Name: multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis
Uploaded: 2022-12-23T13:50:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis at JoVE.com

이 연구의 일부는 Dedert Schilde vzw와 Willy Floren을 포함한 여러 기부자의 기부금으로 자금을 지원받았습니다. 이 연구는 플랑드르 연구 재단, 12S9221N (A.L.), G044420N (S.V., A.L., E.G), 1S27021N (M.L) 및 앤트워프 대학의 산업 연구 기금, PS ID 45151 (S.V., A.L., C.D.)에서 부분적으로 자금을 지원합니다. 그림 1 은 BioRender.com 로 작성되었습니다.

인간 췌장 관 선암 (PDAC) 환자 유래 오가노이드를 사용하였다. 조직 절제 단편은 앤트워프 대학 병원에서 치료 수술을받는 환자로부터 얻었습니다. 모든 환자로부터 서면 사전 동의를 얻었으며 연구는 UZA 윤리위원회의 승인을 받았습니다(참조 14/47/480). 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약, 장비 및 소프트웨어와 관련된 세부 정보는 재료 표에 나와 있습니다. 워크플로의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 예제 데이터는 프로토콜을 재현하기 위해 보충 자료에 제공됩니다.
1. 0일차: 생후 2일 또는 3일령 오가노이드의 제조
<ol><li>마이크로플레이트를 37°C에서 밤새 예열하고 4°C에서 세포외 매트릭스(ECM)를 해동합니다.</li>
	<li>전체 PDAC 오가노이드 배양 배지 준비: 0.5nM WNT 대리모-Fc-융합 단백질, 4% Noggin-Fc 융합 단백질 조절 배지, 4% Rpso3-Fc 융합 단백질 조절 배지, 1x B27, 1mM N-아세틸 시스테인(NAC), 5mM 니코틴아미드, 500nM A83-01, 100ng/mL FGF10 및 10nM 가스트린으로 ADF+++(고급 DMEM/F12, 1% 글루타민 보충제, 1% HEPES 및 1% 페니실린/스트렙토마이신)를 보충합니다.</li>
	<li>선택 방법에 따라 PDTO를 설정합니다. 참고 : 자세한 프로토콜은 Driehuis et al.에 의해 제공되며, ECM 돔4에서 PDTO를 설정, 배양 및 통과시키는 종래의 방법을 설명합니다.</li>
	<li>ECM 돔에서 유기체를 효소적으로 해리합니다.<ol><li>배지를 흡인하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 1x 세척합니다. 해리 효소(예: 6웰 마이크로플레이트에 2mL)를 추가하고 1mL 피펫으로 10배 위아래로 피펫하여 오가노이드와 ECM 돔을 기계적으로 해리합니다.</li>
		<li>37°C에서 10분 동안 배양하고, 위아래로 피펫팅하고, 오가노이드가 단세포로 해리되는지 확인한다. 필요한 경우 이 단계를 반복합니다.</li>
		<li>15mL 튜브에 세포 현탁액을 수집하고 ADF+++를 10mL의 부피에 추가하고 실온에서 450× g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 파스퇴르 피펫과 흡입 펌프로 상청액을 흡입합니다.</li>
		<li>펠릿의 크기에 따라 100-200 μL의 전체 배지에 펠릿을 재현탁하고 선택한 방법을 사용하여 세포 수를 계산합니다. 예: 세포 현탁액 10μL + 트리판 블루 10μL를 혼합하고 자동 세포 카운터로 계수합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>ECM 돔에 단일 셀을 플레이트합니다.<ol><li>세포 현탁액을 희석하고 표 1에 따라 2/3 ECM을 첨가한다. 예열된 6웰 플레이트에서 웰당 최대 10개의 20μL 액적을 피펫팅합니다. 플레이트를 뒤집고 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>10 μM Y-27632가 보충 된 전체 배지로 오버레이하고 인큐베이터에서 2-3 일 동안 배양합니다. 참고: 각각 75,000개의 세포를 포함하는 10개의 돔은 일반적으로 가장자리의 웰을 제외하고 200개의 오가노이드/웰 농도로 384웰 마이크로플레이트 1개를 채우기에 충분합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 2-3일: 2일 또는 3일령 오가노이드 수확 및 파종
<ol><li>ECM 돔에서 손상되지 않은 유기체를 수집하십시오. 참고: 오가노이드는 플라스틱 표면(예: 튜브, 피펫 팁)에 달라붙는 경향이 있습니다. 이를 방지하기 위해 플라스틱 제품은 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA) / PBS 용액으로 미리 헹굴 수 있습니다.<ol><li>배지를 흡인하고 PBS로 1x 세척합니다. ECM 돔 수에 따라 6웰 플레이트에 1-2mL의 냉(4°C) 오가노이드 수확 용액을 추가하고 진탕 플랫폼의 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.</li>
		<li>1mL 피펫으로 위아래로 피펫하여 ECM 돔을 해리하고 얼음 위에서 10분 더 배양한 다음 ECM이 해리되었는지 현미경으로 육안으로 확인합니다.</li>
		<li>선택 사항: 보다 균일한 크기 분포가 선호되는 경우 원심분리 전에 70μm 세포 스트레이너를 통해 현탁액을 여과합니다.</li>
		<li>0.1% BSA/PBS로 사전 코팅된 15mL 튜브에 오가노이드를 수집하고 최대 10mL까지 ADF+++를 추가하고 4°C에서 200× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 펠릿의 크기에 따라 최대 1,000μL의 전체 PDAC 오가노이드 배지에 펠릿을 재현탁하여 >6,000 오가노이드/mL의 농도를 얻습니다.</li>
		<li>선택한 계수 방법, 바람직하게는 이미지 기반 방법을 사용하여 오가노이드를 계수하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>유기체를 시드하십시오. 참고: 이 프로토콜에 사용되는 두 가지 유형의 384웰 마이크로플레이트에 대한 최소 부피/웰에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.<ol><li>ECM의 응고를 방지하기 위해 사용하기 전에 모든 플라스틱 제품을 -20 ° C 또는 얼음에서 최소 20 분 동안 사전 냉각하십시오.</li>
		<li>전체 배지를 사용하여 1mL의 오가노이드 원액(단계 2.1.6)에서 파종 용액을 준비하여 웰을 채우는 데 사용되는 최소 부피인 50μL의 웰당 ~200개의 오가노이드를 시드합니다. 보충 파일 1 을 사용하여 오가노이드 파종 용액의 양을 계산합니다. 25mL 저장소와 멀티채널 피펫 또는 피펫팅 로봇을 사용할 경우 1,500μL의 잔류 부피를 추가하십시오.</li>
		<li>피펫팅 로봇을 사용하여 오가노이드를 시드합니다. 참고: ECM의 응고를 방지하기 위해 피펫팅 중에 파종 용액과 마이크로플레이트 모두 4°C에서 냉각해야 합니다. 따라서 25mL 저장소와 마이크로플레이트 홀더를 3D 프린팅하여 재료 표에 나열된 냉각 요소를 담을 수 있는 피펫팅 로봇과 함께 사용했습니다. 맞춤형 실험기구(보충 파일 2 및 보충 파일 3)를 3D 프린팅하기 위한 STL 파일과 피펫팅 로봇을 위한 맞춤형 실험기구 JSON 파일(보충 파일 4 및 보충 파일 5)이 제공됩니다.<ol><li>온라인 프로토콜 디자이너 도구를 사용하여 분배 프로토콜을 설계합니다. 예제 JSON 파일(보충 파일 6)이 제공되며, 여기에는 맞춤형 실험기구가 이미 로드되어 있고 해당 파이펫 팁이 있는 8채널 p300(Gen2) 피펫이 사용됩니다.</li>
			<li>피펫팅 로봇 제어 앱을 열고 프로토콜을 선택한 다음 가져오기를 클릭하고 보조 파일 6 을 지정된 필드로 끌어다 놓습니다.</li>
			<li>가져온 프로토콜을 선택하고 냉각 요소와 플라스틱 제품을 포함한 모든 실험기구를 데크 설정 필드에 표시된 레이아웃에 따라 데크 에 배치합니다. 보충 파일 7에 표시된 대로 25mL 저장소 및 냉각 요소에 왼쪽 슬롯을 사용합니다.</li>
			<li>프로토콜 실행을 클릭하고 설정을 진행합니다. 실험기구 설정 탭을 열고 실험기구 위치 확인 실행을 클릭한 다음 지침에 따라 피펫팅 로봇을 새 하드웨어에 맞게 교정합니다. 참고: 실험기구 오프셋 데이터는 나중을 위해 저장할 수 있지만 각 실행 전에 실험기구 위치 검사를 실행하는 것이 좋습니다.</li>
			<li>25mL 저장소(냉각 요소 상단에 위치)를 냉각된 오가노이드 파종 용액으로 채우고 실행 시작을 클릭합니다. 참고: 상단 및 하단 웰도 8채널 피펫의 사용으로 인해 오가노이드 현탁액으로 채워집니다.</li>
			<li>마이크로플레이트를 4°C에서 100 × g에서 1 분 동안 원심분리한다.</li>
			<li>37°C에서 최소 30분 동안 배양합니다.</li>
			<li>증발을 피하기 위해 외부 블랭크 웰을 최소 50μL의H2O로 채웁니다.</li>
			<li>37°C에서 밤새 배양하여 이미지 분석을 방해할 수 있는 웰 내의 모든 기포를 제거한다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. 4일차: 디지털 약물 디스펜서를 사용한 약물 치료 및 시약 분주
<ol><li>디지털 약물 디스펜서 제어 소프트웨어를 사용하여 약물 디스펜싱 프로토콜을 생성합니다.<ol><li>플레이트 레이아웃 위의 플레이트 1 위에 마우스를 놓고 플레이트 속성 편집을 선택하고 플레이트 유형: 384웰, 추가 볼륨(μL): 50 및 DMSO 제한(%): 1을 채웁니다.</li>
		<li>유체 옆에 있는 + 버튼을 클릭하여 유체 를 추가합니다. 새로 생성 된 유체를 두 번 클릭하고 이름을 지정하십시오. 클래스 (DMSO 기반 또는 수성 + 트윈 20) 및 농도를 선택하십시오. 알림: 모든 약물과 시약은 100% DMSO 또는 0.3% 트윈-20에 용해되어야 합니다. 최대 DMSO 농도 <1 %를 고려하여 1-10mM 스톡 용액을 사용할 수 있습니다. 표 2 는 일반적인 형광 시약 및 치료법에 필요한 희석액의 예를 제공합니다.</li>
		<li>플레이트 레이아웃<ol><li>약물 적정의 경우, 웰을 선택하고 적정을 클릭하십시오. 유체의 경우, 관심 약물을 선택하고, 최고 농도 (예를 들어, 2,000 nM) 및 최저 농도 (예를 들어, 10 nM)를 선택하고; 반복실험의 경우 최소 2개를 선택하고 원하는 적정 패턴을 선택합니다. 참고: 적정 패턴은 단일 플레이트에 얼마나 많은 화합물을 맞출 것인지, 웰을 무작위화할지 여부, 반복실험 및 대조군의 수를 포함한 많은 요인에 따라 달라집니다.</li>
			<li>양성 대조군의 경우 3개의 웰을 선택하고 Set Value를 클릭한 다음 DMSO의 10mM 스톡에서 2μM 스타우로스포린을 채우면 최대 세포 사멸을 유도합니다.</li>
			<li>사이토톡스 그린의 경우 사용된 모든 웰을 선택하고 설정 값을 클릭한 다음 60nM/웰을 입력합니다. 참고: Cytotox Green 형광 염색은 죽은 세포를 나타내므로 약물 반응 모니터링을 방해하지 않습니다. 여기에서는 살아있는 세포에 대한 형광 마커가 필요하지 않습니다.</li>
			<li>음성 대조군 및 DMSO 정규화의 경우, 비히클 제어를 위해 추가로 4개의 웰이 있는 모든 웰을 선택하고, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고, 정규화를 선택하고, 유체 클래스 정규화: DMSO 기반을 선택하고, 최고 클래스 부피로 정규화하여 각 웰에서 동일한 DMSO 농도를 얻습니다. 알림: DMSO 농도는 <1%여야 합니다. 예시적인 TDD 약물 적정 파일(보충 파일 8)이 제공된다.</li>
			<li>왼쪽 상단 모서리에 있는 실행 아래의 화살표를 클릭하고 항상 시뮬레이션을 선택한 다음 시뮬레이션을 클릭하여 오류를 식별하고 준비할 각 약물의 양을 얻습니다. 알림: 초기 분주 용량이 너무 낮을 때 경고를 극복하려면 "각 플레이트의 각 유체에 대해 30nL 이상의 분주 경고 웰 권장", 가장자리에서 물이 채워진 두 개의 웰을 선택하고 값 설정을 선택한 다음 경고가 발생하는 약물의 10μM 을 입력합니다. 이것은 약물 카트리지를 30nL보다 높은 부피로 프라이밍합니다. 이러한 동일한 웰을 사용하여 정규화를 총 부피 값의 %( 예: 0.5%)로 설정하여 DMSO 카트리지를 프라이밍할 수 있습니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>선택 취소 항상 시뮬레이션 아래의 실행 단추; 실행을 클릭하여 약물 분배 프로토콜을 시작하고 지침을 따릅니다.</li>
	<li>증발을 방지하기 위해 밀봉 멤브레인을 마이크로 플레이트에 적용하십시오.</li>
	<li>Cytotox Green 염료를 인큐베이터에서 37°C에서 1-2시간 동안 배양하고 4단계로 진행합니다.</li>
</ol>4. 라이브 셀 이미저로 이미지 수집
알림: 성장률 및 NDR의 경우 Cytotox Green을 추가한 후 1-2시간 후에 시점 0(T0 = 치료 시작)에서 스캔을 받아야 합니다.
<ol><li>라이브 셀 이미저 제어 소프트웨어를 열고 메서드 편집기 새로 만들기를 선택한 다음 가져올 파일로 이동하여 예제 메서드 XML 파일(보조 파일 9)> 선택합니다. 또는 새 파일을 만들고 플레이트: (CORE384fb_OpticalImaging) - Corning 384 플랫 블랙(Corning #4588), 뚜껑 없음 및 습도 카세트 없음; 응용 프로그램: 이미지 전용; 목표: 4x; 패턴 : 중앙; 채널 확인 명시야 및 녹색(LED 강도(%) = 40; 노출 시간 (ms) = 200). 알림: 녹색 채널 설정은 60nM 사이토톡스 그린 농도에서 잘 작동합니다. 라이브 뷰어 옵션을 사용하여 초점 오프셋 및/또는 LED 설정을 실시간으로 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>시작을 클릭하여 T0에서 스캔을 시작합니다.</li>
	<li>동일한 방법을 사용하여 최대 5일 동안 24시간마다 스캔을 반복합니다. 또는 타임랩스 측정을 자동으로 실행하려면 라이브 셀 이미저 제어 소프트웨어에서 키네틱 루프 탭을 클릭하고 메서드 필드로 드래그하여 키네틱 실험으로 방법을 조정합니다. 마찬가지로, 온도 및 가스 탭을 방법 필드로 드래그하여 시스템을 37 ° C 및 5 % CO2로 설정하여 실험 중에 라이브 셀 이미 저 내에서 올바른 조건을 보장해야합니다.</li>
</ol>5. 이미지 및 데이터 분석
<ol><li>데이터 병합 및 압축<ol><li>라이브 셀 이미저 제어 소프트웨어는 각 시점에서 각 스캔에 대한 폴더를 생성합니다. 새 폴더를 만들고 개별 실험 폴더를 이 새 상위 폴더에 복사한 다음 _0h, _24h, _48h, _72h, _96h 및 _120h 해당 실험 폴더 이름에 추가합니다.</li>
		<li>디지털 약물 디스펜서 제어 소프트웨어에서 XLSX 플레이트 맵을 준비하고 약물 디스펜싱 프로토콜에서 플레이트 맵 레이아웃을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 모든 웰을 복사합니다. XLSX 파일에 데이터를 붙여넣습니다. Cytotox Green 및 스타우로스포린 데이터를 제거하고 세포주 및 복제를 위한 매트릭스를 추가합니다. Ctrl- 및 Ctrl+를 입력합니다. 예제 플레이트 맵에 대해서는 보충 파일 10 을 참조하십시오.</li>
		<li>데이터 압축 도구를 열고 찾아보기를 클릭하고 상위 폴더를 선택한 다음 실행을 클릭하여 이미지 데이터 압축을 시작합니다. 서로 다른 타임 포인트에 대한 모든 TIFF 이미지 파일은 상위 폴더 내의 새 데이터 세트 폴더에있는 각 웰에 대해 단일 HDF5로 압축됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>이미지 분석<ol><li>이미지 분석 웹앱 플랫폼으로 이동하여 로그인하고 홈 탭에서 새 프로젝트 추가를 클릭합니다. 프로젝트 이름을 입력하고, 계속하고, 새 실험 추가를 선택하고, HDF5 파일이 포함된 데이터 세트 폴더를 업로드합니다.</li>
		<li>업로드 후 프로젝트 및 실험 폴더로 이동하여 플레이트맵 업로드 를 클릭하여 추가 기능을 확인합니다. 분석 실행을 클릭하고 다중 오가노이드 분석, 기본 파라미터를 선택한 다음 분석을 클릭하여 이미지 분석을 시작합니다.</li>
		<li>Download Results(결과 다운로드)를 클릭하여 각 웰에 대한 측정값(예: 총 명시야 영역, 총 형광 녹색 영역 등)이 포함된 원시 데이터 테이블과 분할된 이미지/비디오를 다운로드하여 분석 및 추가 데이터 처리의 정확성을 확인합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>성장률 기반 약물 반응 지표 및 정상화된 약물 반응<ol><li>결과 폴더(플레이트 맵 필요)(보조 파일 11)에서 Raw_NDR.xlsx 파일을 선택하고 Official_NDR_7point R-스크립트(보조 파일 12)에 로드하여 GR(ctrl-로 정규화됨) 및 NDR(ctrl- 및 ctrl+로 정규화됨) 값 테이블(보조 파일 13, 보조 파일 14, 보조 파일 15 및 보조 파일 16)을 자동으로 생성합니다. ). GR 및 NDR 값은 R-스크립트(보충 파일 12)를 사용하여 방정식 (1)과 같이 매개 변수에서 계산됩니다. 총 생존 면적 = 총 명시야 면적 - 총 녹지 면적 (1) 여기서 0은 NDR <1 = 세포 증식 억제 효과 (성장 정지), 및 NDR < 0 = 세포 독성 반응 (세포 사멸)을 <. 참고 : R- 스크립트는 Gupta et al.6에서 채택되었습니다.</li>
		<li>clonal_data.xlsx 표에서 단일 오가노이드 반응 데이터를 가져와 버블 플롯으로 플로팅합니다.</li>
		<li>Z-인자10 을 사용하여 실행의 약물 스크리닝 품질을 평가합니다(방정식 (2) 참조). Z 계수가 0.5< 실험은 폐기합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64434/64434eq01.jpg" style="margin: auto;">(2)</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Veninga, V., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+organoids:+Opportunities+and+challenges+to+guide+precision+medicine.">Tumor organoids: Opportunities and challenges to guide precision medicine.</a> Cancer Cell. 39 (9), 1190-1201 (2021).</li><li>Le Compte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+as+individual+patient+models+for+chemoradiation+response+prediction+in+gastrointestinal+malignancies.">Patient-derived organoids as individual patient models for chemoradiation response prediction in gastrointestinal malignancies.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 157, 103190 (2021).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li><li>Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+inhibition+metrics+correct+for+confounders+in+measuring+sensitivity+to+cancer+drugs.">Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs.</a> Nature Methods. 13 (6), 521-527 (2016).</li><li>Gupta, A., Gautam, P., Wennerberg, K., Aittokallio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+normalized+drug+response+metric+improves+accuracy+and+consistency+of+anticancer+drug+sensitivity+quantification+in+cell-based+screening.">A normalized drug response metric improves accuracy and consistency of anticancer drug sensitivity quantification in cell-based screening.</a> Communications Biology. 3 (1), 42 (2020).</li><li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+organoids:+a+bright+future+ahead.">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li><li>Deben, C., Cardenas, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrBITS:+label-free+and+time-lapse+monitoring+of+patient+derived+organoids+for+advanced+drug+screening.">OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening.</a> Cellular Oncology. , (2022).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> Bioessays. 39 (8), (2017).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Engel, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+colorectal+cancer+organoids+upregulate+revival+stem+cell+marker+genes+following+chemotherapeutic+treatment.">Patient-derived colorectal cancer organoids upregulate revival stem cell marker genes following chemotherapeutic treatment.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (1), 128 (2020).</li><li>Hennig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+drug+resistance+in+pancreatic+cancer+organoids+guides+optimized+chemotherapy+treatment.">Detecting drug resistance in pancreatic cancer organoids guides optimized chemotherapy treatment.</a> The Journal of Pathology. 257 (5), 607-619 (2022).</li><li>D'Alterio, C., Scala, S., Sozzi, G., Roz, L., Bertolini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+effects+of+chemotherapy+on+tumor+relapse+and+metastasis+promotion.">Paradoxical effects of chemotherapy on tumor relapse and metastasis promotion.</a> Seminars in Cancer Biology. 60, 351-361 (2020).</li><li>Njoroge, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+model+distinct+Vitamin+E+effects+at+different+stages+of+prostate+cancer+evolution.">Organoids model distinct Vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).</li><li>Godet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate-mapping+post-hypoxic+tumor+cells+reveals+a+ROS-resistant+phenotype+that+promotes+metastasis.">Fate-mapping post-hypoxic tumor cells reveals a ROS-resistant phenotype that promotes metastasis.</a> Nature Communications. 10 (1), 4862 (2019).</li><li>Letai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+precision+cancer+medicine-moving+beyond+pure+genomics.">Functional precision cancer medicine-moving beyond pure genomics.</a> Nature Medicine. 23 (9), 1028-1035 (2017).</li></ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

중간 처리량에서 높은 처리량의 PDTO 약물 스크리닝은 종종 오가노이드가 잠재적으로 제공할 수 있는 정보의 일부만 추출하는 판독값에 의존합니다. 빠르게 진화하는 오가노이드 기술이 더 큰 과학적 및 임상적 잠재력을 실현하기 위해서는 보다 발전된 3D 분석, 판독 및 분석 방법이 매우 필요하다는 것이 점점 더 분명해지고 있습니다. 여기에서는 재현성을 높일 뿐만 아니라 AI 기반 라이브 셀 이미징 판독을 통합하여 임상 번역성을 크게 향상시키는 고급 스크리닝 파이프라인에 대해 설명합니다. 자체 개발한 분석 소프트웨어 외에도 정규화된 약물 반응 메트릭(NDR)의 사용이 구현되어 치료 반응에서 환자별 차이를 정의하는 능력을 명확하게 보여줍니다6. 
이 정규화 지표의 포함은 의심할 여지 없이 엄청난 가치가 있을 것이며, 수많은 연구가 곡선 아래 면적(AUC) 또는 절반 최대 억제 농도(IC50)의 사소한 차이를 기반으로 치료 반응을 설명하는 것을 목표로 한다는 점을 상기합니다(대부분의 용량-반응 곡선이 서로 겹치거나 가깝게 위치하기 때문에)11,12 . 성장률 메트릭은 ATP 기반 분석을 사용하는 오가노이드 약물 스크리닝 프로토콜에서 이미 구현되었지만 시점 0에서 용해된 기준 웰의 정규화에 의존합니다4. 대조적으로, 이 방법은 PDTO 성장률의 환자 간 차이뿐만 아니라 재현성을 높이기 위해 파종 밀도 및 플레이트 위치 의존적 효과의 변화로 인한 웰 간 차이를 설명하는 웰 내 성장률 정규화를 허용합니다. 또한, 정상화 6,8을 위한 양성 대조군을 포함함으로써 환자 간 PDTO 반응의 분리를 더욱 증가시키기 위해 NDR을 조정하였다.
또한 고처리량 및 자동화 형식과 호환되는 이 분석은 개별 오가노이드 반응을 정확하게 검출할 수 있어 종양 재발 및 진행의 주요 원동력인 클론 내 내성의 정량화를 가능하게 합니다13. 예를 들어, PDAC052 및 PDAC060이 시험 관내 치료에 대해 양호한 반응을 보였으나(NDR 기준), 추가의 단일-오가노이드 분석은 치료에 반응하지 않는 서브클론의 작은(PDAC060을 갖는 더 큰 집단) 집단을 검출할 수 있었다. 흥미롭게도, 이것은 PDAC052 및 PDAC060이 지속적인 반응 (종양 활성이 검출되지 않음)을 가졌지 만 결국 둘 다 국소 종양 진행으로 진단 된 것을 감안할 때 임상 관찰과 매우 일치했다 (내성 클론의 존재로 인해). 기존의 3D 판독(ATP 기반 분석 및 크기/숫자)과 비교하여 이 고급 스크리닝 파이프라인은 이러한 '실험실 내 환자'에서 임상적으로 관련된 정보를 더 많이 추출하여 예측 성능을 향상시킬 것으로 예상됩니다. 이 가설은 현재 저자의 실험실에서 임상 PDTO 샘플을 스크리닝하여 생체 외 반응 및 임상 결과와 상호 연관시켜 테스트되고 있습니다. 
약물 반응의 메커니즘에 대한 더 많은 통찰력을 얻기 위해 세포 독성 염료 외에도 기존의 형광 생세포 이미징 시약이 이 방법과 호환되어 세포 사멸 메커니즘을 연구합니다. 우리는 이전에 시스플라틴 치료8 후 카스파제 의존성 세포자멸사 유도를 연구하기 위해 이 방법과 Sartorius Caspase 3/7 녹색 시약의 호환성을 보여주었습니다. 산화 스트레스(CellROX 시약) 또는 저산소증(Image-iT 저산소증 시약)을 연구하기 위한 다른 염료와의 호환성은 아직 테스트되지 않았습니다. 그러나, 이들 시약은 이미 3D 시험관내 모델14,15에서 성공적으로 사용되고 있다.
이미지 분석 소프트웨어는 오가노이드의 선명하고 초점이 맞는 이미지를 캡처할 수 있는 경우 다른 플레이트 형식 또는 배양 방법(예: 마이크로캐비티 플레이트, ECM 돔)과도 호환됩니다. 돔에서 배양된 오가노이드는 서로 다른 z-평면에서 자라기 때문에 항상 사용할 수 없는 현미경의 z-스태킹 기능이 필요하기 때문에 이는 종종 어렵습니다. 따라서 충분한 품질의 이미지를 보장하기 위해 평평한 바닥 ULA 384-well 마이크로 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다. 
또한, 분석은 IncuCyte ZOOM 시스템(8)으로 캡처된 위상차 이미지에 대해 이전에 도시된 바와 같이, 다른 라이브 셀 이미징 시스템과 호환됩니다. 이 원고에 사용된 Spark Cyto 라이브 셀 이미징 시스템의 한계는 운동 측정을 위한 원플레이트 용량입니다. 그러나 Spark Motion 확장은 대량으로 스크리닝할 수 있는 최대 40개의 마이크로플레이트로 용량을 증가시킵니다. 사내에서 개발한 소프트웨어의 호환성은 이미지 및 데이터 분석 파이프라인을 표준화하고 자동화하는 것을 목표로 플랫폼에 구애받지 않는 솔루션을 제공하기 위해 이러한 시스템 및 기타 시스템으로 확장될 것입니다. 웹 기반 애플리케이션에는 이 백서에 표시된 것처럼 대화형 그래프 도구와 자동화된 약물 메트릭 계산도 포함되어 수동 분석 시간을 단축합니다.
무표지 PDTO 분할 알고리즘은 뚜렷한 형태학적 차이(고체, 반고체, 낭성)가 있는 다양한 자체 성장 스페로이드 및 PDTO 모델에서 훈련 및 테스트되었으며 결과적으로높은 정확도로 이를 감지할 수 있습니다8. 이 모델의 한계는 낭성 PDTO를 포함하면 파종 후 우물에 존재하는 기포의 원치 않는 검출이 증가한다는 것입니다. 그러나, 하룻밤 배양은 이들 기포의 대부분을 제거하기에 충분하였고, 정성적 시점 0 스캔을 허용하였다. 오가노이드 이미지 분할 및 방법의 정확성은 다른 사용자가 검증해야 하며, 사용자의 피드백을 기반으로 소프트웨어를 추가로 훈련하여 강력하고 자동화된 이미지 분석 알고리즘을 얻을 수 있습니다. 또한, 우리는 이 방법으로 정량화된 체외의 약물 반응을 환자의 임상 반응과 연관시켜 치료 반응을 예측하기 위한 최상의 파라미터를 식별하고 기능적 정밀 암 의학을 위한 이 방법을 추가로 개발하는 더 많은 임상 데이터를 얻는 것을 목표로 합니다16.

최근 몇 년 동안 체외 암 약물 발견, 약물 스크리닝 및 기초 연구는 불멸화 된 세포주가있는 전통적인 2 차원 (2D) 암 모델의 사용에서보다 생리 학적으로 관련성이 높은 3 차원 (3D) 암 모델로 전환되고 있습니다. 이것은 고형 종양에 존재하는 더 복잡한 세포 간 상호 작용 및 구조를 재현하는 확립된 암 세포주를 가진 종양 스페로이드의 채택에 박차를 가했습니다. 현재 환자 유래 종양 오가노이드(PDTO)는 종양 스페로이드에 비해 추가적인 이점, 즉 암 환자1에서 발견되는 이질성을 제공하기 때문에 시험관 내 암 연구에 사용할 수 있는 가장 진보되고 생리학적으로 관련된 3D 암 모델입니다. PDTO는 암 환자로부터 유래 한 종양 조직으로부터 확립되며, 따라서 종양 표현형과 유전자형을 모두 유지한다. 따라서 PDTO는 기초 및 중개 암 연구에 매우 중요해지고 있으며 정밀종양학을 크게 개선할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다2.
유망한 잠재력에도 불구하고 이러한 정교한 3D 체외 암 모델은 고급 분석 방법이 부족하기 때문에 종종 활용도가 낮습니다. 가장 일반적으로 사용되는 분석은 세포내 ATP3의 정량화를 통해 PDTO에서 생존 가능한 세포의 수를 결정합니다. 이러한 분석은 일반적으로 단일 시점, 대량 분석이므로 중요한 시간 종속 반응을 간과하고 클론 반응을 무시합니다. 특히, PDTO의 성장 (성장률)과 특정 치료법에 대한 반응을 모니터링하는 능력은 높은 관심의 대상입니다 4,5. 양성(ctrl+) 및 음성 대조군(ctrl-) 상태로 정규화된 성장률을 기반으로 약물 반응에 점수를 매기는 정규화된 약물 반응(NDR)도 최근 세포 기반 스크리닝으로 항암제 민감도를 평가하는 중요한 지표로 보고되었지만 주로 2D 세포주6에 대해 수행되었습니다. 따라서 이러한 임상적으로 대표적이고 복잡한 3D 암 모델을 최대한 활용하기 위해서는 보다 정교한 분석 방법이 필요합니다. 현미경은 이러한 유기체 모델의 복잡성을 연구하는 강력한 접근 방식으로 간주됩니다7.
이 백서는 기존의 광시야 현미경 및 생세포 이미징 시스템을 사용하여 3D 암 모델에서 운동 약물 반응을 모니터링하는 방법을 설명합니다. Driehuis et al.4 에서 설명한 프로토콜은 피펫팅 로봇, 디지털 약물 디스펜서 및 생세포 이미징 시스템을 사용하는 자동화와 호환되도록 조정되어 재현성을 높이고 '실습' 노동 시간을 줄였습니다. 이 방법을 사용하면 384웰 마이크로플레이트 및 다중 오가노이드 형식으로 확립된 암 세포주(테스트된 세포주는 보충 표 S1 참조)와 PDTO가 있는 종양 스페로이드를 모두 중간에서 고처리량으로 약물 스크리닝할 수 있습니다. 컨볼루션 네트워크 머신 러닝 프로세스를 사용하면 형광 생세포 라벨링 염료를 사용하지 않고 명시야 이미징에서만 개별 종양 스페로이드 또는 PDTO의 자동 식별 및 추적을 수행할수 있습니다8. 명시야 이미징을 사용한 대부분의 식별에는 수동 주석(힘들고 시간이 많이 소요됨)이 필요하거나 형광 염료를 추가해야 하므로 광독성 유도 산화 스트레스와 관련된 약물 반응을 혼동할 수 있기 때문에이는 매우 유리합니다9.
그 결과 자체 개발한 이미지 분석 소프트웨어는 3D 이미지 분석 모듈을 사용할 수 없거나, 플랫폼이 제한되거나, 384웰 마이크로플레이트 및 홀웰 이미징과 호환되지 않기 때문에 기존 라이브 셀 이미징 시스템의 기능을 확장합니다. 또한 이러한 모듈은 종종 가격이 비싸고 제한된 벌크 오가노이드 판독값을 제공합니다. 따라서 이 방법은 널리 사용 가능한 생세포 이미징 시스템에 액세스할 수 있고 황금 표준이지만 기초적인 ATP 기반 분석에 비해 약물 반응에 대한 더 많은 정보를 추출하는 것을 목표로 하는 과학자에게 매우 적합합니다. 특정 세포 사멸 지표를 추가하면 세포 증식 억제 약물 반응을 세포 독성 반응과 구별 할 수 있으므로 현재 단일 시점 분석에서 달성 할 수없는 기계 론적 약물 작용에 대한 추가 통찰력을 제공합니다. 마지막으로, 라이브 셀 이미징을 통해 개별 오가노이드 추적을 통해 단일 오가노이드 약물 반응 메트릭을 획득하여 반응 이질성을 캡처하고 잠재적인 내성 서브클론을 식별할 수 있습니다.
이 방법 및 관련 이미지 분석 소프트웨어의 목표는 오가노이드 약물 스크리닝에서 저비용 자동화를 구현하여 사용자 개입을 제한하고 취급, 이미지 분석 및 데이터 분석의 변동성을 줄이는 것입니다. 연구원이 이 소프트웨어를 사용할 수 있도록 현미경 및 플랫폼에 구애받지 않으며 클라우드 기반 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다. 따라서 기존의 생세포 이미징 시스템을 지원함으로써 3D 배양 응용 분야 및 분석을 위한 기능을 개선하는 것도 목표로 합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel p300 (GEN 2) pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom ULA microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4588</td>
			<td>minimum volume 50 &#181;L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom ULA Phenoplate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6057802</td>
			<td>minimum volume 75 &#181;L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A8301</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADF+++</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Advanced DMEM/F12, 1% GlutaMAX, 1% HEPES, 1% penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe easy sealing membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z380059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase 3/7 Green&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Slides for TC10/TC20</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1450017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td>ATP-assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler for 25 mL reservoir</td>
			<td>VWR (Diversified Biotech)</td>
			<td>490006-908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling element 12 x 8 x 3 cm</td>
			<td>Bol.com</td>
			<td>9200000107744702</td>
			<td>For custom microplate holder OT-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Organoid Harvesting Solution</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3700-100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2&#160;</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotox Green</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotox Red</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300e</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Digital drug dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300e Control v3.3.5</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Control software D300e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ADF+++ supplemented with 0.5 nM WNT surrogate-Fc-Fusion protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium, 4% Rpso3-Fc Fusion Protein conditioned medium, 1x B27, 1 mM N-acetyl cysteine (NAC), 5 mM nicotinamide, 500 nM A83-01, 100 ng/mL FGF10, and 10 nM Gastrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemcitabine</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) patient-derived organoids</td>
			<td>Biobank@uza (Antwerp, Belgium; ID: BE71030031000; Belgian Virtual Tumorbank funded by the National Cancer Plan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentrons App v6.0.1</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>OT-2 control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentrons Protocol Designer Tool</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>https://designer.opentrons.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbits data compression tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>www.orbits-oncology.com or contact corresponding author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbits image analysis webapp</td>
			<td>University of Antwerp</td>
			<td></td>
			<td>www.orbits-oncology.com or contact corresponding author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Pipetting robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipette 230 mm&#160;</td>
			<td>Novolab</td>
			<td>A33696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peniciline-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspo3-Fc Fusion Protein conditioned medium</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spark Cyto 600</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell imaging and multi-mode platereader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SparkControl v3.1</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Spark Cyto control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 25 mL reservoir</td>
			<td>VWR (Diversified Biotech)</td>
			<td>10141-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T8 plus cassette</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>233360010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT Surrogate-Fc-Fusion protein</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis

환자 유래 종양 오가노이드(PDTO)는 전임상 및 중개 연구와 생체 외 약물 스크리닝에서 환자 치료 반응을 예측하는 데 큰 가능성을 가지고 있습니다. 그러나 현재의 아데노신 삼인산(ATP) 기반 약물 스크리닝 분석은 대량 판독으로 인해 PDTO에서 유지되는 것으로 나타난 약물 반응(세포증식 억제 또는 세포독성) 및 종양 내 이질성의 복잡성을 포착하지 못합니다. 생세포 이미징은 이 문제를 극복하고 약물 반응을 보다 심층적으로 시각화하는 강력한 도구입니다. 그러나 이미지 분석 소프트웨어는 PDTO의 3차원에 적합하지 않거나 형광 생존율 염료가 필요하거나 384웰 마이크로플레이트 형식과 호환되지 않는 경우가 많습니다. 이 백서에서는 기존의 광시야 라이브 셀 이미징 시스템을 사용하여 처리량이 높은 384웰 형식으로 PDTO를 시드, 처리 및 이미지화하는 반자동 방법론에 대해 설명합니다. 또한 생존력 마커가 없는 이미지 분석 소프트웨어를 개발하여 재현성을 개선하고 서로 다른 PDTO 라인 간의 성장률 변화를 수정하는 성장률 기반 약물 반응 지표를 정량화했습니다. 양성 및 음성 대조군 조건으로 정규화된 성장률을 기반으로 약물 반응에 점수를 매기는 정규화된 약물 반응 메트릭과 형광 세포 사멸 염료를 사용하면 세포독성 및 세포증식 억제 약물 반응을 쉽게 구별할 수 있어 반응자와 비반응자의 분류를 크게 개선할 수 있습니다. 또한, 약물-반응 이질성은 단일 오가노이드 약물 반응 분석으로부터 정량화함으로써 잠재적인 내성 클론을 식별할 수 있다. 궁극적으로, 이 방법은 운동 성장 정지 및 세포 사멸 정량화를 포함하는 다중 파라미터 약물 반응 시그니처를 캡처하여 임상 치료 반응의 예측을 개선하는 것을 목표로 합니다.

자동 피펫팅 프로토콜은 384웰 마이크로플레이트의 모든 컬럼에서 PDAC_060 PDTO의 균일한 분포를 보장합니다(그림 2A). 예상대로 우물 사이에서 PDTO의 수와 평균 면적의 변화가 관찰되었습니다(그림 2A,B). 총 생존 면적(총 명시야 면적 - 총 녹색 영역)은 무표지 오가노이드 분할과 형광 기반 세포 사멸 신호를 결합하며, 경험상 시간 경과에 따른 약물 반응을 연구하는 데 가장 강력한 매개변수입니다(그림 2C)8. 세포 파종 및 오가노이드 크기의 변동을 설명하려면 성장률 기반 메트릭을 사용하여 그림 2D와 그림 2C의 오차 막대 감소와 약물 스크리닝 품질이 크게 향상되었음을 나타내는 더 높은 Z 인자에서 볼 수 있듯이 반복실험 간의 변동을 줄여야 합니다(그림 2E).
ctrl- 및 ctrl+로 정규화된 NDR 용량-반응 곡선(그림 2G)은 약물 반응 곡선의 분리를 증가시키고 세포독성 약물 반응을 보다 정확하게 나타내기 때문에 ctrl-로 정규화된 GR 용량-반응 곡선(그림 2F)보다 분명히 우수합니다. ctrl-, ctrl+ 및 400nM 젬시타빈/80nM 파클리탁셀 처리된 PDTO에 대한 관련 이미지의 예가 그림 3에 나와 있습니다. 흥미로운 관찰은 파클리탁셀의 부가가치가 관찰되지 않았기 때문에 젬시 타빈의 세포 독성 효과가 병용 요법에서 지배적이라는 것입니다.
다음으로 두 개의 추가 PDTO 라인 인 PDAC_052과 PDAC_087이 사용되었습니다. 이러한 라인 간의 성장률의 명확한 차이가 관찰되었으며(그림 4A), 이는 GR 메트릭의 사용을 뒷받침합니다. 다시, NDR 용량-반응 곡선(도 4C)은 GR 곡선(도 4B)에 비해 3명의 상이한 환자 사이의 증가된 동적 범위 및 분리를 초래하였다. 또한, 이 프로토콜은 시간 경과에 따른 NDR의 결정을 허용하고 PDAC_052 및 PDAC_060이 저용량의 gem-pac(그림 4D)에 대해 매우 유사한 세포증식 억제 약물 반응을 갖는 반면, gem-pac의 중간(그림 4E) 및 고용량(그림 4F)에 대해 명확한 차등 세포증식 억제 대 세포독성 반응이 관찰될 수 있음을 보여줍니다. 이러한 약물 반응은 환자에서 관찰된 임상 반응과 일치하였다(도 4G).
마지막으로, 접근 방식과 소프트웨어의 주요 이점은 단일 오가노이드 약물 반응을 정량화하여 반응 이질성을 연구하고 잠재적으로 내성이 있는 서브클론을 식별할 수 있다는 것입니다. 도 5 는 상이한 환자들의 클론 역학에 대한 명확한 개요를 제공하고, PDAC-087이 치료 후 가장 내성이 강한 서브클론을 가졌음을 보여주며, 이는 환자에서 관찰된 공격적이고 내성이 높은 질환과 일치한다. 흥미롭게도 이 환자는 ctrl+ 스타우로스포린에 가장 덜 민감했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig01.jpg"> 그림 1: 워크플로 개요. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig02v2.jpg"> 그림 2: 파종 정확도 및 약물 반응 지표 . (A) 피펫팅 로봇을 사용하여 384웰 마이크로플레이트에 시딩된 PDAC_060 PDTO의 오가노이드 수/웰. 각 점은 단일 웰의 카운트를 나타내며 플롯은 384웰 마이크로플레이트 컬럼으로 구분됩니다. (B) 평균 PDTO 영역 / 우물. (C) 젬시타빈/파클리탁셀의 5:1 비율로 처리된 PDAC_060 PDTO의 총 생존 면적(총 명시야 면적 - 총 녹색 면적) 및 (D) 성장률(T0 = 1로 정규화된 총 생존 면적). (E) 분석 품질에 대한 메트릭으로서의 Z 인자. (F) ctrl-로 정규화된 성장률-용량 반응 곡선 및 (G) ctrl- 및 ctrl+로 정규화된 정규화된 약물 반응 곡선. 오차 막대는 두 웰의 평균 ± SD를 나타냅니다. 약어 : PDAC = 췌장 관 선암; PDTO = 환자-유래 종양 오가노이드; GR = 성장률; NDR = 정상화 약물 반응. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig02largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig03.jpg"> 그림 3: 예제 이미지. 비히클(ctrl-), 400nM 젬시타빈/80nM 파클리탁셀, 및 2μM 스타우로스포린(ctrl+)으로 처리된 PDAC_060 PDTO의 대표 이미지. 왼쪽 열은 명시야 이미지를, 가운데 열은 Cytotox Green 형광 신호를, 오른쪽 열은 오가노이드 분석 모듈을 사용하여 주석이 없는 비표지 명시야 이미지를 보여줍니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어 : PDAC = 췌장 관 선암; PDTO = 환자-유래 종양 오가노이드; GemPac = 젬시 타빈 / 파클리탁셀. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig04.jpg"> 그림 4 : 환자 간 약물 반응 비교. (A) PDAC_052, PDAC_060 및 PDAC_087 PDTO 라인의 성장률 (총 생존 면적 기준) 비교. (B) ctrl-로 정규화된 성장률-용량 반응 곡선 및 (C) ctrl- 및 ctrl+로 정규화된 정규화된 약물 반응 곡선. (D) 저용량, (E) 중간 및 (F) 고용량의 젬시타빈/파클리탁셀(5:1 비율)의 키네틱 NDR. (g) PDAC 환자의 임상적 특성. 오차 막대는 두 웰의 평균 ± SD를 나타냅니다. 약어 : PDAC = 췌장 관 선암; PDTO = 환자-유래 종양 오가노이드; GR = 성장률; NDR = 정규화 된 약물 반응; FFX = 폴 피리 녹스. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig05.jpg"> 그림 5: 단일 오가노이드 메트릭. 비히클(ctrl-), 400nM 젬시타빈/80nM 파클리탁셀 및 2μM 스타우로스포린(ctrl+)으로 처리된 PDAC_052, PDAC_060 및 PDAC_087 PDTO의 세포 사멸(녹색 영역/명시야 영역) 및 면적(명시야)을 기반으로 한 단일 오가노이드 용량 반응. 녹색 영역은 실행 가능한 유기체를 나타냅니다. 파란색 영역은 GemPac 및 ctrl+ 플롯의 x-as 범위를 나타냅니다. 약어 : PDAC = 췌장 관 선암; PDTO = 환자-유래 종양 오가노이드; GemPac = 젬시 타빈 / 파클리탁셀. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>세포 현탁액 스톡</td>
			<td>셀/드롭</td>
			<td># 방울 (20 μL)</td>
			<td>재고 (1/3)</td>
			<td>ECM (2/3)</td>
		</tr><tr><td>1.13 × 107 세포/mL</td>
			<td>75,000</td>
			<td>10</td>
			<td>75 uL</td>
			<td>150 μL</td>
		</tr><tr><td>1.13 × 107 세포/mL</td>
			<td>75,000</td>
			<td>5</td>
			<td>40 uL</td>
			<td>80 μL</td>
		</tr></tbody></table>표 1: ECM 돔의 도금을 위한 희석. 약어 : ECM = 세포 외 기질.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>화합물</td>
			<td>주식 집중</td>
			<td>희석</td>
			<td>작업 집중</td>
			<td>용매</td>
			<td>우물 집중</td>
			<td>코멘트</td>
		</tr><tr><td>사이토 톡스 그린</td>
			<td>1 mM (DMSO)</td>
			<td>1/10</td>
			<td>10 마이크로미터</td>
			<td>증권 시세 표시기</td>
			<td>60 nM</td>
			<td>세포 사멸 마커</td>
		</tr><tr><td>사이토톡스 레드</td>
			<td>1 mM (DMSO)</td>
			<td>1/10</td>
			<td>10 마이크로미터</td>
			<td>증권 시세 표시기</td>
			<td>250 nM</td>
			<td>세포 사멸 마커</td>
		</tr><tr><td>카스파세 3/7 그린</td>
			<td>5 mM (DMSO)</td>
			<td>1/2</td>
			<td>2.5 밀리미터</td>
			<td>증권 시세 표시기</td>
			<td>2.5 마이크로미터</td>
			<td>세포 사멸 마커</td>
		</tr><tr><td>회히스트</td>
			<td>20 mM (H2O)</td>
			<td>1/200</td>
			<td>100 마이크로미터</td>
			<td>0.33% 트윈/PBS</td>
			<td>50 nM</td>
			<td>핵 마커</td>
		</tr><tr><td>스타우로스포린</td>
			<td>10 mM (DMSO)</td>
			<td>/</td>
			<td>1 - 10 밀리미터</td>
			<td>/</td>
			<td>2 – 5 μM</td>
			<td>양성 대조군</td>
		</tr><tr><td>젬시 타빈</td>
			<td>10 mM (DMSO)</td>
			<td>/</td>
			<td>1 - 10 밀리미터</td>
			<td>/</td>
			<td>적정</td>
			<td>화학요법</td>
		</tr><tr><td>파클리탁셀</td>
			<td>10 mM (DMSO)</td>
			<td>/</td>
			<td>1 - 10 밀리미터</td>
			<td>/</td>
			<td>적정</td>
			<td>화학요법</td>
		</tr><tr><td>시스플라틴</td>
			<td>5 mM (0.9 % NaCl)</td>
			<td>1/2</td>
			<td>2.5 밀리미터</td>
			<td>0.6 % 트윈 / PBS</td>
			<td>적정</td>
			<td>화학요법</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 자주 사용되는 약물 및 형광 시약의 희석 예. 각 화합물은 100 % DMSO 또는 0.3 % 트윈 / PBS에 용해되어야합니다.
보충 표 S1: 호환 가능한 암 세포주의 개요. 정적: 스페로이드는 철새가 아닙니다. 병합: 스페로이드는 서로를 향해 이동하고 함께 병합됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434_SuppTableS1%20(1).xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 오가노이드 파종 용액 계산 도구. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%201.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2: 3D 프린팅 맞춤형 실험기구 '마이크로플레이트 홀더'를 위한 STL 파일. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%202.stl" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 3: 3D 프린팅 맞춤형 실험기구용 STL 파일 '2 x 25 mL 리저버 홀더'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%203.stl" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 4: 맞춤형 실험기구 피펫팅 로봇 '마이크로플레이트 홀더'용 JSON 파일. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%204.json" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 5: 맞춤형 실험기구 피펫팅 로봇용 JSON 파일 '2 x 25 mL 리저버 Holder_WithCooler'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%205.json" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 6: 피펫팅 로봇 프로토콜 'Plating_ PDO_384well_Cooled_Row2-23'을 위한 JSON 파일. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%206.json" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 7: 파이펫팅 로봇 책상 설정 개요. (A) 냉각 요소 및 (B) 저장소 및 마이크로 플레이트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%207.png" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 8: 디지털 약물 디스펜서의 프로토콜에 대한 TDD 파일. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%208.tdd" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 9: 명시야 및 형광 이미징을 위한 라이브 셀 이미저의 프로토콜을 위한 XML 파일입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%209.xml" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 10: 플레이트 맵 예. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2010.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 11: NDR R 스크립트에 대한 예제 입력 파일입니다. 약어 : NDR = 표준화 된 약물 반응. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2011.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 12: 정규화된 약물 반응 NDR R 스크립트. 약어 : NDR = 표준화 된 약물 반응. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2012.R" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보조 파일 13: NDR R 스크립트 GR 값의 예제 출력 파일입니다. 약어 : GR = 성장률; NDR = 정상화 약물 반응. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2013.csv" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 14: GR 값이 전치된 NDR R 스크립트의 예제 출력 파일입니다. 약어 : GR = 성장률; NDR = 정상화 약물 반응. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2014.csv" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
S보충 파일 15: NDR R 스크립트 NDR 값의 예제 출력 파일입니다. 약어 : NDR = 표준화 된 약물 반응. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2015.csv" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보조 파일 16: NDR 값이 전치된 NDR R 스크립트의 예제 출력 파일입니다. 약어 : NDR = 표준화 된 약물 반응. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2016.csv" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis at JoVE.com

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

이 프로토콜은 종양 내 이질성을 포착하기 위해 다중 매개변수, 단일 오가노이드 약물 반응을 정량화하고 시각화하기 위한 중간 및 고처리량 오가노이드 약물 스크리닝 및 현미경에 구애받지 않는 자동 이미지 분석 소프트웨어를 위한 반자동 방법을 설명합니다.

벌크 및 단일 오가노이드 분석을 위한 광시야 라이브 셀 이미징을 사용한 다중 파라미터 종양 오가노이드 약물 스크리닝

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

이 프로토콜을 통해 연구원은 분석 파이프라인을 간소화할 수 있을 뿐만 아니라 오가노이드 스트림에서 더 많은 정보를 추출하여 번역 관련성을 높일 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 간소화된 워크플로우와 자동화되고 임상적으로 관련된 분석 파이프라인을 결합하여 연구자가 하나의 단일 오가노이드 스크린에서 강력한 양의 정보를 얻을 수 있다는 것입니다. 이 기술은 매우 유망한 초기 결과로 이러한 생체 외 오가노이드 약물 스크리닝에서 암 환자의 임상 치료 반응을 예측하는 데 사용할 수 있습니다.목표는 소프트웨어 솔루션 플랫폼을 애그노스틱하게 만들어 연구원들이 사용할 수 있는 라이브 셀 이미징 기기를 사용할 수 있도록 하는 것입니다. 6웰 마이크로플레이트의 세포외 기질 또는 ECM 돔에서 환자 유래 종양 오가노이드(PDTO)를 효소적으로 해리하는 것으로 시작합니다. 이를 위해 먼저 매체를 흡입하고 ECM 돔을 PBS로 한 번 씻으십시오.그런 다음 우물에 2 밀리리터의 해리 효소를 넣으십시오. 1 밀리리터 피펫을 사용하여 내용물을 위아래로 10 번 피펫하여 돔의 유기체를 기계적으로 해리 한 후 섭씨 37도에서 10 분 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후, 내용물을 위아래로 피펫팅하고, 현미경을 사용하여 단일 세포에 대한 오가노이드의 적절한 해리를 확인합니다.15 밀리리터 튜브에 세포 현탁액을 모으고 ADF + 원심 분리기를 추가하여 실온에서 5 분 동안 450g으로 튜브를 10 밀리리터까지 부피를 만들고 파스퇴르 피펫과 흡입 펌프를 사용하여 상청액을 흡인합니다. 선택한 방법을 사용하여 세포 수를 계수하기 전에 펠렛의 크기에 따라 전체 췌관 선암 또는 PDAC, 오가노이드 배양 배지의 100 내지 200 마이크로리터에 펠렛을 재현탁시킨다. ECM 돔에서 단일 세포를 플레이팅하려면 필요한 양의 해동된 ECM을 추가하여 적절한 양의 세포 현탁액을 희석합니다.그런 다음 섭씨 37도로 예열된 6웰 플레이트에서 웰당 최대 10개의 20마이크로리터 방울을 피펫팅합니다. 플레이트를 뒤집고 섭씨 37도에서 30 분 동안 배양하십시오. 다음으로, 10- 마이크로 몰 Y-27632가 보충 된 전체 배지로 웰을 오버레이하고 인큐베이터에서 2-3 일 동안 배양하십시오.2-3일된 오가노이드를 수확하려면 먼저 배지를 흡인하고 PBS로 오가노이드를 한 번 세척합니다. 그런 다음 ECM 돔의 수에 따라 섭씨 4도까지 사전 냉각된 1-2밀리리터의 오가노이드 수확 용액을 6웰 플레이트의 웰에 추가합니다. 얼음 위에 보관 된 접시를 흔들리는 플랫폼에서 10 분 동안 배양하십시오.이제 1 밀리리터 피펫으로 웰의 내용물을 위아래로 피펫팅하여 ECM 돔을 분리합니다. 다시 한 번, 현미경으로 ECM 돔의 해리를 육안으로 확인하기 전에 얼음 위에서 10분 동안 오가노이드를 배양합니다. PBS에 0.1%BSA로 사전 코팅된 15밀리리터 튜브에 오가노이드를 수집하고 ADF+Centrifuge를 추가하여 튜브를 섭씨 4도에서 5분 동안 200g으로 추가하여 부피를 10밀리리터로 구성합니다.다음으로, 상청액을 흡인하고, 그의 크기에 따라 펠렛을 최대 1 밀리리터의 전체 PDAC 오가노이드 배지에 원하는 최종 오가노이드 농도로 재현탁시킨다. 파이펫팅 로봇 제어 어플리케이션을 열고 프로토콜을 선택한 다음 제공된 보조 파일 6을 지정된 필드로 끌어다 놓기 전에 가져오기를 클릭합니다. 가져온 프로토콜을 선택합니다.그리고 데크 설정 필드에 표시된 레이아웃에 따라 냉각 요소와 플라스틱 제품을 포함한 모든 실험기구를 데크에 배치합니다. 왼쪽 슬롯을 25 밀리리터 저장소 및 냉각 요소로 사용하십시오. 그런 다음 프로토콜 실행을 클릭하고 설정을 진행합니다.실험기구 설정 탭을 열고 실험기구 위치 확인 실행을 클릭한 다음 지침에 따라 피펫팅 로봇을 새 하드웨어에 맞게 교정합니다. 냉각 요소 위에 놓인 25밀리리터 저장소를 냉각된 오가노이드 파종 용액으로 채우고 Start Run(실행 시작)을 클릭하여 피펫팅 로봇을 작동시킵니다. 다음으로, 마이크로플레이트를 섭씨 4도에서 1분 동안 100g의 속도로 원심분리한다.디지털 약물 디스펜서 제어 소프트웨어를 사용하여 약물 디스펜싱 프로토콜을 생성하려면 플레이트 레이아웃 위의 플레이트 1 위로 마우스를 가져갑니다. 플레이트 속성 편집을 선택하고 유체 옆에 있는 추가 버튼을 클릭하여 플레이트 유형을 384웰로, 추가 부피를 50마이크로리터로, DMSO 제한을 1%유체 추가로, 새로 생성된 유체를 두 번 클릭하여 이름을 지정합니다. 이어서, 클래스를 DMSO 기반 또는 수성 플러스 트윈 20으로 선택하고, 농도를 채운다.약물 적정을 위한 플레이트 레이아웃을 생성하려면 Wells를 선택하고 적정을 클릭합니다. 유체의 경우 원하는 최고 농도 및 최저 농도와 함께 관심 약물을 선택하십시오. 반복실험의 경우 최소 2개를 선택하고 원하는 적정 패턴을 선택합니다.양성 대조군에 대한 플레이트 레이아웃을 만들려면 3개의 웰을 선택하고 Set Value를 클릭한 다음 DMSO의 10밀리몰 스톡에서 2마이크로몰 스타우로스포린을 채워 최대 세포 사멸을 유도합니다. Cytotox Green의 경우 사용된 모든 웰을 선택하고 값 설정을 클릭한 다음 웰당 60나노몰 값을 입력합니다. 음성 대조군 및 DMSO 정규화의 경우, 비히클 대조군을 위한 추가 4개의 웰이 있는 모든 웰을 선택한다.이제 정규화된 유체 클래스를 DMSO 기반으로 할당하기 전에 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 정규화를 선택합니다. 이어서, 최고 클래스 부피로 정규화하여 각각의 웰에서 동일한 DMSO 농도를 얻는다. 그런 다음 왼쪽 상단 모서리에 있는 실행 아래의 화살표를 클릭하고 항상 시뮬레이션을 선택한 다음 시뮬레이션을 클릭하여 오류를 식별하고 준비할 각 약물의 양을 얻습니다.이제 실행을 클릭하여 약물 분배 프로토콜을 시작하기 전에 실행 버튼 아래의 항상 시뮬레이션을 선택 취소하고 지침을 따르십시오. 증발을 방지하기 위해 밀봉 멤브레인을 마이크로 플레이트에 적용하십시오. 라이브 셀 이미저 제어 소프트웨어를 열고 메서드 편집기 새로 만들기를 선택한 다음 파일로 이동하여 예제 메서드 XML 파일을 가져옵니다.또는 원고의 지침에 따라 새 파일을 만듭니다. 그런 다음 시작을 클릭하여 데이터를 병합 및 압축 T0.To 스캔을 시작하고, 라이브 셀 이미저 제어 소프트웨어에 의해 각 시점에서 각 스캔에 대해 생성된 모든 개별 실험 폴더를 전송하기 위한 새 상위 폴더를 만들고, 원고에 제공된 지침에 따라 각 폴더의 이름을 지정합니다. 약물 분배 프로토콜에서 플레이트 맵 레이아웃을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 모든 웰을 복사하여 XLSX 파일에 데이터를 붙여넣어 디지털 약물 디스펜서 제어 소프트웨어에서 XLSX 플레이트 맵을 준비합니다.Cytotox Green 및 스타우로스포린 데이터를 제거하고, 세포주에 대한 매트릭스를 추가하고, 음성 대조군과 양성 대조군을 입력합니다. 데이터 압축 도구를 엽니다. 검색을 클릭하고 상위 폴더를 선택한 다음 압축을 클릭하여 이미지 데이터 압축을 시작합니다.모든 TIFF 이미지 파일은 상위 폴더 내의 새 데이터 세트 폴더에 있는 각 웰에 대해 단일 HDF5로 압축됩니다. 이미지를 분석하려면 이미지 분석 웹 앱 플랫폼으로 이동하여 로그인하고 홈 탭에서 새 프로젝트 추가를 클릭합니다. 프로젝트 이름을 입력하고 계속을 누른 다음 새 실험 추가를 선택한 다음 HDF5 파일이 포함된 데이터 세트 폴더를 업로드합니다.업로드 후 프로젝트 및 실험 폴더로 이동하여 플레이트 맵 업로드를 클릭하여 추가 기능을 확인합니다. 그런 다음 분석 실행을 순차적으로 클릭하고 다중 오가노이드 분석, 기본 매개 변수를 선택하고 마지막으로 분석을 선택하여 이미지 분석을 시작합니다. 추가 데이터 처리를 위해 분석의 정확성을 확인하기 전에 각 웰에 대한 측정값과 분할된 이미지 또는 비디오가 포함된 원시 데이터 테이블을 다운로드하려면 결과 다운로드를 클릭합니다.오가노이드 파종 밀도와 크기의 변화를 설명하기 위해 감소된 오차 막대로 표시된 대로 반복실험 간의 변동을 줄이기 위해 성장률 기반 메트릭을 사용했습니다. 음성 대조군, 양성 대조군 및 젬시타빈과 파클리탁셀 처리된 PDTO의 조합에 대한 이미지는 요법이 0 바로 아래의 정규화된 약물 반응 또는 NDR에 해당하는 제한된 양의 세포 사멸로 주로 성장 정지를 유도했음을 보여주었습니다. PDAC_052 및 PDAC_087의 두 개의 추가 라인을 사용하면 세 라인 간의 성장률에 명확한 차이가 관찰되어 GR 메트릭 사용을 뒷받침했습니다.NDR 용량-반응 곡선은 GR 곡선과 비교하여 세 명의 다른 환자 간의 동적 범위와 분리를 증가시켰습니다. 시간 경과에 따른 NDR의 측정은 PDAC_052 및 PDAC_060가 저용량의 젬시타빈-파클리탁셀에 대해 매우 유사한 세포증식 억제 약물 반응을 갖는 반면, 상응하는 중간 및 고용량에 대해 명확한 차등 세포증식 억제 대 세포독성 반응이 관찰될 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 약물 반응은 환자에서 관찰된 임상 반응과 일치하였다.클론 역학은 치료 후 PDAC_087 가장 내성이 강한 서브클론을 가지고 있음을 밝혀 냈으며, 이는 흥미롭게도 양성 대조군 staurosporin에 가장 덜 민감한 환자에서 관찰 된 질병의 공격적인 특성과 일치합니다. 프로토콜의 가장 중요한 측면은 ECM의 잘못된 응고가 다운스트림 이미지 분석을 방해할 수 있기 때문에 시드 중에 ECM이 포함된 모든 솔루션을 냉각된 상태로 유지하는 것입니다. 습식 실험실 작업의 자동화, 이미지 분석 및 다운스트림 데이터 처리는 연구를 가속화하고 새로운 조합 요법을 보다 쉽게 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

터치 인쇄물 세포학을 사용 하 여 병 적인 임상 표본에서 높은-품질 종양 DNA를 간단 하 고 빠른 방법

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

연구

암 연구학

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

방사성 핵 종 형광 취재 원 유전자 설치류 종양 모델에서 종양의 진행을 추적 하기 위해 이미징

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

라이브 셀 이미징 분석 실험 연구 세포종 뇌 종양 줄기 세포 이동과 내 습을

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

암 세포 침입과 반대로 전이성 마약 히드로 마이크로-챔버 배열 (HMCA)를 사용 하 여 심사 분석-플레이트를 기반으로

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

작은 창자 신경 내분비 종양 스페로이드의 설치 그리고 특성화

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

종양-기질 상호 작용 및 약물 발견을 연구하기 위한 새로운 기질 섬유아세포 변조 3D 종양 스페로이드 모델

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...