Name: multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis
Uploaded: 2022-12-23T13:50:00
Duration: 12 min 41 s
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この研究の一部は、Dedert Schilde vzwやWilly Floren氏を含むさまざまなドナーからの寄付によって資金提供されました。この研究の一部は、フランダース研究財団、12S9221N(A.L.)、G044420N(S.V.、A.L.、E.G.)、1S27021N(M.L.)、およびアントワープ大学の産業研究基金、PS ID 45151(S.V.、A.L.、C.D.)によって資金提供されています。 図 1 は BioRender.com で作成されました。

<ol>
	<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Veninga, V., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+organoids:+Opportunities+and+challenges+to+guide+precision+medicine.">Tumor organoids: Opportunities and challenges to guide precision medicine.</a> Cancer Cell. 39 (9), 1190-1201 (2021).</li><li>Le Compte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+as+individual+patient+models+for+chemoradiation+response+prediction+in+gastrointestinal+malignancies.">Patient-derived organoids as individual patient models for chemoradiation response prediction in gastrointestinal malignancies.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 157, 103190 (2021).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li><li>Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+inhibition+metrics+correct+for+confounders+in+measuring+sensitivity+to+cancer+drugs.">Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs.</a> Nature Methods. 13 (6), 521-527 (2016).</li><li>Gupta, A., Gautam, P., Wennerberg, K., Aittokallio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+normalized+drug+response+metric+improves+accuracy+and+consistency+of+anticancer+drug+sensitivity+quantification+in+cell-based+screening.">A normalized drug response metric improves accuracy and consistency of anticancer drug sensitivity quantification in cell-based screening.</a> Communications Biology. 3 (1), 42 (2020).</li><li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+organoids:+a+bright+future+ahead.">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li><li>Deben, C., Cardenas, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrBITS:+label-free+and+time-lapse+monitoring+of+patient+derived+organoids+for+advanced+drug+screening.">OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening.</a> Cellular Oncology. , (2022).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> Bioessays. 39 (8), (2017).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Engel, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+colorectal+cancer+organoids+upregulate+revival+stem+cell+marker+genes+following+chemotherapeutic+treatment.">Patient-derived colorectal cancer organoids upregulate revival stem cell marker genes following chemotherapeutic treatment.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (1), 128 (2020).</li><li>Hennig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+drug+resistance+in+pancreatic+cancer+organoids+guides+optimized+chemotherapy+treatment.">Detecting drug resistance in pancreatic cancer organoids guides optimized chemotherapy treatment.</a> The Journal of Pathology. 257 (5), 607-619 (2022).</li><li>D'Alterio, C., Scala, S., Sozzi, G., Roz, L., Bertolini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+effects+of+chemotherapy+on+tumor+relapse+and+metastasis+promotion.">Paradoxical effects of chemotherapy on tumor relapse and metastasis promotion.</a> Seminars in Cancer Biology. 60, 351-361 (2020).</li><li>Njoroge, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+model+distinct+Vitamin+E+effects+at+different+stages+of+prostate+cancer+evolution.">Organoids model distinct Vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).</li><li>Godet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate-mapping+post-hypoxic+tumor+cells+reveals+a+ROS-resistant+phenotype+that+promotes+metastasis.">Fate-mapping post-hypoxic tumor cells reveals a ROS-resistant phenotype that promotes metastasis.</a> Nature Communications. 10 (1), 4862 (2019).</li><li>Letai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+precision+cancer+medicine-moving+beyond+pure+genomics.">Functional precision cancer medicine-moving beyond pure genomics.</a> Nature Medicine. 23 (9), 1028-1035 (2017).</li></ol>

著者は利益相反を宣言しません。

中スループットからハイスループットのPDTO薬物スクリーニングは、オルガノイドが潜在的に提供できる情報のほんの一部しか抽出しない読み出しに依存することがよくあります。急速に進化するオルガノイド技術がより大きな科学的および臨床的可能性を実現するためには、より高度な3Dアッセイ、読み出し、および分析方法が不可欠であることがますます明らかになっています。ここでは、再現性を高めるだけでなく、AI駆動の生細胞イメージング読み出しを組み込むことで臨床翻訳可能性を大幅に向上させる高度なスクリーニングパイプラインについて説明します。社内で開発された分析ソフトウェアに加えて、正規化された薬物反応指標(NDR)の使用が実装されており、治療反応における患者固有の違いを定義する能力を明確に示しています6。 
この正規化指標を含めることは間違いなく非常に価値があり、多くの研究が曲線下面積(AUC)または半最大阻害濃度(IC50)のわずかな違いに基づいて治療反応を描写することを目的としていることを思い出してください(ほとんどの用量反応曲線は互いに重なり合っている/近くに位置しているため)11,12。.成長率の指標は、ATPベースのアッセイを用いたオルガノイド薬物スクリーニングプロトコルですでに実装されていますが、時点0から4で溶解された参照ウェルの正規化に依存しています。対照的に、この方法では、PDTO成長率の患者間差だけでなく、播種密度の変動とプレート位置依存効果に起因するウェル間差も考慮して再現性を高めるウェル内成長率の正規化が可能になります。さらに、正常化のためのポジティブコントロールを含めることにより、患者間PDTO応答の分離をさらに高めるようにNDRを適応させました6,8。
さらに、ハイスループットおよび自動化フォーマットと互換性のあるこの分析は、個々のオルガノイド応答を正確に検出できるため、腫瘍の再発と進行の主要な原動力であるサブクローナル耐性の定量が可能になります13。例えば、PDAC052およびPDAC060は in vitro での治療に対して良好な反応を示したが(NDRに基づく)、追加の単一オルガノイド分析では、治療に反応しないサブクローンの小さな(より大きな集団)集団を検出することができた。興味深いことに、PDAC052とPDAC060は持続的な反応(腫瘍活動は検出されなかった)を示したが、最終的には両方とも局所腫瘍進行と診断された(耐性クローンの存在による)ことを考えると、これは臨床観察と非常に一致した。従来の3D読み出し(ATPベースのアッセイとサイズ/数)と比較して、この高度なスクリーニングパイプラインは、これらの「ラボ内の患者」からより臨床的に関連する情報を抽出することにより、予測パフォーマンスを向上させることが期待されます。この仮説は現在、著者の研究室で臨床PDTOサンプルをスクリーニングすることによってテストされています この方法を使用して、 ex vivoを in vivo 応答および臨床転帰と相関させます。 
薬物応答のメカニズムに関するより多くの洞察を得るために、細胞毒性色素に加えて、従来の蛍光生細胞イメージング試薬がこの方法に適合し、細胞死のメカニズムを研究します。シスプラチン処理後のカスパーゼ依存的なアポトーシス誘導を研究するために、この方法とザルトリウスカスパーゼ3/7グリーン試薬との適合性を以前に示しました8。酸化ストレス(CellROX試薬)または低酸素症(Image-iT低酸素試薬)を研究するための他の色素との適合性は、まだテストされていません。しかしながら、これらの試薬は、すでに3D インビトロ モデル14、15において首尾よく使用されている。 
画像解析ソフトウェアは、オルガノイドの鮮明で焦点の合った画像をキャプチャできる場合、他のプレートフォーマットまたは培養方法(マイクロキャビティプレート、ECMドームなど)とも互換性があります。ドームで培養されたオルガノイドは異なるz面で成長するため、これはしばしば困難であり、常に利用できるとは限らない顕微鏡のzスタッキング機能が必要です。したがって、十分な品質の画像を確保するために、平底ULA 384ウェルマイクロプレートの使用をお勧めします。 
さらに、この分析は、IncuCyte ZOOMシステム8でキャプチャされた位相差画像について前に示したように、他の生細胞イメージングシステムと互換性があります。この原稿で使用されたSpark Cyto生細胞イメージングシステムの制限は、速度論的測定のためのワンプレート容量です。ただし、Spark Motion拡張により、容量は最大40枚のマイクロプレートに増加し、まとめてスクリーニングできます。自社開発のソフトウェアの互換性をこれらのシステムや他のシステムに拡張し、プラットフォームに依存しないソリューションを提供し、画像およびデータ分析パイプラインの標準化と自動化を目標としています。Webベースのアプリケーションには、このホワイトペーパーに示すように、インタラクティブなグラフ作成ツールと自動化された薬物測定計算も含まれ、手動分析時間を短縮します。
ラベルフリーのPDTOセグメンテーションアルゴリズムは、明確な形態学的違い(固体、半固体、嚢胞性)を持つさまざまな社内成長回転楕円体およびPDTOモデルでトレーニングおよびテストされており、その結果、これらを高精度で検出できます8。このモデルの限界は、嚢胞性PDTOを含めると、播種後のウェルに存在する気泡の望ましくない検出が増加したことです。しかし、一晩のインキュベーションは、これらの気泡のほとんどを除去するのに十分であり、定性的なタイムポイント0スキャンを可能にした。オルガノイド画像のセグメンテーションと方法の精度は、他のユーザーによって検証される必要があり、そのフィードバックに基づいて、ソフトウェアをさらにトレーニングして、堅牢で自動化された画像分析アルゴリズムを取得できます。さらに、この方法で定量化された 生体外 薬物反応を患者の臨床反応と相関させるためのより多くの臨床データを取得し、治療反応を予測するための最良のパラメーターを特定し、機能的精密癌医学のためにこの方法をさらに開発することを目指しています16。

近年、 in vitro がんの創薬、薬物スクリーニング、および基礎研究は、不死化細胞株を備えた従来の2次元(2D)がんモデルの使用から、より生理学的に関連する3次元(3D)がんモデルへの移行が進んでいます。これにより、固形腫瘍に存在するより複雑な細胞間相互作用および構造を再現する、確立された癌細胞株を有する腫瘍スフェロイドの採用に拍車がかかる。現在、患者由来の腫瘍オルガノイド(PDTO)は、腫瘍スフェロイドよりも追加の利点、つまりがん患者に見られる不均一性を提供するため、 in vitro がん研究に利用できる最も先進的で生理学的に関連性のある3Dがんモデルです1。PDTOは、がん患者に由来する腫瘍組織から確立されるため、腫瘍表現型と遺伝子型の両方を保持します。このように、PDTOは基礎がんおよびトランスレーショナルがん研究にとって非常に貴重になりつつあり、精密腫瘍学を大幅に改善する可能性を秘めています2。 
有望な可能性にもかかわらず、これらの洗練された3Din vitroがんモデルは、高度な分析方法がないため、十分に活用されていないことがよくあります。最も一般的に使用されるアッセイは、細胞内ATP3の定量を介してPDTO中の生存細胞の数を決定する。これらのアッセイは通常、単一時点のバルク分析であるため、重要な時間依存応答を見落とし、クローン応答を無視します。具体的には、PDTOの成長(成長率)および特定の治療法に対するそれらの反応を監視する能力は、非常に興味深い4,5。陽性(ctrl+)および陰性対照(ctrl-)状態に正規化された成長率に基づいて薬物反応をスコアリングする正規化薬物反応(NDR)も、主に2D細胞株に対して行われていましたが、細胞ベースのスクリーニングで抗がん剤感受性を評価するための重要な指標であることが最近報告されています6。したがって、これらのより臨床的に代表的で複雑な3Dがんモデルを十分に活用するには、より高度な分析方法が必要です。顕微鏡検査は、これらのオルガノイドモデルの複雑さを研究するための強力なアプローチと考えられています7。
この論文では、従来の広視野顕微鏡と生細胞イメージングシステムを使用して、3Dがんモデルにおけるキネティックドラッグ応答をモニタリングする方法について説明します。Driehuisら4によって記述されたプロトコルは、ピペッティングロボット、デジタル薬剤ディスペンサー、および生細胞イメージングシステムを使用した自動化と互換性があり、再現性を高め、「実践的」労働時間の数を減らすように適応されました。この方法では、384ウェルマイクロプレートおよびマルチオルガノイドフォーマットで、確立された癌細胞株(試験細胞株については補足表S1を参照)を有する腫瘍スフェロイドとPDTOの両方の中スループットからハイスループットの薬物スクリーニングが可能になります。畳み込みネットワーク機械学習プロセスを使用することにより、蛍光生細胞標識色素を使用せずに、明視野イメージングのみから個々の腫瘍スフェロイドまたはPDTOの自動同定と追跡を実行できます8。明視野イメージングによるほとんどの同定は、手動アノテーションを必要とする(これは面倒で時間がかかる)か、蛍光色素の添加を必要とし、光キシシティ誘発酸化ストレスに関連する薬物応答を混乱させる可能性があるため、これは非常に有利です9。
自社で開発された画像解析ソフトウェアは、3D画像解析モジュールが利用できないか、プラットフォームが制限されているか、384ウェルマイクロプレートおよびホールウェルイメージングと互換性がないため、従来の生細胞イメージングシステムの機能を拡張します。さらに、これらのモジュールは多くの場合、高価格であり、バルクオルガノイドの読み出しが制限されています。したがって、この方法は、広く利用可能な生細胞イメージングシステムにアクセスでき、ゴールドスタンダードであるが初歩的なATPベースのアッセイと比較して、薬物反応に関するより多くの情報を抽出することを目指す科学者にとって非常に関連性があります。特定の細胞死指標を追加することで、細胞増殖抑制薬物応答を細胞傷害反応と区別することができ、単一時点解析では現在達成できない機構的な薬物作用に関するさらなる洞察を提供します。最後に、生細胞イメージングにより、個々のオルガノイド追跡により、単一のオルガノイド薬物応答メトリックを取得し、応答の不均一性をキャプチャし、潜在的な耐性サブクローンを特定できます。
この方法および関連する画像解析ソフトウェアの目標は、オルガノイド薬物スクリーニングにおいて低コストの自動化を実装して、ユーザーの介入を制限し、取り扱い、画像解析、およびデータ解析におけるばらつきを低減することである。このソフトウェアを研究者が利用できるようにするために、顕微鏡やプラットフォームに依存せず、クラウドベースのアプリケーションが利用可能になります。そのため、従来の生細胞イメージングシステムをサポートすることで、3D培養アプリケーションや解析への機能向上も目指しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel p300 (GEN 2) pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom ULA microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4588</td>
			<td>minimum volume 50 &#181;L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom ULA Phenoplate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6057802</td>
			<td>minimum volume 75 &#181;L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A8301</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADF+++</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Advanced DMEM/F12, 1% GlutaMAX, 1% HEPES, 1% penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe easy sealing membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z380059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase 3/7 Green&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Slides for TC10/TC20</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1450017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td>ATP-assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler for 25 mL reservoir</td>
			<td>VWR (Diversified Biotech)</td>
			<td>490006-908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling element 12 x 8 x 3 cm</td>
			<td>Bol.com</td>
			<td>9200000107744702</td>
			<td>For custom microplate holder OT-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Organoid Harvesting Solution</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3700-100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2&#160;</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotox Green</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotox Red</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300e</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Digital drug dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300e Control v3.3.5</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Control software D300e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ADF+++ supplemented with 0.5 nM WNT surrogate-Fc-Fusion protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium, 4% Rpso3-Fc Fusion Protein conditioned medium, 1x B27, 1 mM N-acetyl cysteine (NAC), 5 mM nicotinamide, 500 nM A83-01, 100 ng/mL FGF10, and 10 nM Gastrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemcitabine</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) patient-derived organoids</td>
			<td>Biobank@uza (Antwerp, Belgium; ID: BE71030031000; Belgian Virtual Tumorbank funded by the National Cancer Plan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentrons App v6.0.1</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>OT-2 control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentrons Protocol Designer Tool</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>https://designer.opentrons.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbits data compression tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>www.orbits-oncology.com or contact corresponding author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbits image analysis webapp</td>
			<td>University of Antwerp</td>
			<td></td>
			<td>www.orbits-oncology.com or contact corresponding author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Pipetting robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipette 230 mm&#160;</td>
			<td>Novolab</td>
			<td>A33696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peniciline-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspo3-Fc Fusion Protein conditioned medium</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spark Cyto 600</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell imaging and multi-mode platereader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SparkControl v3.1</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Spark Cyto control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 25 mL reservoir</td>
			<td>VWR (Diversified Biotech)</td>
			<td>10141-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T8 plus cassette</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>233360010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT Surrogate-Fc-Fusion protein</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis

患者由来の腫瘍オルガノイド(PDTO)は、前臨床およびトランスレーショナル研究、および ex vivo 薬物スクリーニングからの患者の治療反応の予測に大きな期待を寄せています。ただし、現在のアデノシン三リン酸(ATP)ベースの薬物スクリーニングアッセイでは、バルク読み出しのためにPDTOに保持されることが示されている薬物反応(細胞増殖抑制または細胞毒性)および腫瘍内の不均一性の複雑さを捉えていません。生細胞イメージングは、この問題を克服し、薬物反応をより詳細に視覚化するための強力なツールです。ただし、画像解析ソフトウェアは、PDTOの3次元性に適合していないか、蛍光生存率色素を必要とするか、384ウェルマイクロプレートフォーマットと互換性がないことがよくあります。この論文では、従来の広視野生細胞イメージングシステムを使用して、ハイスループットの384ウェルフォーマットでPDTOをシード、処理、およびイメージングするための半自動化された方法論について説明します。さらに、生存率マーカーを使用しない画像解析ソフトウェアを開発し、再現性を向上させ、異なるPDTO株間の成長率の変動を修正する成長率ベースの薬物反応指標を定量化しました。陽性および陰性の対照条件に正規化された増殖速度に基づいて薬物応答をスコアリングする正規化薬物応答メトリックと蛍光細胞死色素を使用すると、細胞毒性および細胞増殖抑制薬物応答を簡単に区別でき、応答者と非応答者の分類を大幅に改善します。さらに、薬物応答の不均一性は、単一オルガノイド薬物応答分析から定量化することにより、潜在的な耐性クローンを特定することができます。最終的に、この方法は、速度論的成長停止および細胞死の定量化を含むマルチパラメトリック薬物応答シグネチャを捕捉することによって、臨床治療応答の予測を改善することを目的としている。

自動ピペッティングプロトコルにより、384ウェルマイクロプレートのすべてのカラムにPDAC_060 PDTOが均一に分布します(図2A)。予想通り、PDTOの数と平均面積にウェル間でばらつきが観察されました(図2A、B)。全生存面積(全明視野面積 - 全緑面積)は、ラベルフリーオルガノイドセグメンテーションと蛍光ベースの細胞死シグナルを組み合わせたもので、私たちの経験では、経時的な薬物反応を研究するための最も堅牢なパラメータです(図2C)8。細胞播種とオルガノイドサイズのばらつきを説明するには、図2Dと図2Cのエラーバーの減少、および薬物スクリーニングの品質が大幅に改善されたことを示すZファクターが高いことからわかるように、増殖速度ベースの測定基準を使用して反復間の変動を減らす必要があります(図2E)。
ctrl-およびctrl+に正規化されたNDR用量反応曲線(図2G)は、薬物反応曲線の分離を増加させ、細胞傷害性薬物反応をより正確に表すため、ctrl-に正規化されたGR用量反応曲線(図2F)よりも明らかに優れています。ctrl-、ctrl+、および400 nMゲムシタビン/80 nMパクリタキセルで処理されたPDTOの関連画像の例を 図3に示します。興味深い観察結果は、パクリタキセルの付加価値が観察されなかったため、ゲムシタビンの細胞毒性効果が併用療法で支配的であったことです。
次に、2つの追加のPDTOライン、PDAC_052とPDAC_087を使用しました。これらの線の間には明らかな成長率の違いが観察され(図4A)、これはGRメトリックの使用を支持しています。繰り返しになりますが、NDR用量反応曲線(図4C)は、GR曲線(図4B)と比較して、3人の異なる患者間のダイナミックレンジと分離の増加をもたらしました。さらに、このプロトコルは、時間の経過に伴うNDRの決定を可能にし、PDAC_052とPDAC_060が低用量のgem-pacに対して非常に類似した細胞増殖抑制薬物反応を示したことを示しています(図4D)、gem-pacの中間用量(図4E)と高用量(図4F)では、細胞増殖抑制反応と細胞毒性反応の明確な差が観察されました。これらの薬物反応は、患者で観察された臨床反応と一致していました(図4G)。
最後に、このアプローチとソフトウェアの主な利点は、単一オルガノイド薬物応答を定量化して、応答の不均一性を研究し、潜在的に耐性のあるサブクローンを特定できることです。 図5 は、異なる患者のクローン動態の明確な概要を提供し、PDAC-087が治療後に最も耐性のあるサブクローンを有することを示しており、これは患者で観察された攻撃的で耐性の高い疾患と一致している。興味深いことに、この患者はctrl +スタウロスポリンに対して最も感受性が低かった。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig01.jpg"> 図 1: ワークフローの概要。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig02v2.jpg"> 図2:播種精度と薬物反応指標 。 (A)ピペッティングロボットを使用して384ウェルマイクロプレートに播種したPDAC_060 PDTOのオルガノイド数/ウェル。各ドットは単一のウェル内のカウントを表し、プロットは384ウェルマイクロプレートカラムで区切られています。(B)平均PDTO面積/井戸。(C)ゲムシタビン/パクリタキセルの比率が5:1で処理されたPDAC_060 PDTOの総生存面積(全明視野面積-全緑面積)および(D)成長率(T0 = 1に正規化された全生存面積)。(E)アッセイ品質の指標としてのZファクター。(F)ctrl-に正規化された成長率-用量反応曲線、および(G)ctrl-およびctrl+に正規化された正規化された薬物反応曲線。エラーバーは±2つのウェルの平均SDを示します。略語:PDAC =膵管腺癌;PDTO =患者由来の腫瘍オルガノイド;GR =成長率;NDR =正規化された薬物反応。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig02largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig03.jpg"> 図3:画像の例。 ビヒクル(ctrl-)、400 nMゲムシタビン/80 nMパクリタキセル、および2 μMスタウロスポリン(ctrl+)で処理したPDAC_060 PDTOの代表的な画像。左の列は明視野画像、中央の列はCytotox Green蛍光シグナル、右の列はオルガノイド分析モジュールを使用したラベルフリーの注釈付き明視野画像を示しています。スケールバー= 100μm。略語:PDAC =膵管腺癌;PDTO =患者由来の腫瘍オルガノイド;GemPac = ゲムシタビン/パクリタキセル。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig04.jpg"> 図4:患者間の薬物反応の比較 。 (A)PDAC_052、PDAC_060、およびPDAC_087 PDTO株の成長率(全生存面積に基づく)の比較。(B)ctrl-に正規化された成長率-用量反応曲線、および(C)ctrl-およびctrl+に正規化された正規化された薬物反応曲線。(D)低用量、(E)中用量、および(F)高用量のゲムシタビン/パクリタキセル(5:1比)の速度論的NDR。(G)PDAC患者の臨床的特徴。エラーバーは±2つのウェルの平均SDを示します。略語:PDAC =膵管腺癌;PDTO =患者由来の腫瘍オルガノイド;GR =成長率;NDR =正規化された薬物反応;FFX =フォルフィリノックス。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig05.jpg"> 図5:単一オルガノイド測定基準。 ビヒクル(ctrl-)、400 nMゲムシタビン/80 nMパクリタキセル、および2 μMスタウロスポリン(ctrl+)で処理されたPDAC_052、PDAC_060、およびPDAC_087 PDTOの細胞死(緑領域/明視野領域)および面積(明視野)に基づく単一オルガノイド用量反応。緑色の領域は生存可能なオルガノイドを示します。青色の領域は、GemPac および ctrl+ プロットの x-as 範囲を示します。略語:PDAC =膵管腺癌;PDTO =患者由来の腫瘍オルガノイド;GemPac = ゲムシタビン/パクリタキセル。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>セル懸濁ストック</td>
			<td>セル/ドロップ</td>
			<td># 滴 (20 μL)</td>
			<td>在庫 (1/3)</td>
			<td>ECM (2/3)</td>
		</tr><tr><td>1.13 × 107 細胞/mL</td>
			<td>75,000</td>
			<td>10</td>
			<td>75 uL</td>
			<td>150 μL</td>
		</tr><tr><td>1.13 × 107 細胞/mL</td>
			<td>75,000</td>
			<td>5</td>
			<td>40 uL</td>
			<td>80 μL</td>
		</tr></tbody></table>表1:ECMドームのめっき用希釈。 略語:ECM =細胞外マトリックス。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>化合物</td>
			<td>在庫集中</td>
			<td>希釈</td>
			<td>作業濃度</td>
			<td>溶媒</td>
			<td>井戸濃度</td>
			<td>コメント</td>
		</tr><tr><td>サイトトックスグリーン</td>
			<td>1 ミリメートル (DMSO)</td>
			<td>1/10</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>ティッカー</td>
			<td>60ナノメートル</td>
			<td>細胞死マーカー</td>
		</tr><tr><td>サイトトックスレッド</td>
			<td>1 ミリメートル (DMSO)</td>
			<td>1/10</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>ティッカー</td>
			<td>250 nM</td>
			<td>細胞死マーカー</td>
		</tr><tr><td>カスパーゼ3/7グリーン</td>
			<td>5 mM (DMSO)</td>
			<td>1/2</td>
			<td>2.5 ミリリットル</td>
			<td>ティッカー</td>
			<td>2.5 μM</td>
			<td>アポトーシスマーカー</td>
		</tr><tr><td>ヘキスト</td>
			<td>20 mM (H2O)</td>
			<td>1/200</td>
			<td>100マイクロM</td>
			<td>0.33% トゥイーン/PBS</td>
			<td>50ナノメートル</td>
			<td>核マーカー</td>
		</tr><tr><td>スタウロスポリン</td>
			<td>10 mM (DMSO)</td>
			<td>/</td>
			<td>1 - 10 mM</td>
			<td>/</td>
			<td>2 – 5 μM</td>
			<td>ポジティブコントロール</td>
		</tr><tr><td>ゲムシタビン</td>
			<td>10 mM (DMSO)</td>
			<td>/</td>
			<td>1 - 10 mM</td>
			<td>/</td>
			<td>滴 定</td>
			<td>化学療法</td>
		</tr><tr><td>パクリタキセル</td>
			<td>10 mM (DMSO)</td>
			<td>/</td>
			<td>1 - 10 mM</td>
			<td>/</td>
			<td>滴 定</td>
			<td>化学療法</td>
		</tr><tr><td>シスプラチン</td>
			<td>5 mM (0.9% NaCl)</td>
			<td>1/2</td>
			<td>2.5 ミリリットル</td>
			<td>0.6% トゥイーン/PBS</td>
			<td>滴 定</td>
			<td>化学療法</td>
		</tr></tbody></table>表2:よく使われる薬剤や蛍光試薬の希釈例。 各化合物は、100%DMSOまたは0.3%トゥイーン/PBSのいずれかに溶解する必要があります。
補足表S1:適合がん細胞株の概要。 静的:回転楕円体は渡り鳥ではありません。マージ:回転楕円体は互いに向かって移動し、一緒にマージします。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434_SuppTableS1%20(1).xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:オルガノイド播種溶液計算ツール。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%201.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル2:カスタムラボウェア「マイクロプレートホルダー」を3DプリントするためのSTLファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%202.stl" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル3:カスタムラボウェア「2 x 25 mLリザーバーホルダー」を3DプリントするためのSTLファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%203.stl" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル4:カスタムラボウェアピペッティングロボット「マイクロプレートホルダー」のJSONファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%204.json" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル5:カスタムラボウェアピペッティングロボット「2 x 25 mLリザーバー Holder_WithCooler」のJSONファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%205.json" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル6:ピペッティングロボットプロトコル「Plating_ PDO_384well_Cooled_Row2-23」用のJSONファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%206.json" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル7:ピペッティングロボットデスクのセットアップの概要。 (A)冷却エレメント、(B)リザーバーおよびマイクロプレート。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%207.png" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル8:デジタル医薬品ディスペンサーのプロトコル用のTDDファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%208.tdd" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル9:明視野および蛍光イメージング用の生細胞イメージャーのプロトコル用のXMLファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%209.xml" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル10:プレートマップの例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2010.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル 11: NDR R スクリプトの入力ファイルの例 略語:NDR =正規化された薬物反応。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2011.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル 12: 正規化された薬物反応 NDR R スクリプト。 略語:NDR =正規化された薬物反応。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2012.R" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル 13: NDR R スクリプトの GR 値の出力ファイルの例。 略語:GR =成長率。NDR =正規化された薬物反応。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2013.csv" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル 14: GR 値が転置された NDR R スクリプトの出力ファイルの例。 略語:GR =成長率。NDR =正規化された薬物反応。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2014.csv" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
Sアッププレメンタリ ファイル 15: NDR R スクリプトの NDR 値の出力ファイルの例。 略語:NDR =正規化された薬物反応。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2015.csv" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル 16: NDR 値が転置された NDR R スクリプトの出力ファイルの例。 略語:NDR =正規化された薬物反応。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2016.csv" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

このプロトコルは、中処理から高スループットのオルガノイド薬物スクリーニングのための半自動化された方法と、顕微鏡に依存しない自動画像分析ソフトウェアを説明し、マルチパラメトリックの単一オルガノイド薬物反応を定量化および視覚化して、腫瘍内の不均一性をキャプチャします。

バルクおよび単一オルガノイド分析のための広視野生細胞イメージングを用いたマルチパラメトリック腫瘍オルガノイド薬物スクリーニング(英語)

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

このプロトコルにより、研究者は分析パイプラインを合理化できるだけでなく、オルガノイドストリームからより多くの情報を抽出できるため、翻訳の関連性が向上します。このプロトコルの主な利点は、合理化されたワークフローと自動化された臨床的に関連する分析パイプラインを組み合わせることで、研究者が1つのオルガノイドスクリーニングから説得力のある量の情報を取得できることです。この手法は、これらのex vivoオルガノイド薬物スクリーニングから癌患者の臨床治療反応を予測するために使用でき、非常に有望な初期結果が得られます。目的は、ソフトウェアソリューションプラットフォームにとらわれないようにして、研究者が利用可能な生細胞イメージング機器を使用できるようにすることです。まず、6ウェルマイクロプレートの細胞外マトリックス(ECM)ドーム内の患者由来の腫瘍オルガノイド(PDTO)を酵素的に解離させます。このためには、最初に培地を吸引し、ECMドームをPBSで一度洗浄します。次に、ウェルに2ミリリットルの解離酵素を加えます。1ミリリットルのピペットを使用して内容物を10回上下にピペットし、ドーム内のオルガノイドを機械的に解離してから、プレートを摂氏37度で10分間インキュベートします。インキュベーション後、内容物を上下にピペットで固定し、顕微鏡を使用してオルガノイドが単一細胞に適切に解離しているかどうかを確認します。細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに集め、ADF+遠心チューブを室温で450gで5分間添加して10ミリリットルまで容量を作り、パスツールピペットと吸引ポンプを使用して上清を吸引します。ペレットのサイズに応じて、ペレットを100〜200マイクロリットルの全膵管腺癌(PDAC)のオルガノイド培養培地に再懸濁してから、選択した方法を使用して細胞数をカウントします。単一細胞をECMドームに播種するには、融解したECMを必要量加えて、適量の細胞懸濁液を希釈します。次に、摂氏37度に予熱した6ウェルプレートに、ウェルあたり最大10個の20マイクロリットルの液滴をピペットで入れます。プレートを裏返し、摂氏37度で30分間インキュベートします。次に、10マイクロモルのY-27632を添加したフル培地でウェルをオーバーレイし、インキュベーター内で2〜3日間インキュベートします。2〜3日齢のオルガノイドを回収するには、まず培地を吸引し、PBSでオルガノイドを1回洗浄します。次に、ECMドームの数に応じて、摂氏4度に予冷した1〜2ミリリットルのオルガノイド採取溶液を6ウェルプレートのウェルに加えます。氷上に保ったプレートを、振とう台上で10分間インキュベートします。次に、ウェル内の内容物を1ミリリットルのピペットで上下にピペッティングして、ECMドームを解離します。もう一度、オルガノイドを氷上で10分間インキュベートしてから、顕微鏡でECMドームの解離を視覚的に確認します。0.1%BSAをPBSでプレコートした15ミリリットルのチューブにオルガノイドを回収し、ADF+遠心分離機を加えてチューブを200gで摂氏4度で5分間、10ミリリットルに増やします。次に、上清を吸引し、そのサイズに応じてペレットを最大1ミリリットルのフルPDACオルガノイド培地に所望の最終オルガノイド濃度まで再懸濁する。ピペッティングロボット制御アプリケーションを開き、[プロトコル]を選択し、[インポート]をクリックしてから、提供された補足ファイル6を指定されたフィールドにドラッグアンドドロップします。インポートしたプロトコルを選択します。また、[デッキのセットアップ]フィールドに示されているレイアウトに従って、冷却要素やプラスチック製品を含むすべての実験器具をデッキに配置します。左側のスロットは、25ミリリットルのリザーバーと冷却要素に使用します。次に、[プロトコルの実行]をクリックしてセットアップに進みます。[ラボウェアのセットアップ]タブを開き、[ラボウェアの位置チェックを実行]をクリックして、指示に従ってピペッティングロボットを新しいハードウェアに合わせて校正します。冷却エレメントの上に置かれた25ミリリットルのリザーバーに冷却されたオルガノイド播種溶液を入れ、Start Run をクリックしてピペッティングロボットを作動させます。次に、マイクロプレートを100gの速度で摂氏4度で1分間遠心分離する。デジタル薬剤ディスペンサー制御ソフトウェアを使用して薬剤調剤プロトコルを作成するには、プレートレイアウトの上にあるプレート1にカーソルを合わせます。[プレート属性の編集]を選択し、[流体]の横にある追加ボタンをクリックして、プレートタイプを384ウェル、追加容量を50マイクロリットル、DMSO制限を1%[流体の追加]に入力します。次に、DMSOベースまたは水性プラストゥイーン20としてクラスを選択し、濃度を入力します。薬物滴定のプレートレイアウトを作成するには、[ウェル]を選択し、[滴定]をクリックします。液体の場合は、目的の薬物を、希望する最高濃度と最低濃度とともに選択します。反復の場合は、最低2つを選択し、目的の滴定パターンを選択します。ポジティブコントロールのプレートレイアウトを作成するには、3つのウェルを選択し、[値の設定]をクリックして、DMSOの10ミリモルストックから2マイクロモルのスタウロスポリンを充填して、最大の細胞死を誘導します。Cytotox Greenの場合は、使用済みのウェルをすべて選択し、値の設定をクリックして、ウェルあたり60ナノモルの値を入力します。ネガティブコントロールとDMSO正規化では、車両コントロール用にさらに4つのウェルを含むすべてのウェルを選択します。次に、正規化された流体クラスをDMSOベースとして割り当てる前に、右クリックして[正規化]を選択します。次いで、最高クラスの体積に正規化して、各ウェルにおいて等しいDMSO濃度を得る。次に、左上隅の[実行]の下の矢印をクリックし、[常にシミュレート]を選択してから、[シミュレート]をクリックしてエラーを特定し、準備する各薬剤の量を取得します。次に、[実行]ボタンの下の[常にシミュレート]のチェックを外してから、[実行]をクリックして薬剤調剤プロトコルを開始し、指示に従います。シーリングメンブレンをマイクロプレートに適用して、蒸発を防ぎます。ライブセルイメージャー制御ソフトウェアを開き、メソッドエディターの新規を選択してから、ファイルに移動してサンプルメソッドXMLファイルをインポートします。または、原稿の指示に従って新しいファイルを作成します。次に、[開始]をクリックしてスキャンを開始し T0.To データをマージおよび圧縮し、生細胞イメージャー制御ソフトウェアによって各時点で各スキャン用に生成されたすべての個別の実験フォルダーを転送するための新しい親フォルダーを作成し、原稿の指示に従ってそれぞれのフォルダーに名前を付けます。デジタル薬剤ディスペンサー制御ソフトウェアでXLSXプレートマップを準備するには、薬剤調剤プロトコルからプレートマップレイアウトを右クリックし、すべてのウェルをコピーしてXLSXファイルにデータを貼り付けます。Cytotox Greenとスタウロスポリンのデータを削除し、細胞株のマトリックスを追加して、ネガティブコントロールとポジティブコントロールを入力します。データ圧縮ツールを開きます。[検索]をクリックし、親フォルダを選択し、[圧縮]をクリックして画像データの圧縮を開始します。すべてのTIFF画像ファイルは、親フォルダー内の新しいデータセットフォルダー内のウェルごとに1つのHDF5に圧縮されます。画像を解析するには、画像解析 Web アプリ プラットフォームに移動してログインし、[ホーム] タブの [新しいプロジェクトの追加] をクリックします。プロジェクト名を入力し、[続行] を押して [新しい実験の追加] を選択してから、HDF5 ファイルを含むデータセット フォルダーをアップロードします。アップロード後、プロジェクトと実験のフォルダーに移動し、[プレートマップのアップロード]をクリックして追加機能を確認します。次に、[分析の実行]を順番にクリックし、[マルチオルガノイド分析]、[デフォルトパラメーター]、[最後に分析]を選択して画像分析を開始します。[結果のダウンロード]をクリックして、各ウェルの測定値とセグメント化された画像またはビデオを含む生データテーブルをダウンロードしてから、さらなるデータ処理のために分析の精度を確認します。オルガノイド播種密度とサイズの変動を説明するために、増殖速度ベースの測定基準を使用して、エラーバーの減少によって示されるように、反復間の変動を減らしました。ネガティブコントロール、ポジティブコントロール、およびゲムシタビンとパクリタキセルで治療されたPDTOの組み合わせの画像は、治療が主に限られた量の細胞死で成長停止を誘発し、正規化された薬物反応(NDR)値に対応することを示しました。PDAC_052とPDAC_087の2つの追加ラインを使用すると、3つのライン間で成長率に明確な違いが観察され、GRメトリックの使用がサポートされました。NDR線量反応曲線は、GR曲線と比較して、3つの異なる患者間のダイナミックレンジと分離の増加をもたらしました。経時的なNDRの決定は、PDAC_052とPDAC_060が低用量のゲムシタビン-パクリタキセルに対して非常に類似した細胞増殖抑制薬物反応を示したが、対応する中用量および高用量で明確な細胞増殖抑制反応と細胞傷害反応の差が観察されることを示した。これらの薬物反応は、患者で観察された臨床反応と一致していました。.クローン動態は、PDAC_087が治療後に最も耐性のあるサブクローンを有することを明らかにしたが、これは患者において観察された疾患の攻撃的な性質と一致しており、興味深いことに、陽性対照スタウロスポリンに対して最も感受性が低い。プロトコルの最も重要な側面は、ECMの誤った固化が下流の画像分析を妨げる可能性があるため、シード中にECMを含むすべての溶液を冷却し続けることです。ウェットラボ作業、画像分析、およびダウンストリームデータ処理の自動化は、研究を加速し、新しい併用療法をより簡単に特定するのに役立ちます。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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