’une lecture globale. L’imagerie de cellules vivantes est un outil puissant pour surmonter ce problème et visualiser les réponses aux médicaments plus en profondeur. Cependant, les logiciels d’analyse d’images ne sont souvent pas adaptés à la tridimensionnalité des PDTO, nécessitent des colorants de viabilité fluorescents ou ne sont pas compatibles avec un format de microplaque à 384 puits. Cet article décrit une méthodologie semi-automatisée pour ensemencer, traiter et imager des PDTO dans un format à haut débit de 384 puits à l’aide de systèmes d’imagerie conventionnels à champ large et à cellules vivantes. En outre, nous avons développé un logiciel d’analyse d’images sans marqueur de viabilité pour quantifier les mesures de réponse aux médicaments basées sur le taux de croissance qui améliorent la reproductibilité et corrigent les variations de taux de croissance entre les différentes lignées PDTO. En utilisant la mesure de réponse normalisée aux médicaments, qui évalue la réponse au médicament en fonction du taux de croissance normalisé à une condition de contrôle positive et négative, et un colorant de mort cellulaire fluorescent, les réponses cytotoxiques et cytostatiques aux médicaments peuvent être facilement distinguées, améliorant considérablement la classification des répondeurs et des non-répondeurs. En outre, l’hétérogénéité de la réponse aux médicaments peut être quantifiée à partir de l’analyse de la réponse aux médicaments organoïde unique pour identifier des clones potentiels et résistants. En fin de compte, cette méthode vise à améliorer la prédiction de la réponse thérapeutique clinique en capturant une signature multiparamétrique de réponse au médicament, qui comprend l’arrêt de la croissance cinétique et la quantification de la mort cellulaire.

Le protocole de pipetage automatisé assure une répartition uniforme des PDTO PDAC_060 dans toutes les colonnes de la microplaque à 384 puits (Figure 2A). Comme prévu, une variation du nombre et de la superficie moyenne des PDTO a été observée entre les puits (figure 2A, B). La surface de survie totale (surface totale en fond clair - surface verte totale) combine la segmentation organoïde sans marquage avec le signal de mort cellulaire basé sur la fluorescence et constitue, selon notre expérience, le paramètre le plus robuste pour étudier les réponses aux médicaments au fil du temps (Figure 2C)8. Pour tenir compte des variations dans l’ensemencement cellulaire et la taille des organoïdes, des paramètres basés sur le taux de croissance devraient être utilisés pour réduire les variations entre les répétitions, comme le montrent les barres d’erreur réduites de la figure 2D par rapport à la figure 2C, et un facteur Z plus élevé indiquant une qualité de dépistage des médicaments fortement améliorée (figure 2E).
La courbe dose-réponse NDR (figure 2G), normalisée en ctrl- et ctrl+, est nettement supérieure à la courbe dose-réponse GR (figure 2F), normalisée en ctrl-, car elle augmente la séparation des courbes de réponse au médicament et représente plus précisément les réponses cytotoxiques aux médicaments. Un exemple des images associées pour le PDTO traité par ctrl, ctrl+ et 400 nM gemcitabine/80 nM de paclitaxel est présenté à la figure 3. Une observation intéressante est que l’effet cytotoxique de la gemcitabine était dominant dans la thérapie combinée car aucune valeur ajoutée du paclitaxel n’a été observée.
Ensuite, deux lignes PDTO supplémentaires, PDAC_052 et PDAC_087, ont été utilisées. Une nette différence de taux de croissance entre ces lignes a été observée (figure 4A), ce qui appuie l’utilisation de paramètres GR. Encore une fois, les courbes dose-réponse NDR (Figure 4C) ont entraîné une augmentation de la plage dynamique et de la séparation entre les trois patients différents par rapport aux courbes GR (Figure 4B). De plus, le protocole permet de déterminer le NDR au fil du temps et montre que PDAC_052 et PDAC_060 avaient une réponse cytostatique très similaire à une faible dose de gem-pac (Figure 4D), tandis qu’une réponse cytostatique par rapport à cytotoxique différentielle claire pouvait être observée pour les doses moyennes (Figure 4E) et élevées (Figure 4F) de gem-pac. Ces réponses médicamenteuses étaient cohérentes avec les réponses cliniques observées chez les patients (Figure 4G).
Enfin, un avantage majeur de l’approche et du logiciel est que les réponses aux médicaments organoïdes uniques peuvent être quantifiées pour étudier l’hétérogénéité de la réponse et identifier les sous-clones potentiellement résistants. La figure 5 donne un aperçu clair de la dynamique clonale des différents patients et montre que PDAC-087 avait les sous-clones les plus résistants après traitement, ce qui est cohérent avec la maladie agressive et hautement résistante observée chez le patient. Fait intéressant, ce patient était également le moins sensible à la staurosporine ctrl +.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig01.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble du flux de travail. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig02v2.jpg"> Figure 2 : Précision de l’ensemencement et mesures de réponse aux médicaments. (A) Dénombrement organoïde/puits de PDAC_060 PDTO ensemencés dans une microplaque de 384 puits à l’aide du robot de pipetage. Chaque point représente le nombre dans un seul puits et les tracés sont séparés par les colonnes de microplaques de 384 puits. (B) Superficie ou puits moyen de PDTO. (C) Surface de survie totale (surface totale en fond clair - surface verte totale) et (D) taux de croissance (surface de survie totale normalisée à T0 = 1) des PDTO PDAC_060 traités avec un rapport 5:1 gemcitabine/paclitaxel. (E) Facteur Z comme mesure de la qualité des essais. (F) Courbe taux de croissance-dose-réponse normalisée à ctrl- et (G) courbe normalisée de réponse au médicament normalisée à ctrl- et ctrl+. Les barres d’erreur indiquent la moyenne ± SD de deux puits. Abréviations : PDAC = adénocarcinome canalaire pancréatique; PDTO = organoïde tumoral dérivé du patient; GR = taux de croissance; NDR = réponse médicamenteuse normalisée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig02largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig03.jpg"> Figure 3 : Exemples d’images. Images représentatives d’PDAC_060 PDTO traitées avec du véhicule (ctrl-), 400 nM gemcitabine/80 nM paclitaxel et 2 μM staurosporine (ctrl+). La colonne de gauche montre les images en fond clair, la colonne du milieu montre le signal fluorescent Cytotox Green et la colonne de droite montre les images de fond clair annotées sans étiquette à l’aide du module d’analyse organoïde. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : PDAC = adénocarcinome canalaire pancréatique; PDTO = organoïde tumoral dérivé du patient; GemPac = gemcitabine/paclitaxel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig04.jpg"> Figure 4 : Comparaison de la réponse interpatiente aux médicaments. (A) Comparaison du taux de croissance (basé sur la surface de survie totale) des lignées PDTO PDAC_052, PDAC_060 et PDAC_087. (B) Courbe taux de croissance-dose-réponse normalisée à ctrl- et (C) courbe normalisée de réponse au médicament normalisée à ctrl- et ctrl+. NDR cinétique d’une dose (D) faible, (E) moyenne et (F) élevée de gemcitabine/paclitaxel (rapport 5:1). (G) les caractéristiques cliniques des patients PDAC. Les barres d’erreur indiquent la moyenne ± SD de deux puits. Abréviations : PDAC = adénocarcinome canalaire pancréatique; PDTO = organoïde tumoral dérivé du patient; GR = taux de croissance; NDR = réponse normalisée au médicament; FFX = folfirinox. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig05.jpg"> Figure 5 : Mesures organoïdes uniques. Dose-réponse organoïde unique basée sur la mort cellulaire (zone verte/zone de fond clair) et l’aire (fond clair) des PDTO PDAC_052, PDAC_060 et PDAC_087 traitées avec du véhicule (ctrl-), 400 nM gemcitabine/80 nM de paclitaxel et 2 μM de staurosporine (ctrl+). Les régions vertes indiquent des organoïdes viables; les régions bleues indiquent la plage x-as des tracés GemPac et ctrl+. Abréviations : PDAC = adénocarcinome canalaire pancréatique; PDTO = organoïde tumoral dérivé du patient; GemPac = gemcitabine/paclitaxel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Stock de suspension cellulaire</td>
			<td>Cellules/goutte</td>
			<td># Gouttes (20 μL)</td>
			<td>Stock (1/3)</td>
			<td>ECM (2/3)</td>
		</tr><tr><td>1,13 × 107 cellules/ml</td>
			<td>75,000</td>
			<td>10</td>
			<td>75 uL</td>
			<td>150 μL</td>
		</tr><tr><td>1,13 × 107 cellules/ml</td>
			<td>75,000</td>
			<td>5</td>
			<td>40 uL</td>
			<td>80 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Dilution pour le placage dans les dômes ECM. Abréviation : ECM = matrice extracellulaire.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composé</td>
			<td>Concentration des stocks</td>
			<td>Dilution</td>
			<td>Concentration de travail</td>
			<td>Solvant</td>
			<td>Concentration du puits</td>
			<td>Commentaires</td>
		</tr><tr><td>Cytotox Vert</td>
			<td>1 mM (DMSO)</td>
			<td>1/10</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>60 nM</td>
			<td>Marqueur de mort cellulaire</td>
		</tr><tr><td>Cytotox Rouge</td>
			<td>1 mM (DMSO)</td>
			<td>1/10</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>250 nM</td>
			<td>Marqueur de mort cellulaire</td>
		</tr><tr><td>Caspases 3/7 Vert</td>
			<td>5 mM (DMSO)</td>
			<td>1/2</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>2,5 μM</td>
			<td>Marqueur apoptotique</td>
		</tr><tr><td>Hoechst</td>
			<td>20 mM (H2O)</td>
			<td>1/200</td>
			<td>100 μM</td>
			<td>0,33 % préadolescents/PBS</td>
			<td>50 nM</td>
			<td>Marqueur nucléaire</td>
		</tr><tr><td>Staurosporin</td>
			<td>10 mM (DMSO)</td>
			<td>/</td>
			<td>1 - 10 mM</td>
			<td>/</td>
			<td>2 – 5 μM</td>
			<td>Contrôle positif</td>
		</tr><tr><td>Gemcitabine</td>
			<td>10 mM (DMSO)</td>
			<td>/</td>
			<td>1 - 10 mM</td>
			<td>/</td>
			<td>Titrage</td>
			<td>Chimiothérapie</td>
		</tr><tr><td>Paclitaxel</td>
			<td>10 mM (DMSO)</td>
			<td>/</td>
			<td>1 - 10 mM</td>
			<td>/</td>
			<td>Titrage</td>
			<td>Chimiothérapie</td>
		</tr><tr><td>Cisplatine</td>
			<td>5 mM (0,9 % NaCl)</td>
			<td>1/2</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td>0,6 % préadolescents/PBS</td>
			<td>Titrage</td>
			<td>Chimiothérapie</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Exemples de dilutions de médicaments et de réactifs fluorescents fréquemment utilisés. Chaque composé doit être dissous dans 100% DMSO ou 0,3% Tween/PBS.
Tableau supplémentaire S1 : Vue d’ensemble des lignées cellulaires cancéreuses compatibles. Statique : les sphéroïdes ne sont pas migrateurs. Fusionner : les sphéroïdes migrent les uns vers les autres et fusionnent ensemble. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434_SuppTableS1%20(1).xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Outil de calcul de solution d’ensemencement organoïde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%201.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 2: Fichier STL pour l’impression 3D de matériel de laboratoire personnalisé 'Microplate Holder'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%202.stl" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 3 : Fichier STL pour l’impression 3D de matériel de laboratoire personnalisé '2 x 25 mL Reservoir Holder'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%203.stl" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 4: Fichier JSON pour robot de pipetage de matériel de laboratoire personnalisé 'Microplate Holder'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%204.json" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 5 : Fichier JSON pour robot de pipetage de laboratoire personnalisé '2 x 25 mL Reservoir Holder_WithCooler'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%205.json" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 6 : fichier JSON pour le protocole de robot de pipetage 'Plating_ PDO_384well_Cooled_Row2-23'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%206.json" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 7 : Vue d’ensemble de la configuration du bureau du robot pipeteur. (A) Éléments de refroidissement et (B) réservoir et microplaque. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%207.png" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 8 : Fichier TDD pour le protocole du distributeur numérique de médicaments. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%208.tdd" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 9 : Fichier XML pour le protocole de l’imageur de cellule vivante pour l’imagerie en fond clair et en fluorescence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%209.xml" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 10 : Exemple de carte de plaques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2010.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 11 : Exemple de fichier d’entrée pour le script NDR R. Abréviation : NDR = réponse médicamenteuse normalisée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2011.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 12 : Script NDR normalisé de la réponse médicamenteuse. Abréviation : NDR = réponse médicamenteuse normalisée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2012.R" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 13 : Exemple de fichier de sortie des valeurs GR du script NDR R. Abréviations : GR = taux de croissance; NDR = réponse médicamenteuse normalisée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2013.csv" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 14 : Exemple de fichier de sortie de script NDR R avec les valeurs GR transposées. Abréviations : GR = taux de croissance; NDR = réponse médicamenteuse normalisée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2014.csv" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Supplementary File 15 : Exemple de fichier de sortie des valeurs NDR du script NDR R. Abréviation : NDR = réponse médicamenteuse normalisée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2015.csv" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 16 : Exemple de fichier de sortie de script NDR avec des valeurs NDR transposées. Abréviation : NDR = réponse médicamenteuse normalisée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2016.csv" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Ce protocole décrit une méthode semi-automatisée pour les criblages de médicaments organoïdes à débit moyen à élevé et un logiciel d’analyse d’images automatisé indépendant du microscope pour quantifier et visualiser les réponses multiparamétriques et mono-organoïdes aux médicaments afin de capturer l’hétérogénéité intratumorale.

Criblage multiparamétrique de médicaments organoïdes tumoraux à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes à grand champ pour l’analyse en vrac et mono-organoïde

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Ce protocole permettra aux chercheurs non seulement de rationaliser leur pipeline d’analyse, mais il leur permettra également d’extraire plus d’informations de leur flux organoïde, améliorant ainsi la pertinence translationnelle. Le principal avantage de ce protocole est qu’il combine un flux de travail rationalisé avec un pipeline d’analyse automatisé et cliniquement pertinent, permettant ainsi aux chercheurs d’obtenir une quantité convaincante d’informations à partir d’un seul écran organoïde. Cette technique peut être utilisée pour prédire la réponse thérapeutique clinique des patients cancéreux à partir de ces criblages de médicaments organoïdes ex vivo avec des résultats précoces très prometteurs.L’objectif est de rendre la plate-forme de solution logicielle agnostique afin que les chercheurs puissent utiliser un instrument d’imagerie de cellules vivantes à leur disposition. Commencez par dissocier enzymatiquement les organoïdes tumoraux dérivés du patient, ou PDTO, dans les dômes de la matrice extracellulaire, ou ECM, dans la microplaque à six puits. Pour cela, aspirez d’abord le milieu et lavez les dômes ECM une fois avec du PBS.Ensuite, ajoutez deux millilitres de l’enzyme de dissociation dans le puits. Pipeter le contenu de haut en bas 10 fois à l’aide d’une pipette d’un millilitre pour dissocier mécaniquement les organoïdes dans les dômes avant d’incuber la plaque pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, pipeter le contenu de haut en bas et vérifier la bonne dissociation des organoïdes en cellules individuelles à l’aide d’un microscope.Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et porter le volume jusqu’à 10 millilitres en ajoutant ADF + centrifuger le tube à 450 g pendant cinq minutes à température ambiante, et aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur et d’une pompe d’aspiration. Remettez la pastille en suspension dans 100 à 200 microlitres de l’adénocarcinome canalaire pancréatique complet, ou PDAC, milieu de culture organoïde selon la taille de la pastille avant de compter le nombre de cellules en utilisant une méthode de choix. Pour plaquer les cellules individuelles dans des dômes ECM, diluez la quantité appropriée de suspension cellulaire en ajoutant la quantité requise d’ECM décongelée.Ensuite, pipeter jusqu’à 10 gouttelettes de 20 microlitres par puits dans une plaque de six puits préchauffée à 37 degrés Celsius. Retourner la plaque et incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, superposez les puits avec le milieu complet complété par du Y-27632 10 micromolaires et incuber pendant deux à trois jours dans un incubateur.Pour récolter les organoïdes âgés de deux à trois jours, aspirez d’abord le milieu et lavez les organoïdes une fois avec du PBS. Ensuite, ajoutez un à deux millilitres de solution de récolte organoïde, pré-refroidie à quatre degrés Celsius, à un puits de la plaque de six puits en fonction du nombre de dômes ECM. Incuber l’assiette maintenue sur la glace, sur une plate-forme tremblante pendant 10 minutes.Maintenant, dissociez les dômes ECM en pipetant le contenu dans les puits de haut en bas avec une pipette d’un millilitre. Encore une fois, incuber les organoïdes pendant 10 minutes sur de la glace avant de confirmer visuellement la dissociation des dômes ECM au microscope. Recueillir les organoïdes dans un tube de 15 millilitres, pré-enduit de 0,1% de BSA dans du PBS, et porter le volume à 10 millilitres en ajoutant ADF + centrifugeuse le tube à 200 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Ensuite, aspirez le surnageant et remettez la pastille en suspension en fonction de sa taille dans un millilitre de milieu organoïde PDAC complet jusqu’à la concentration organoïde finale souhaitée. Ouvrez l’application de contrôle du robot de pipetage, sélectionnez Protocoles et cliquez sur Importer avant de glisser-déposer le fichier supplémentaire 6 fourni dans le champ désigné. Sélectionnez le protocole importé.Et selon la disposition indiquée dans le champ Configuration du pont, placez tous les articles de laboratoire, y compris les éléments de refroidissement et les articles en plastique, dans les ponts. Utilisez la fente gauche pour le réservoir de 25 millilitres et l’élément de refroidissement. Ensuite, cliquez sur Exécuter le protocole et passez à la configuration.Ouvrez l’onglet Labware Setup (Configuration du logiciel Labware), cliquez sur Run Labware Position Check (Exécuter la vérification de la position du Labware) et suivez les instructions pour calibrer le robot de pipetage sur le nouveau matériel. Remplissez le réservoir de 25 millilitres, placé au-dessus de l’élément de refroidissement, avec la solution d’ensemencement organoïde refroidie, puis cliquez sur Démarrer l’exécution pour mettre le robot de pipetage en action. Ensuite, centrifugez la microplaque à une vitesse de 100 g pendant une minute à quatre degrés Celsius.Pour créer le protocole de distribution de médicaments à l’aide du logiciel de contrôle numérique des distributeurs de médicaments, passez la souris sur la plaque 1 au-dessus de la disposition de la plaque. Sélectionnez Modifier les attributs de la plaque et remplissez le type de plaque comme puits 384, le volume supplémentaire comme 50 microlitres et la limite DMSO comme 1%Ajouter des fluides en cliquant sur le bouton d’ajout à côté de Fluides, et double-cliquez sur le fluide nouvellement créé pour le nommer. Ensuite, sélectionnez la classe à base de DMSO ou aqueuse plus Tween 20, et remplissez la concentration.Pour créer la disposition des plaques pour le titrage des médicaments, sélectionnez Wells et cliquez sur Titrage. Pour le liquide, sélectionnez le médicament d’intérêt, ainsi que la concentration la plus élevée et la concentration la plus faible souhaitées. Pour les réplications, sélectionnez un minimum de deux et choisissez le modèle de titrage souhaité.Pour créer la disposition de la plaque pour le témoin positif, sélectionnez trois puits, cliquez sur Définir la valeur et remplissez la staurosporine à deux micromolaires à partir d’un stock de 10 millimolaires en DMSO pour induire une mort cellulaire maximale. Pour Cytotox Green, sélectionnez tous les puits utilisés, cliquez sur Définir la valeur et entrez une valeur de 60 nanomolaires par puits. Pour le contrôle négatif et la normalisation DMSO, sélectionnez tous les puits avec quatre puits supplémentaires pour le contrôle du véhicule.Maintenant, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Normalisation avant d’affecter la classe de fluide normalisée comme DMSO. Ensuite, normalisez au volume de classe le plus élevé pour obtenir une concentration égale de DMSO dans chaque puits. Ensuite, cliquez sur la flèche sous Exécuter dans le coin supérieur gauche, puis sélectionnez Toujours simuler, puis cliquez sur Simuler pour identifier les erreurs et obtenir les volumes de chaque médicament à préparer.Maintenant, décochez Toujours simuler sous le bouton Exécuter avant de cliquer sur Exécuter pour démarrer le protocole de distribution du médicament et suivez les instructions. Appliquez la membrane d’étanchéité sur la microplaque pour éviter l’évaporation. Ouvrez le logiciel de contrôle de l’imageur de cellule vivante et sélectionnez Éditeur de méthode Nouveau avant d’accéder à Fichier pour importer l’exemple de fichier XML de méthode.Vous pouvez également suivre les instructions du manuscrit pour créer un nouveau fichier. Ensuite, cliquez sur Démarrer pour lancer l’analyse à T0.To fusionnez et compressez les données, créez un nouveau dossier parent pour transférer tous les dossiers d’expérience individuels générés pour chaque numérisation à chaque point de temps par le logiciel de contrôle de l’imageur de cellule vivante et nommez les dossiers respectifs en suivant les instructions données dans le manuscrit. Préparez une carte de plaque XLSX dans le logiciel de contrôle numérique des distributeurs de médicaments en cliquant avec le bouton droit de la souris sur la disposition de la carte des plaques à partir du protocole de distribution de médicaments et en copiant tous les puits pour coller les données dans un fichier XLSX.Supprimez les données de Cytotox Green et de staurosporine, ajoutez une matrice pour la lignée cellulaire et entrez dans un contrôle négatif et un contrôle positif. Ouvrez l’outil de compression de données. Cliquez sur Rechercher, sélectionnez le dossier parent, puis cliquez sur Compresser pour lancer la compression des données d’image.Tous les fichiers image TIFF sont compressés en un seul HDF5 pour chaque puits dans un nouveau dossier de jeux de données dans le dossier parental. Pour analyser les images, accédez à la plateforme d’application Web d’analyse d’images, connectez-vous et cliquez sur Ajouter un nouveau projet dans l’onglet Accueil. Entrez le nom du projet, appuyez sur Continuer et sélectionnez Ajouter une nouvelle expérience avant de télécharger le dossier des jeux de données contenant les fichiers HDF5.Après le téléchargement, accédez au dossier du projet et de l’expérience pour cliquer sur Télécharger la carte des plaques pour obtenir des fonctionnalités supplémentaires. Ensuite, cliquez séquentiellement sur Exécuter l’analyse, sélectionnez Analyse multi-organoïde, Paramètres par défaut et enfin Analyser pour lancer l’analyse d’image. Cliquez sur Télécharger les résultats pour télécharger les tableaux de données brutes, qui contiennent les mesures pour chaque puits et les images ou vidéos segmentées avant de confirmer l’exactitude de l’analyse pour un traitement ultérieur des données.Pour tenir compte des variations de la densité et de la taille des semis organoïdes, des paramètres basés sur le taux de croissance ont été utilisés pour réduire les variations entre les répétitions, comme l’indiquent les barres d’erreur réduites. Les images du témoin négatif, du témoin positif et de la PDTO combinée traitée par gemcitabine et paclitaxel ont montré que le traitement induisait principalement un arrêt de la croissance avec une quantité limitée de mort cellulaire, correspondant à une valeur de réponse médicamenteuse normalisée, ou NDR, juste en dessous de zéro. En utilisant deux lignes supplémentaires, PDAC_052 et PDAC_087, une nette différence de taux de croissance entre les trois lignes a été observée, ce qui appuie l’utilisation de mesures GR.Les courbes dose-réponse NDR ont entraîné une augmentation de la plage dynamique et de la séparation entre les trois patients différents, par rapport aux courbes GR. La détermination du NDR au fil du temps a montré que PDAC_052 et PDAC_060 avaient une réponse cytostatique très similaire à une faible dose de gemcitabine-paclitaxel, tandis qu’une réponse cytostatique par rapport à cytotoxique différentielle claire pouvait être observée pour les doses moyennes et élevées correspondantes. Ces réponses médicamenteuses étaient cohérentes avec les réponses cliniques observées chez les patients.La dynamique clonale a révélé que PDAC_087 avait les sous-clones les plus résistants après le traitement, ce qui est cohérent avec la nature agressive de la maladie observée chez le patient, qui, fait intéressant, était également le moins sensible à la staurosporine témoin positive. L’aspect le plus important du protocole est de garder toutes les solutions contenant de l’ECM refroidies pendant l’ensemencement car une solidification incorrecte de l’ECM peut interférer avec l’analyse des images en aval. L’automatisation du travail de laboratoire humide, l’analyse d’images et le traitement des données en aval peuvent être utiles pour accélérer la recherche et identifier plus facilement de nouvelles thérapies combinées.

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Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

Analyse d’Invasion des cellules du Cancer et des médicaments anti-métastatique dépistage utilisant Hydrogel micro-chambre Array (HMCA)-plaques de base

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Un Workflow Simple Migration/Invasion à l’aide d’un imageur automatisé de cellules vivantes

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Établissement et caractérisation des sphéroïdes neuroendocrines de la petite intestin

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Un nouveau modèle 3D de Sphéroïde de tumeur de Stromal-Modulé pour étudier l’interaction de tumeur-Stroma et la découverte de drogue

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Dépistage de drogue des xénogreffes dérivées de tumeur de patient primaire dans le poisson-zèbre

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...