Name: multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis
Uploaded: 2022-12-23T13:50:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis at JoVE.com

इस शोध का एक हिस्सा विभिन्न दाताओं से दान द्वारा वित्त पोषित किया गया था, जिसमें शामिल हैं डेडे शिल्डे वीजेडडब्ल्यू तथा श्री विली फ्लोरेन। यह काम आंशिक रूप से फ्लेमिश रिसर्च फाउंडेशन, 12एस 9221 एन (एएल), जी044420 एन (एसवी, ए एल, ईजी), 1 एस 27021 एन (एमएल), और एंटवर्प विश्वविद्यालय के औद्योगिक अनुसंधान कोष, पीएस आईडी 45151 (एसवी, ए एल, सीडी) द्वारा वित्त पोषित है। चित्र 1 BioRender.com के साथ बनाया गया था।

<ol>
	<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Veninga, V., Voest, E. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+model+distinct+Vitamin+E+effects+at+different+stages+of+prostate+cancer+evolution.">Organoids model distinct Vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).</li><li>Godet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate-mapping+post-hypoxic+tumor+cells+reveals+a+ROS-resistant+phenotype+that+promotes+metastasis.">Fate-mapping post-hypoxic tumor cells reveals a ROS-resistant phenotype that promotes metastasis.</a> Nature Communications. 10 (1), 4862 (2019).</li><li>Letai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+precision+cancer+medicine-moving+beyond+pure+genomics.">Functional precision cancer medicine-moving beyond pure genomics.</a> Nature Medicine. 23 (9), 1028-1035 (2017).</li></ol>

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

मध्यम से उच्च-थ्रूपुट पीडीटीओ दवा स्क्रीनिंग अक्सर रीडआउट पर निर्भर करती है जो केवल जानकारी का एक अंश निकालती है जो ऑर्गेनोइड संभावित रूप से प्रदान कर सकती है। यह तेजी से स्पष्ट हो गया है कि, तेजी से विकसित ऑर्गेनॉइड तकनीक के लिए अधिक वैज्ञानिक और नैदानिक क्षमता का एहसास करने के लिए, अधिक उन्नत 3 डी परख, रीडआउट और विश्लेषण विधियों की गंभीर रूप से आवश्यकता है। यहां, एक उन्नत स्क्रीनिंग पाइपलाइन का वर्णन किया गया है, जो न केवल प्रजनन क्षमता को बढ़ाता है, बल्कि एआई-संचालित, लाइव-सेल इमेजिंग रीडआउट को शामिल करके नैदानिक ट्रांसलेबिलिटी को भी काफी बढ़ाता है। इन-हाउस विकसित विश्लेषण सॉफ्टवेयर के अलावा, सामान्यीकृत दवा प्रतिक्रिया मीट्रिक (एनडीआर) का उपयोग लागू किया जाता है, जो स्पष्ट रूप से उपचार प्रतिक्रिया 6 में रोगी-विशिष्ट अंतर को परिभाषित करने की अपनी क्षमता को प्रदर्शित करताहै। 
इस सामान्यीकरण मीट्रिक को शामिल करना निस्संदेह जबरदस्त मूल्य का होगा, यह याद करते हुए कि कई अध्ययनों का उद्देश्य वक्र (एयूसी) या अर्ध-अधिकतम निरोधात्मक एकाग्रता (आईसी50) के तहत क्षेत्र में मामूली अंतर के आधार पर उपचार प्रतिक्रियाओं को चित्रित करना है (क्योंकि अधिकांश खुराक-प्रतिक्रिया वक्र ओवरलैप होते हैं / एक दूसरे के करीब स्थित होते हैं) 11,12 . एटीपी-आधारित परख का उपयोग करके ऑर्गेनॉइड ड्रग स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल में वृद्धि दर मैट्रिक्स पहले से ही लागू किए गए हैं, लेकिन समय बिंदु 04 पर संदर्भ कुओं के सामान्यीकरण पर भरोसा करते हैं। इसके विपरीत, यह विधि इंट्रावेल विकास-दर सामान्यीकरण की अनुमति देती है, जो न केवल पीडीटीओ विकास दर में अंतर-रोगी अंतर के लिए जिम्मेदार है, बल्कि प्रजनन क्षमता बढ़ाने के लिए सीडिंग घनत्व और प्लेट स्थान-निर्भर प्रभावों में भिन्नता के परिणामस्वरूप अंतर-कल्याण अंतर भी है। इसके अलावा, हमने सामान्यीकरण 6,8 के लिए सकारात्मक नियंत्रण को शामिल करके इंटरपेशेंट पीडीटीओ प्रतिक्रिया के पृथक्करण को और बढ़ाने के लिए एनडीआर को अनुकूलित किया।
इसके अलावा, विश्लेषण, जो उच्च-थ्रूपुट और स्वचालन प्रारूपों के साथ संगत है, व्यक्तिगत ऑर्गेनोइड प्रतिक्रियाओं का सटीक रूप से पता लगा सकता है, जिससे सबक्लोनल प्रतिरोध की मात्रा का ठहराव संभव हो सकता है- ट्यूमर रिलैप्स और प्रगति13 की प्रमुख ड्राइविंग शक्ति। उदाहरण के लिए, हालांकि पीडीएसी 052 और पीडीएसी 060 ने विट्रो (एनडीआर के आधार पर) में उपचार के लिए अच्छी प्रतिक्रिया दिखाई, अतिरिक्त एकल-ऑर्गेनॉइड विश्लेषण उपक्लोनों की एक छोटी (बड़ी आबादी पीडीएसी 060 के साथ बड़ी आबादी) का पता लगाने में सक्षम था जो उपचार का जवाब नहीं देते हैं। दिलचस्प बात यह है कि यह नैदानिक अवलोकन के साथ अत्यधिक मेल खाता है, यह देखते हुए कि पीडीएसी 052 और पीडीएसी 060 में एक टिकाऊ प्रतिक्रिया थी (कोई ट्यूमर गतिविधि का पता नहीं चला) लेकिन अंततः दोनों को स्थानीय ट्यूमर प्रगति (प्रतिरोधी क्लोन की उपस्थिति के कारण) का निदान किया गया था। पारंपरिक 3 डी रीडआउट (एटीपी-आधारित परख और आकार / संख्या) की तुलना में, इस उन्नत स्क्रीनिंग पाइपलाइन से इन 'रोगियों-इन-द-लैब' से अधिक चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक जानकारी निकालकर पूर्वानुमानित प्रदर्शन में वृद्धि होने की उम्मीद है। इस परिकल्पना का परीक्षण अब लेखकों की प्रयोगशाला में नैदानिक पीडीटीओ नमूनों की स्क्रीनिंग करके किया जा रहा है ताकि विवो प्रतिक्रिया और नैदानिक परिणाम के साथ पूर्व विवो को सहसंबंधित किया जा सके।
दवा प्रतिक्रिया के तंत्र में अधिक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, साइटोटॉक्सिसिटी रंगों के अलावा पारंपरिक फ्लोरोसेंट लाइव-सेल इमेजिंग अभिकर्मक, कोशिका मृत्यु के तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस विधि के साथ संगत हैं। हमने पहले सिस्प्लैटिन उपचार 8 के बाद एपोप्टोसिस के कैसपेज़-निर्भर प्रेरण का अध्ययन करने के लिए सर्टोरियस कैस्पेज़ 3/7 ग्रीनअभिकर्मक के साथ इस विधि की संगतता दिखाई है। ऑक्सीडेटिव तनाव (सेलआरओएक्स अभिकर्मकों) या हाइपोक्सिया (छवि-आईटी हाइपोक्सिया अभिकर्मकों) का अध्ययन करने के लिए अन्य रंगों के साथ संगतता का परीक्षण किया जाना बाकी है। हालांकि, इन अभिकर्मकों को पहले से ही 3 डी इन विट्रो मॉडल14,15 में सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है।
छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर अन्य प्लेट प्रारूपों या संवर्धन विधियों (जैसे, माइक्रोकैविटी प्लेट्स, ईसीएम गुंबद) के साथ भी संगत है यदि ऑर्गेनोइड्स की स्पष्ट, इन-फोकस छवियों को कैप्चर किया जा सकता है। यह अक्सर गुंबदों में सुसंस्कृत ऑर्गेनोइड्स के लिए चुनौतीपूर्ण होता है क्योंकि वे विभिन्न जेड-प्लेन में बढ़ते हैं, जिसके लिए माइक्रोस्कोप की जेड-स्टैकिंग कार्यक्षमता की आवश्यकता होती है जो हमेशा उपलब्ध नहीं होती है। इसलिए, हम पर्याप्त गुणवत्ता की छवियों को सुनिश्चित करने के लिए फ्लैट-बॉटम यूएलए 384-वेल माइक्रोप्लेट के उपयोग की सलाह देते हैं। 
इसके अलावा, विश्लेषण अन्य लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम के साथ संगत है, जैसा कि पहले इनक्यूसाइट ज़ूम सिस्टम8 के साथ कैप्चर किए गए चरण-कंट्रास्ट छवियों के लिए दिखाया गया था। स्पार्क साइटो लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम की एक सीमा जिसका उपयोग इस पांडुलिपि में किया गया था, गतिज माप के लिए एक-प्लेट क्षमता है। हालांकि, स्पार्क मोशन विस्तार इसकी क्षमता को 40 माइक्रोप्लेट तक बढ़ाता है जिसे थोक में स्क्रीन किया जा सकता है। इन-हाउस विकसित सॉफ्टवेयर की संगतता को इन और अन्य प्रणालियों में विस्तारित किया जाएगा ताकि छवि और डेटा विश्लेषण पाइपलाइनों को मानकीकृत और स्वचालित करने के लक्ष्य के साथ एक मंच-अज्ञेय समाधान प्रदान किया जा सके। वेब-आधारित एप्लिकेशन में इंटरैक्टिव ग्राफिंग टूल और स्वचालित दवा मीट्रिक गणना भी शामिल होगी, जैसा कि इस पेपर में दिखाया गया है, मैनुअल विश्लेषण समय को कम करने के लिए।
लेबल-मुक्त पीडीटीओ विभाजन एल्गोरिथ्म को अलग-अलग रूपात्मक अंतर (ठोस, अर्ध-ठोस, सिस्टिक) के साथ विभिन्न इन-हाउस विकसित स्फेरॉइड और पीडीटीओ मॉडल पर प्रशिक्षित और परीक्षण किया गया था, और परिणामस्वरूप उच्च सटीकता के साथ इनका पता लगाया जा सकताहै। मॉडल की एक सीमा यह है कि सिस्टिक पीडीटीओ को शामिल करने से सीडिंग के बाद कुएं में मौजूद बुलबुले का अवांछित पता लगाने में वृद्धि हुई। हालांकि, रात भर इनक्यूबेशन इन बुलबुले में से अधिकांश को हटाने के लिए पर्याप्त था, जिससे गुणात्मक टाइमपॉइंट 0 स्कैन की अनुमति मिली। ऑर्गेनॉइड छवि विभाजन और विधि की सटीकता को अन्य उपयोगकर्ताओं द्वारा मान्य करने की आवश्यकता है, और उनकी प्रतिक्रिया के आधार पर, सॉफ्टवेयर को एक मजबूत और स्वचालित छवि विश्लेषण एल्गोरिथ्म प्राप्त करने के लिए आगे प्रशिक्षित किया जा सकता है। इसके अलावा, हम इस विधि द्वारा निर्धारित पूर्व विवो दवा प्रतिक्रिया को रोगी में नैदानिक प्रतिक्रिया से सहसंबंधित करने के लिए अधिक नैदानिक डेटा प्राप्त करने का लक्ष्य रखते हैं ताकि चिकित्सा प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने के लिए सर्वोत्तम मापदंडों की पहचान की जा सके और कार्यात्मक सटीक कैंसर दवा 16 के लिए इस विधिको विकसित किया जा सके।

हाल के वर्षों में, इन विट्रो कैंसर दवा की खोज, दवा स्क्रीनिंग और मौलिक अनुसंधान अमर सेल लाइनों के साथ पारंपरिक दो-आयामी (2 डी) कैंसर मॉडल के उपयोग से अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक त्रि-आयामी (3 डी) कैंसर मॉडल में संक्रमण कर रहे हैं। इसने स्थापित कैंसर सेल लाइनों के साथ ट्यूमर स्फेरॉइड को अपनाने के लिए प्रेरित किया है, जो ठोस ट्यूमर में मौजूद अधिक जटिल सेल-टू-सेल इंटरैक्शन और संरचनाओं को फिर से बनाते हैं। वर्तमान में, रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स (पीडीटीओ) इन विट्रो कैंसर अनुसंधान के लिए उपलब्ध सबसे उन्नत और शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3 डी कैंसर मॉडल हैं, क्योंकि वे ट्यूमर स्फेरॉइड पर अतिरिक्त लाभ प्रदान करते हैं, अर्थात् कैंसर रोगियों में पाई जाने वाली विषमता1। पीडीटीओ कैंसर रोगियों से उत्पन्न ट्यूमर ऊतक से स्थापित होते हैं, और इसलिए ट्यूमर फेनोटाइप और जीनोटाइप दोनों को बनाए रखते हैं। जैसे, पीडीटीओ मौलिक और ट्रांसलेशनल कैंसर अनुसंधान के लिए अमूल्य बन रहे हैं और सटीक ऑन्कोलॉजी2 में काफी सुधार करने की क्षमता रखते हैं। 
उनकी आशाजनक क्षमता के बावजूद, इन परिष्कृत 3 डी इन विट्रो कैंसर मॉडल अक्सर उन्नत विश्लेषण विधियों की कमी के कारण कम उपयोग किए जाते हैं। सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली परख इंट्रासेल्युलर एटीपी 3 की मात्रा का ठहराव के माध्यम से पीडीटीओ में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करतीहै। ये परख आम तौर पर एकल-समय बिंदु, थोक विश्लेषण होते हैं, इस प्रकार महत्वपूर्ण समय-निर्भर प्रतिक्रियाओं की अनदेखी करते हैं और क्लोनल प्रतिक्रियाओं की उपेक्षा करते हैं। विशेष रूप से, पीडीटीओ (विकास दर) के विकास की निगरानी करने की क्षमता और विशिष्ट उपचारों के लिए उनकी प्रतिक्रिया उच्च रुचि 4,5 है। सामान्यीकृत दवा प्रतिक्रिया (एनडीआर), जो सकारात्मक (ctrl+) और नकारात्मक नियंत्रण (ctrl-) स्थिति में सामान्यीकृत वृद्धि दर के आधार पर दवा प्रतिक्रिया को स्कोर करती है, को हाल ही में सेल-आधारित स्क्रीनिंग के साथ कैंसर की दवा संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मीट्रिक बताया गया है, हालांकि यह मुख्य रूप से 2 डी सेललाइनों 6 के लिए किया गया था। इसलिए, इन अधिक चिकित्सकीय प्रतिनिधि और जटिल 3 डी कैंसर मॉडल का पूरी तरह से लाभ उठाने के लिए अधिक परिष्कृत विश्लेषण विधियों की आवश्यकता है। माइक्रोस्कोपी को इन ऑर्गेनोइड मॉडल 7 की जटिलता का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण माना जाताहै।
यह पेपर पारंपरिक वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप और लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके 3 डी कैंसर मॉडल में गतिज दवा प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए एक विधि का वर्णन करता है। प्रजनन क्षमता बढ़ाने और श्रम के 'हैंड-ऑन' घंटों की संख्या को कम करने के लिए एक पिपेटिंग रोबोट, डिजिटल ड्रग डिस्पेंसर और लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके स्वचालन के साथ संगत होने के लिए ड्रिहुइस एट अल.4 द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलन किए गए थे। यह विधि स्थापित कैंसर सेल लाइनों के साथ दोनों ट्यूमर स्फेरॉइड की मध्यम से उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग की अनुमति देती है (परीक्षण किए गए सेल लाइनों के लिए पूरक तालिका एस 1 देखें), साथ ही पीडीटीओ, 384-वेल माइक्रोप्लेट और मल्टी-ऑर्गेनॉइड प्रारूप में। एक संक्रामक नेटवर्क मशीन सीखने की प्रक्रिया का उपयोग करके, व्यक्तिगत ट्यूमर स्फेरॉइड या पीडीटीओ की स्वचालित पहचान और ट्रैकिंग पूरी तरह से ब्राइटफील्ड इमेजिंग से और फ्लोरोसेंट लाइव-सेल लेबलिंग रंजक8 के उपयोग के बिना की जा सकती है। यह अत्यधिक फायदेमंद है, क्योंकि ब्राइटफील्ड इमेजिंग के साथ अधिकांश पहचान के लिए मैनुअल एनोटेशन की आवश्यकता होती है (जो श्रमसाध्य और समय लेने वाली होती है) या फ्लोरोसेंट रंगों को जोड़ने की आवश्यकता होती है, जो फोटोक्सिसिटी-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव से संबंधित दवा प्रतिक्रियाओं को भ्रमित कर सकतेहैं।
परिणामस्वरूप इन-हाउस विकसित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पारंपरिक लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम की कार्यक्षमता का विस्तार करता है, क्योंकि 3 डी छवि विश्लेषण मॉड्यूल या तो उपलब्ध नहीं हैं, प्लेटफ़ॉर्म-प्रतिबंधित हैं, या 384-वेल माइक्रोप्लेट और होल-वेल इमेजिंग के साथ संगत नहीं हैं। इसके अलावा, ये मॉड्यूल अक्सर अत्यधिक कीमत वाले होते हैं और सीमित थोक ऑर्गेनॉइड रीडआउट प्रदान करते हैं। इसलिए, यह विधि उन वैज्ञानिकों के लिए अत्यधिक प्रासंगिक है जिनके पास व्यापक रूप से उपलब्ध लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम तक पहुंच है और स्वर्ण-मानक लेकिन अल्पविकसित एटीपी-आधारित परख की तुलना में दवा प्रतिक्रिया के बारे में अधिक जानकारी निकालने का लक्ष्य रखते हैं। विशिष्ट कोशिका मृत्यु संकेतकों के अलावा, साइटोस्टैटिक दवा प्रतिक्रियाओं को साइटोटोक्सिक प्रतिक्रियाओं से अलग किया जा सकता है, इस प्रकार यांत्रिक दवा कार्यों में आगे अंतर्दृष्टि प्रदान करता है जो वर्तमान में एकल-टाइमपॉइंट विश्लेषण से अप्राप्य है। अंत में, लाइव-सेल इमेजिंग प्रतिक्रिया विषमता को पकड़ने और संभावित प्रतिरोधी उपक्लोनों की पहचान करने के लिए एकल ऑर्गनॉइड दवा प्रतिक्रिया मैट्रिक्स प्राप्त करने के लिए व्यक्तिगत ऑर्गनॉइड ट्रैकिंग की अनुमति देता है।
इस पद्धति और संबंधित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का लक्ष्य उपयोगकर्ता हस्तक्षेप को सीमित करने और हैंडलिंग, छवि विश्लेषण और डेटा विश्लेषण में परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए ऑर्गेनॉइड ड्रग स्क्रीनिंग में कम लागत वाले स्वचालन को लागू करना है। इस सॉफ्टवेयर को शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध कराने के लिए, यह माइक्रोस्कोप- और प्लेटफ़ॉर्म-अज्ञेयवादी है, और एक क्लाउड-आधारित एप्लिकेशन उपलब्ध कराया गया है। इस प्रकार, पारंपरिक लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम का समर्थन करके, हम 3 डी संवर्धन अनुप्रयोगों और विश्लेषण के लिए उनकी कार्यक्षमता में सुधार करने का भी लक्ष्य रखते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel p300 (GEN 2) pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom ULA microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4588</td>
			<td>minimum volume 50 &#181;L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom ULA Phenoplate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6057802</td>
			<td>minimum volume 75 &#181;L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A8301</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADF+++</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Advanced DMEM/F12, 1% GlutaMAX, 1% HEPES, 1% penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe easy sealing membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z380059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase 3/7 Green&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Slides for TC10/TC20</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1450017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td>ATP-assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler for 25 mL reservoir</td>
			<td>VWR (Diversified Biotech)</td>
			<td>490006-908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling element 12 x 8 x 3 cm</td>
			<td>Bol.com</td>
			<td>9200000107744702</td>
			<td>For custom microplate holder OT-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Organoid Harvesting Solution</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3700-100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2&#160;</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotox Green</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotox Red</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300e</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Digital drug dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300e Control v3.3.5</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Control software D300e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ADF+++ supplemented with 0.5 nM WNT surrogate-Fc-Fusion protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium, 4% Rpso3-Fc Fusion Protein conditioned medium, 1x B27, 1 mM N-acetyl cysteine (NAC), 5 mM nicotinamide, 500 nM A83-01, 100 ng/mL FGF10, and 10 nM Gastrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemcitabine</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) patient-derived organoids</td>
			<td>Biobank@uza (Antwerp, Belgium; ID: BE71030031000; Belgian Virtual Tumorbank funded by the National Cancer Plan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentrons App v6.0.1</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>OT-2 control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentrons Protocol Designer Tool</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>https://designer.opentrons.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbits data compression tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>www.orbits-oncology.com or contact corresponding author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbits image analysis webapp</td>
			<td>University of Antwerp</td>
			<td></td>
			<td>www.orbits-oncology.com or contact corresponding author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Pipetting robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipette 230 mm&#160;</td>
			<td>Novolab</td>
			<td>A33696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peniciline-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspo3-Fc Fusion Protein conditioned medium</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spark Cyto 600</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell imaging and multi-mode platereader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SparkControl v3.1</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Spark Cyto control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 25 mL reservoir</td>
			<td>VWR (Diversified Biotech)</td>
			<td>10141-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T8 plus cassette</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>233360010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT Surrogate-Fc-Fusion protein</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis

रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स (पीडीटीओ) प्रीक्लिनिकल और ट्रांसलेशनल अनुसंधान के लिए बहुत वादा करते हैं और पूर्व विवो ड्रग स्क्रीनिंग से रोगी चिकित्सा प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करते हैं। हालांकि, वर्तमान एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) आधारित दवा स्क्रीनिंग परख एक दवा प्रतिक्रिया (साइटोस्टैटिक या साइटोटोक्सिक) और इंट्राट्यूमर विषमता की जटिलता को कैप्चर नहीं करती है जिसे थोक रीडआउट के कारण पीडीटीओ में बनाए रखा गया है। लाइव-सेल इमेजिंग इस मुद्दे को दूर करने और दवा प्रतिक्रियाओं को अधिक गहराई से कल्पना करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। हालांकि, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर अक्सर पीडीटीओ के त्रि-आयामीता के लिए अनुकूलित नहीं होता है, फ्लोरोसेंट व्यवहार्यता रंजक की आवश्यकता होती है, या 384-वेल माइक्रोप्लेट प्रारूप के साथ संगत नहीं होता है। यह पेपर पारंपरिक, वाइडफील्ड, लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके उच्च-थ्रूपुट, 384-वेल प्रारूप में पीडीटीओ को बीज, उपचार और छवि बनाने के लिए एक अर्ध-स्वचालित पद्धति का वर्णन करता है। इसके अलावा, हमने विकास दर-आधारित दवा प्रतिक्रिया मैट्रिक्स को निर्धारित करने के लिए व्यवहार्यता मार्कर-मुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर विकसित किया है जो विभिन्न पीडीटीओ लाइनों के बीच प्रजनन क्षमता और सही विकास दर भिन्नताओं में सुधार करता है। सामान्यीकृत दवा प्रतिक्रिया मीट्रिक का उपयोग करके, जो सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण स्थिति में सामान्यीकृत विकास दर के आधार पर दवा प्रतिक्रिया को स्कोर करता है, और एक फ्लोरोसेंट सेल डेथ डाई, साइटोटोक्सिक और साइटोस्टैटिक दवा प्रतिक्रियाओं को आसानी से अलग किया जा सकता है, उत्तरदाताओं और गैर-उत्तरदाताओं के वर्गीकरण में गहराई से सुधार होता है। इसके अलावा, संभावित, प्रतिरोधी क्लोन की पहचान करने के लिए एकल-ऑर्गेनॉइड दवा प्रतिक्रिया विश्लेषण से दवा-प्रतिक्रिया विषमता की मात्रा निर्धारित की जा सकती है। अंततः, इस पद्धति का उद्देश्य एक बहुपैरामीट्रिक दवा प्रतिक्रिया हस्ताक्षर को कैप्चर करके नैदानिक चिकित्सा प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी में सुधार करना है, जिसमें गतिज विकास गिरफ्तारी और कोशिका मृत्यु परिमाणीकरण शामिल है।

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Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

यह प्रोटोकॉल इंट्राट्यूमर विषमता को पकड़ने के लिए मल्टीपैरामीट्रिक, सिंगल-ऑर्गेनॉइड दवा प्रतिक्रियाओं को मापने और कल्पना करने के लिए मध्यम से उच्च-थ्रूपुट ऑर्गेनोइड ड्रग स्क्रीनिंग और माइक्रोस्कोप-अज्ञेयवादी, स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए एक अर्ध-स्वचालित विधि का वर्णन करता है।

थोक और एकल-ऑर्गेनॉइड विश्लेषण के लिए वाइडफील्ड लाइव-सेल इमेजिंग का उपयोग करके मल्टीपैरामीट्रिक ट्यूमर ऑर्गेनॉइड ड्रग स्क्रीनिंग

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

स्पर्श छाप Cytology का उपयोग नैदानिक रोग नमूनों से उच्च गुणवत्ता वाले ट्यूमर डीएनए प्राप्त करने के लिए सरल और तेजी से विधि

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

रेडियोन्यूक्लाइड-प्रतिदीप्ति रिपोर्टर जीन इमेजिंग कुतर ट्यूमर मॉडल में ट्यूमर प्रगति को ट्रैक करने के लिए

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

दवा स्क्रीनिंग के लिए उच्च प्रवाह तीन आयामी ट्यूमर Spheroids की पीढ़ी

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

लाइव सेल इमेजिंग परख ग्लियोब्लास्टोमा ब्रेन ट्यूमर स्टेम सेल प्रवासन और आक्रमण का अध्ययन करने के लिए

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

कैंसर सेल आक्रमण और विरोधी मेटास्टेटिक दवा Hydrogel सूक्ष्म चैंबर सरणी (HMCA) का उपयोग कर स्क्रीनिंग के विश्लेषण-प्लेट्स आधारित

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

स्वचालित लाइव-सेल Imager का उपयोग करके एक साधारण माइग्रेशन/

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

स्थापना और छोटे आंत्र neuroendocrine ट्यूमर Spheroids की विशेषता

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

ट्यूमर-स्ट्रोमा इंटरैक्शन और ड्रग डिस्कवरी का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट-मोडलेटेड 3डी ट्यूमर स्फेरॉइड मॉडल

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

जेब्राफिश में प्राथमिक रोगी व्युत्पन्न ट्यूमर ज़ेनोग्राफ्ट की दवा जांच

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...