Name: multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis
Uploaded: 2022-12-23T13:50:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis at JoVE.com

En del av denne forskningen ble finansiert av donasjoner fra forskjellige givere, inkludert Dedert Schilde vzw og Willy Floren. Dette arbeidet er delvis finansiert av den flamske forskningsstiftelsen, 12S9221N (A.L.), G044420N (S.V., A.L., E.G.), 1S27021N (M.L.), og av Industrial Research Fund ved Universitetet i Antwerpen, PS ID 45151 (S.V., A.L., C.D.). Figur 1 ble laget med BioRender.com.

Humant pankreatisk duktalt adenokarsinom (PDAC) pasientavledede organoider ble brukt. Fragmenter av vevsreseksjon ble innhentet fra pasienter som gjennomgikk kurativ kirurgi ved Antwerpen universitetssykehus. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter, og studien ble godkjent av UZA Ethical Committee (ref. 14/47/480). Detaljer knyttet til alt materiale, reagenser, utstyr og programvare som brukes i denne protokollen, er gitt i materialtabellen. En oversikt over arbeidsflyten er presentert i figur 1. Eksempeldata er gitt i tilleggsmaterialet for å gjengi protokollen.
1. Dag 0: Tilberedning av 2- eller 3-dagers gamle organoider
<ol><li>Forvarm mikroplatene ved 37 °C over natten og tine den ekstracellulære matriksen (ECM) ved 4 °C.</li>
	<li>Forbered fullt PDAC organoid kulturmedium: supplement ADF +++ (Advanced DMEM / F12, 1% glutamintilskudd, 1% HEPES og 1% penicillin / streptomycin) med 0,5 nM WNT surrogat-Fc-Fusion protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein betinget medium, 4% Rpso3-Fc Fusion Protein betinget medium, 1x B27, 1 mM N-acetylcystein (NAC), 5 mM nikotinamid, 500 nM A83-01, 100 ng / ml FGF10 og 10 nM Gastrin).</li>
	<li>Etablere PDTOene i henhold til den valgte metoden. MERK: En detaljert protokoll er levert av Driehuis et al., som beskriver den konvensjonelle metoden for å etablere, dyrke og passere PDTO-er i ECM-kupler4.</li>
	<li>Enzymatisk dissosiere organoider i ECM kupler.<ol><li>Aspirer mediet og vask 1x med fosfatbufret saltvann (PBS). Legg til dissosiasjonsenzym (f.eks. 2 ml i en 6-brønns mikroplate) og pipette opp og ned 10x med en 1 ml pipette for å mekanisk dissosiere organoider og ECM-kupler.</li>
		<li>Inkuber i 10 minutter ved 37 °C, pipette opp og ned, og sjekk om organoidene er dissosiert til enkeltceller. Gjenta dette trinnet om nødvendig.</li>
		<li>Samle cellesuspensjonen i et 15 ml rør, tilsett ADF+++ til et volum på 10 ml, sentrifuge i 5 minutter ved 450 × g ved romtemperatur, og aspirer supernatanten med en Pasteur-pipette og sugepumpe.</li>
		<li>Resuspend pelleten i 100-200 μL fullt medium avhengig av pelletens størrelse og telle antall celler ved hjelp av den valgte metoden. For eksempel: bland 10 μL av cellesuspensjonen + 10 μL Trypan Blue og telle med en automatisert celleteller.</li>
	</ol></li>
	<li>Plate enkeltceller i ECM-kupler.<ol><li>Fortynn cellesuspensjonen og tilsett 2/3 ECM i henhold til tabell 1. Pipette opptil ti 20 μL dråper per brønn i en forvarmet 6-brønns plate. Snu platen og inkuber i 30 minutter ved 37 °C.</li>
		<li>Overlegg med fullt medium supplert med 10 μM Y-27632 og inkuber i 2-3 dager i en inkubator. MERK: Ti kupler som inneholder 75 000 celler hver er vanligvis nok til å fylle en 384-brønns mikroplate i en konsentrasjon på 200 organoider / brønn, unntatt brønnene ved kanten.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Dag 2 - 3: Høst og frø 2- eller 3-dagers gamle organoider
<ol><li>Samle intakte organoider fra ECM-kuplene. MERK: Organoider har en tendens til å feste seg til plastoverflater (f.eks. rør, pipettespisser). For å unngå dette kan plastikk forskylles med en 0,1% bovin serumalbumin (BSA) / PBS-løsning.<ol><li>Aspirer mediet og vask 1x med PBS. Tilsett 1-2 ml kald (4 °C) organoid høstingsløsning på en 6-brønns plate avhengig av antall ECM-kupler og inkuber på is på en ristingsplattform i 10 minutter.</li>
		<li>Pipette opp og ned med en 1 ml pipette for å dissosiere ECM-kuplene, inkubere i ytterligere 10 minutter på is, og kontroller visuelt under et mikroskop om ECM er dissosiert.</li>
		<li>Valgfritt: Hvis en mer jevn størrelsesfordeling foretrekkes, filtrer suspensjonen gjennom en 70 μm cellesil før sentrifugering.</li>
		<li>Samle organoidene i et 15 ml rør forbelagt med 0,1% BSA / PBS, tilsett ADF +++ opptil 10 ml og sentrifuge i 5 minutter ved 200 × g ved 4 ° C. Aspirer supernatanten og resuspendere pelleten i opptil 1,000 μL fullt PDAC-organoidmedium, avhengig av pelletens størrelse for å oppnå en konsentrasjon på >6,000 organoider / ml.</li>
		<li>Tell organoidene ved hjelp av en hvilken som helst valgt tellemetode, helst en bildebasert.</li>
	</ol></li>
	<li>Frø organoider. MERK: Se materialtabellen for minimumsvolum/brønn for to forskjellige typer 384-brønns mikroplater som brukes i denne protokollen.<ol><li>Forkjøl alt plasttøy ved -20 °C eller på is i minst 20 minutter før bruk for å unngå størkning av ECM.</li>
		<li>Klargjør såløsningen fra 1 ml organoid stamløsning (trinn 2.1.6) ved å bruke fullt medium til frø ~ 200 organoider per brønn i 50 μL, minimumsvolumet som brukes til å fylle en brønn. Bruk tilleggsfil 1 til å beregne mengden organoidsåingsløsning. Tilsett et restvolum på 1 500 μL når du bruker et 25 ml reservoar og flerkanals pipette eller pipetteringsrobot.</li>
		<li>Frø organoidene ved hjelp av en pipetteringsrobot. MERK: Både såløsningen og mikroplaten må avkjøles ved 4 °C under pipettering for å unngå størkning av ECM. Derfor ble et 25 ml reservoar og en mikroplateholder 3D-printet for å brukes i kombinasjon med pipetteringsroboten som kan holde kjøleelementer oppført i materialtabellen. STL-filer for 3D-utskrift av tilpasset labware (tilleggsfil 2 og tilleggsfil 3) og tilpassede labware JSON-filer for pipetteringsroboten (tilleggsfil 4 og tilleggsfil 5) er gitt.<ol><li>Utform dispenseringsprotokollen ved hjelp av det elektroniske protokollutformingsverktøyet. Et eksempel på en JSON-fil (tilleggsfil 6) er gitt, der det tilpassede laboratoriet allerede er lastet inn og en åttekanals p300 (Gen2) pipette med tilhørende pipettespisser brukes.</li>
			<li>Åpne pipetteringsrobotkontrollappen, velg protokoller, klikk på Importer, og dra og slipp Tilleggsfil 6 i det angitte feltet.</li>
			<li>Velg den importerte protokollen og plasser alt labware, inkludert kjøleelementer og plastikk, i dekkene i henhold til oppsettet som vises i Deck Setup-feltet . Bruk venstre spor for 25 ml reservoar og kjøleelement som vist i tilleggsfil 7.</li>
			<li>Klikk på Run Protocol og fortsett til Setup. Åpne kategorien Labware Setup, klikk på Run Labware Position Check, og følg instruksjonene for å kalibrere pipetteringsroboten til den nye maskinvaren. MERK: Labware offset data kan lagres for senere, men det anbefales å kjøre labware posisjonskontroll før hver kjøring.</li>
			<li>Fyll 25 ml reservoaret (plassert på toppen av kjøleelementet) med den avkjølte organoidsåingsløsningen og klikk på Start Run. MERK: De øverste og nederste brønnene blir også fylt med organoid suspensjonsløsning på grunn av bruken av åttekanalspipetten.</li>
			<li>Sentrifuger mikroplaten i 1 min ved 100 × g ved 4 °C.</li>
			<li>Inkuber ved 37 °C i minst 30 minutter.</li>
			<li>Fyll de ytre tomme brønnene med minst 50 μL H2O for å unngå fordampning.</li>
			<li>Rug ved 37 °C over natten for å fjerne eventuelle bobler i brønnen som kan forstyrre bildeanalysen.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. Dag 4: Medikamentell behandling og reagensdispensering med digital legemiddeldispenser
<ol><li>Opprett protokollen for legemiddeldispensering ved hjelp av den digitale programvaren for kontroll av legemiddeldispensere.<ol><li>Hold markøren over plate 1 over plateoppsettet, velg rediger plateattributter, og fyll ut platetype: 384 brønn, tilleggsvolum (μL): 50 og DMSO-grense (%): 1.</li>
		<li>Legg til væsker ved å klikke på + -knappen ved siden av Fluids. Dobbeltklikk på det nyopprettede væsken og gi det et navn; velg klasse (DMSO-basert eller vandig+Tween 20) og konsentrasjon. MERK: Alle legemidler og reagenser må oppløses i 100% DMSO eller 0,3% Tween-20. En 1-10 mM lagerløsning kan brukes, med tanke på en maksimal DMSO-konsentrasjon på <1%. Tabell 2 gir eksempler på nødvendige fortynninger for vanlige fluorescerende reagenser og terapier.</li>
		<li>Plate layout<ol><li>For medikamenttitrering, velg brønner og klikk på Titrering. For væske, velg stoffet av interesse, velg den høyeste konsentrasjonen (f.eks. 2000 nM) og den laveste konsentrasjonen (f.eks. 10 nM); For replikasjoner velger du minimum 2 og velger ønsket titreringsmønster. MERK: Titreringsmønsteret vil avhenge av mange faktorer, inkludert hvor mye forbindelse som skal passe i en enkelt plate, om brønnene skal randomiseres, og antall replikasjoner og kontroller.</li>
			<li>For den positive kontrollen velger du tre brønner, klikker på Angi verdi og fyller ut 2 μM staurosporin fra 10 mM lager i DMSO, noe som vil indusere maksimal celledød.</li>
			<li>For Cytotox Green, velg alle brukte brønner, klikk på Angi verdi og skriv inn 60 nM / brønn. MERK: Cytotox Green fluorescerende farging indikerer celler som har dødd, og vil derfor ikke forstyrre overvåking av legemiddelrespons. Her er det ikke nødvendig med fluorescerende markør for levende celler.</li>
			<li>For negativ kontroll og DMSO-normalisering, velg alle brønnene med ytterligere fire brønner for kjøretøykontrollen, høyreklikk, velg normalisering, velg normaliser væskeklasse: DMSO-basert, og normaliser til høyeste klassevolum for å oppnå lik DMSO-konsentrasjon i hver brønn. MERK: DMSO-konsentrasjoner bør være <1%. Et eksempel på TDD-legemiddeltitreringsfil (tilleggsfil 8) er gitt.</li>
			<li>Klikk på pilen under Kjør øverst til venstre, velg Simuler alltid, og klikk på Simuler for å identifisere eventuelle feil og få volumene av hvert legemiddel som skal klargjøres. MERK: For å overvinne en advarsel når det første dispenseringsvolumet er for lavt, "Dispenser advarselsbrønn på 30 nL eller høyere anbefales for hver væske på hver plate," velg to brønner på kanten som er fylt med vann, velg Angi verdi, og skriv inn 10 μM av legemidlet som advarselen oppstår for. Dette primer legemiddelpatronen med et volum høyere enn 30 nL. De samme brønnene kan brukes til å klargjøre DMSO-kassetten ved å sette en normalisering til % av total volumverdi (f.eks. 0,5 %).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Fjern merket for Simuler alltid under Kjør-knappen ; klikk på Kjør for å starte legemiddeldispenseringsprotokollen og følg instruksjonene.</li>
	<li>Påfør tetningsmembranen på mikroplaten for å forhindre fordampning.</li>
	<li>Inkuber Cytotox Green-fargestoffet 1-2 timer ved 37 °C i inkubatoren og fortsett til trinn 4.</li>
</ol>4. Skaff bilder med live-cell imager
MERK: For veksthastighet og NDR må en skanning ved tidspunkt 0 (T0 = startbehandling) kjøpes 1-2 timer etter tilsetning av Cytotox Green.
<ol><li>Åpne programvaren Live-Cell Imager Control, velg Method Editor New, gå til fil > import, og velg eksempelmetoden XML-fil (tilleggsfil 9). Alternativt kan du opprette en ny fil og velge Plate: (CORE384fb_OpticalImaging) - Corning 384 Flat Black (Corning #4588), No lid og No humidity cassette; Søknad: Bare bilder; Mål: 4x; Mønster: Sentral; Sjekk kanaler Brightfield og Green (Led intensitet (%) = 40; Eksponeringstid (ms) = 200). MERK: De grønne kanalinnstillingene fungerer bra for en konsentrasjon på 60 nM Cytotox Green. Live viewer-alternativet kan brukes til å justere fokusforskyvningen og / eller LED-innstillingene i sanntid.</li>
	<li>Klikk på Start for å starte skanning på T0.</li>
	<li>Gjenta skanningen hver 24. time i opptil 5 dager med samme metode. Hvis du vil kjøre timelapse-målingen automatisk, kan du også justere metoden i programvaren for live-cell imager-kontroll til et kinetisk eksperiment ved å klikke og dra kategorien Kinetisk løkke inn i metodefeltet. På samme måte må temperatur- og gassfanene dras inn i metodefeltet for å sette systemet til 37 °C og 5 % CO2 for å sikre de riktige forholdene i levende cellebilder under forsøket.</li>
</ol>5. Bilde- og dataanalyse
<ol><li>Slå sammen og komprimere data<ol><li>Live-cell imager Control-programvaren genererer en mappe for hver skanning på hvert tidspunkt. Opprett en ny mappe, kopier de individuelle eksperimentmappene til denne nye overordnede mappen, og legg til _0h, _24h, _48h, _72h, _96h og _120h til de tilsvarende eksperimentmappenavnene.</li>
		<li>Forbered et XLSX-platekart fra den digitale programvaren for legemiddeldispenserkontroll ved å høyreklikke på platekartoppsettet fra legemiddeldispenserprotokollen og kopier alle brønnene; lime inn dataene i en XLSX-fil. Fjern data fra Cytotox Green og staurosporin og legg til en matrise for Cell Line og Replicate. Skriv inn ctrl- og ctrl+. Se tilleggsfil 10 for et eksempel på platekart.</li>
		<li>Åpne datakomprimeringsverktøyet, klikk på Bla gjennom, velg den overordnede mappen, og klikk på Kjør for å starte komprimering av bildedata. Alle TIFF-bildefiler for de forskjellige tidspunktene komprimeres til en enkelt HDF5 for hver brønn i en ny datasettmappe i foreldremappen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bilde analyse<ol><li>Gå til webappplattformen for bildeanalyse, logg inn og klikk på Legg til nytt prosjekt i Hjem-fanen . Skriv inn prosjektnavnet, fortsett, velg Legg til nytt eksperiment, og last opp datasettmappen som inneholder HDF5-filene.</li>
		<li>Etter opplasting, gå til prosjekt- og eksperimentmappen og klikk på Last opp platekart for flere funksjoner. Klikk på Kjør analyse, velg Multi-Organoid analyse, Standardparametere, og klikk på Analyser for å starte bildeanalyse.</li>
		<li>Klikk på Last ned resultater for å laste ned rådatatabellene som inneholder målingene for hver brønn (f.eks. totalt lysfeltområde, totalt fluorescensgrønt område osv.) og de segmenterte bildene/videoene for å bekrefte nøyaktigheten av analysen og videre databehandling.</li>
	</ol></li>
	<li>Vekstratebaserte legemiddelresponsmålinger og normalisert legemiddelrespons<ol><li>Velg Raw_NDR.xlsx fil fra resultatmappen (plate kart kreves) (Tilleggsfil 11) og last dette inn i Official_NDR_7point R-script (tilleggsfil 12) for automatisk å generere GR (normalisert til ctrl-) og NDR (normalisert til ctrl- og ctrl+) verditabeller (tilleggsfil 13, tilleggsfil 14, tilleggsfil 15 og tilleggsfil 16 ). GR- og NDR-verdier beregnes fra parameteren som vist i ligning (1) ved hjelp av R-skriptet (tilleggsfil 12). Totalt overlevelsesareal = Totalt Brightfield-område - Totalt grønt område (1) Ved 0 < NDR <1 = cytostatisk effekt (vekststans) og NDR < 0 = cytotoksisk respons (celledød). MERK: R-skriptet ble tilpasset fra Gupta et al.6.</li>
		<li>Fra clonal_data.xlsx-tabellen henter du enkeltorganoidresponsdata og plotter dem som et bobleplott.</li>
		<li>Bruk Z-faktor10 for å vurdere kvaliteten på en løpetur (se ligning (2)). Kast et eksperiment med en Z-faktor < 0,5. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64434/64434eq01.jpg" style="margin: auto;">(2)</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Veninga, V., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+organoids:+Opportunities+and+challenges+to+guide+precision+medicine.">Tumor organoids: Opportunities and challenges to guide precision medicine.</a> Cancer Cell. 39 (9), 1190-1201 (2021).</li><li>Le Compte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+as+individual+patient+models+for+chemoradiation+response+prediction+in+gastrointestinal+malignancies.">Patient-derived organoids as individual patient models for chemoradiation response prediction in gastrointestinal malignancies.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 157, 103190 (2021).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li><li>Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+inhibition+metrics+correct+for+confounders+in+measuring+sensitivity+to+cancer+drugs.">Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs.</a> Nature Methods. 13 (6), 521-527 (2016).</li><li>Gupta, A., Gautam, P., Wennerberg, K., Aittokallio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+normalized+drug+response+metric+improves+accuracy+and+consistency+of+anticancer+drug+sensitivity+quantification+in+cell-based+screening.">A normalized drug response metric improves accuracy and consistency of anticancer drug sensitivity quantification in cell-based screening.</a> Communications Biology. 3 (1), 42 (2020).</li><li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+organoids:+a+bright+future+ahead.">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li><li>Deben, C., Cardenas, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrBITS:+label-free+and+time-lapse+monitoring+of+patient+derived+organoids+for+advanced+drug+screening.">OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening.</a> Cellular Oncology. , (2022).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> Bioessays. 39 (8), (2017).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Engel, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+colorectal+cancer+organoids+upregulate+revival+stem+cell+marker+genes+following+chemotherapeutic+treatment.">Patient-derived colorectal cancer organoids upregulate revival stem cell marker genes following chemotherapeutic treatment.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (1), 128 (2020).</li><li>Hennig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+drug+resistance+in+pancreatic+cancer+organoids+guides+optimized+chemotherapy+treatment.">Detecting drug resistance in pancreatic cancer organoids guides optimized chemotherapy treatment.</a> The Journal of Pathology. 257 (5), 607-619 (2022).</li><li>D'Alterio, C., Scala, S., Sozzi, G., Roz, L., Bertolini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+effects+of+chemotherapy+on+tumor+relapse+and+metastasis+promotion.">Paradoxical effects of chemotherapy on tumor relapse and metastasis promotion.</a> Seminars in Cancer Biology. 60, 351-361 (2020).</li><li>Njoroge, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+model+distinct+Vitamin+E+effects+at+different+stages+of+prostate+cancer+evolution.">Organoids model distinct Vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).</li><li>Godet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate-mapping+post-hypoxic+tumor+cells+reveals+a+ROS-resistant+phenotype+that+promotes+metastasis.">Fate-mapping post-hypoxic tumor cells reveals a ROS-resistant phenotype that promotes metastasis.</a> Nature Communications. 10 (1), 4862 (2019).</li><li>Letai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+precision+cancer+medicine-moving+beyond+pure+genomics.">Functional precision cancer medicine-moving beyond pure genomics.</a> Nature Medicine. 23 (9), 1028-1035 (2017).</li></ol>

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.

PDTO-screening med middels til høy gjennomstrømning er ofte avhengig av avlesninger som bare trekker ut en brøkdel av informasjonen som organoider potensielt kan gi. Det har blitt stadig tydeligere at for at den raskt utviklende organoidteknologien skal realisere større vitenskapelig og klinisk potensial, er det kritisk nødvendig med mer avanserte 3D-analyser, avlesninger og analysemetoder. Her beskrives en avansert screeningpipeline, som ikke bare øker reproduserbarheten, men også forbedrer den kliniske oversettbarheten betydelig ved å inkorporere en AI-drevet, levende celleavlesning. I tillegg til analyseprogramvare utviklet internt, implementeres bruken av normalisert legemiddelresponsmetrisk (NDR), noe som tydelig viser evnen til å definere pasientspesifikke forskjeller i behandlingsrespons6. 
Inkluderingen av denne normaliseringsmetrikken vil utvilsomt være av enorm verdi, og minner om at mange studier tar sikte på å avgrense behandlingsresponser basert på mindre forskjeller i areal under kurven (AUC) eller halv maksimal hemmende konsentrasjon (IC50) (da de fleste dose-responskurvene overlapper / ligger nær hverandre)11,12 . Vekstratemålinger er allerede implementert i organoide legemiddelscreeningsprotokoller ved bruk av ATP-basert analyse, men er avhengige av normalisering av referansebrønner lyset ved tidspunkt 04. I motsetning til dette tillater denne metoden intrabrønnveksthastighetsnormalisering, som ikke bare tar hensyn til interpatient forskjeller i PDTO-veksthastighet, men også interwellforskjeller som følge av variasjoner i såtetthet og plateplasseringsavhengige effekter for å øke reproduserbarheten. Videre tilpasset vi NDR for ytterligere å øke separasjonen av interpatient PDTO-respons ved å inkludere en positiv kontroll for normalisering 6,8.
Videre kan analysen, som er kompatibel med høy gjennomstrømning og automatiseringsformater, nøyaktig oppdage individuelle organoidresponser, noe som muliggjør kvantifisering av subklonal motstand - den viktigste drivkraften for tilbakefall og progresjon av svulster13. For eksempel, selv om PDAC052 og PDAC060 viste en god respons på behandlingen in vitro (basert på NDR), var den ekstra enkeltorganoidanalysen i stand til å oppdage en liten (større populasjon med PDAC060) populasjon av subkloner som ikke reagerer på behandlingen. Interessant nok korresponderte dette høyt med den kliniske observasjonen, gitt at PDAC052 og PDAC060 hadde en holdbar respons (ingen tumoraktivitet oppdaget), men til slutt ble begge diagnostisert med lokal tumorprogresjon (på grunn av tilstedeværelsen av resistente kloner). Sammenlignet med konvensjonelle 3D-avlesninger (ATP-basert analyse og størrelse / tall), forventes denne avanserte screeningrørledningen å øke den prediktive ytelsen ved å trekke ut mer klinisk relevant informasjon ut av disse "pasientene i laboratoriet". Denne hypotesen blir nå testet ved å screene kliniske PDTO-prøver i forfatternes laboratorium med denne metoden for å korrelere ex vivo med in vivo respons og klinisk utfall. 
For å få mer innsikt i mekanismene for en legemiddelrespons, er konvensjonelle fluorescerende levende celleavbildningsreagenser, i tillegg til cytotoksisitetsfarger, kompatible med denne metoden for å studere mekanismer for celledød. Vi har tidligere vist at denne metoden er forlikelig med Sartorius Caspase 3/7 Green Reagens for å studere caspaseavhengig induksjon av apoptose etter cisplatinbehandling8. Kompatibiliteten med andre fargestoffer for å studere oksidativt stress (CellROX-reagenser) eller hypoksi (Image-iT Hypoksi-reagenser) gjenstår å bli testet. Imidlertid har disse reagensene allerede blitt brukt i 3D in vitro-modeller 14,15.
Bildeanalyseprogramvaren er også kompatibel med andre plateformater eller dyrkingsmetoder (f.eks. Mikrokavitetsplater, ECM-kupler) hvis klare, fokuserte bilder av organoidene kan tas. Dette er ofte utfordrende for organoider dyrket i kupler siden de vokser i forskjellige z-plan, noe som krever z-stablingsfunksjonalitet i mikroskopet som ikke alltid er tilgjengelig. Derfor anbefaler vi bruk av flatbunns ULA 384-brønns mikroplater for å sikre bilder av tilstrekkelig kvalitet. 
I tillegg er analysen kompatibel med andre levende cellebildesystemer, som tidligere vist for fasekontrastbilder tatt med et IncuCyte ZOOM-system8. En begrensning av Spark Cyto live-cell imaging system som ble brukt i dette manuskriptet er en-plate kapasitet for kinetiske målinger. Spark Motion-utvidelsen øker imidlertid kapasiteten til opptil 40 mikroplater som kan screenes i bulk. Kompatibiliteten til programvaren som er utviklet internt, vil bli utvidet til disse og andre systemer for å tilby en plattformagnostisk løsning, med mål om å standardisere og automatisere bilde- og dataanalyserørledninger. Den nettbaserte applikasjonen vil også inkludere interaktive grafiske verktøy og automatiserte legemiddelmetriske beregninger, som vist i denne artikkelen, for å redusere manuell analysetid.
Den etikettfrie PDTO-segmenteringsalgoritmen ble trent og testet på forskjellige internt dyrkede sfæroid- og PDTO-modeller med forskjellige morfologiske forskjeller (solid, halvfast, cystisk), og kan følgelig oppdage disse med høy nøyaktighet8. En begrensning ved modellen er at inklusjon av cystiske PDTOer økte uønsket påvisning av bobler som var tilstede i brønnen etter såing. Inkubasjon over natten var imidlertid tilstrekkelig til å fjerne de fleste av disse boblene, noe som muliggjorde en kvalitativ tidspunkt 0-skanning. Nøyaktigheten av organoidbildesegmenteringen og metoden må valideres av andre brukere, og basert på deres tilbakemelding kan programvaren trenes videre for å oppnå en robust og automatisert bildeanalysealgoritme. I tillegg tar vi sikte på å oppnå flere kliniske data for å korrelere ex vivo-legemiddelresponsen kvantifisert med denne metoden til den kliniske responsen hos pasienten for å identifisere de beste parametrene for å forutsi terapirespons og videreutvikle denne metoden for funksjonell presisjonskreftmedisin16.

I de senere år har in vitro kreftmedisinforskning, narkotikascreening og grunnleggende forskning gått over fra bruk av tradisjonelle todimensjonale (2D) kreftmodeller med udødelige cellelinjer til mer fysiologisk relevante tredimensjonale (3D) kreftmodeller. Dette har ansporet adopsjonen av tumorsfæroider med etablerte kreftcellelinjer, som gjenskaper mer komplekse celle-til-celle-interaksjoner og strukturer som er tilstede i solide svulster. For tiden er pasientavledede tumororganoider (PDTOer) den mest avanserte og fysiologisk relevante 3D-kreftmodellen som er tilgjengelig for in vitro kreftforskning, da de gir ytterligere fordeler i forhold til tumorsfæroider, nemlig heterogeniteten som finnes hos kreftpasienter1. PDTOer er etablert fra tumorvev som stammer fra kreftpasienter, og beholder derfor både tumorfenotypen og genotypen. Som sådan blir PDTOer uvurderlige for grunnleggende og translasjonell kreftforskning og har potensial til å forbedre presisjonsonkologi2. 
Til tross for deres lovende potensial, er disse sofistikerte 3D in vitro kreftmodellene ofte underutnyttet på grunn av mangel på avanserte analysemetoder. Den mest brukte analysen bestemmer antall levedyktige celler i PDTO via kvantifisering av intracellulær ATP3. Disse analysene er normalt enkelttidspunkter, bulkanalyser, og overser dermed kritiske tidsavhengige svar og forsømmer klonale svar. Spesielt er evnen til å overvåke veksten av PDTOer (vekstrate) og deres respons på spesifikke terapier av høy interesse 4,5. Den normaliserte legemiddelresponsen (NDR), som scorer legemiddelrespons basert på vekstraten normalisert til en positiv (ctrl +) og negativ kontroll (ctrl-) tilstand, har også nylig blitt rapportert å være en avgjørende beregning for evaluering av kreftmedisinfølsomhet med cellebasert screening, selv om dette hovedsakelig ble gjort for 2D-cellelinjer6. Derfor er det behov for mer sofistikerte analysemetoder for å dra full nytte av disse mer klinisk representative og komplekse 3D-kreftmodellene. Mikroskopi regnes som en kraftig tilnærming for å studere kompleksiteten til disse organoidmodellene7.
Dette papiret beskriver en metode for overvåking av kinetiske legemiddelresponser i 3D-kreftmodeller, ved bruk av konvensjonelle vidvinkelmikroskoper og levende celleavbildningssystemer. Tilpasninger ble gjort til protokollen beskrevet av Driehuis et al.4 for å være kompatibel med automatisering ved hjelp av en pipetteringsrobot, digital medisindispenser og levende cellebildesystem for å øke reproduserbarheten og redusere antall "hands-on" arbeidstimer. Denne metoden tillater middels til høy gjennomstrømningsbehandling av både tumorsfæroider med etablerte kreftcellelinjer (se tilleggstabell S1 for testede cellelinjer), samt PDTOene, i et 384-brønns mikroplate og multiorganoidformat. Ved å bruke en konvolusjonell nettverksmaskinlæringsprosess kan automatisert identifikasjon og sporing av individuelle tumorsfæroider eller PDTOer utføres utelukkende fra brightfield-avbildning og uten bruk av fluorescerende levende cellemerkingsfarger8. Dette er svært fordelaktig, da de fleste identifikasjoner med brightfield-avbildning krever manuell merknad (som er arbeidskrevende og tidkrevende) eller krever tilsetning av fluorescerende fargestoffer, noe som kan forvirre legemiddelresponser relatert til fotoksisitetsindusert oksidativt stress9.
Den resulterende bildeanalyseprogramvaren som er utviklet internt, utvider funksjonaliteten til konvensjonelle levende cellebildesystemer, da 3D-bildeanalysemoduler enten ikke er tilgjengelige, plattformbegrensede eller ikke kompatible med 384-brønns mikroplater og helbrønnsavbildning. I tillegg er disse modulene ofte høyt priset og tilbyr begrensede bulkorganoidavlesninger. Derfor er denne metoden svært relevant for forskere som har tilgang til allment tilgjengelige levende celleavbildningssystemer og tar sikte på å trekke ut mer informasjon om en legemiddelrespons sammenlignet med gullstandarden, men rudimentær ATP-basert analyse. Med tillegg av spesifikke celledødsindikatorer kan cytostatiske legemiddelresponser skilles fra cytotoksiske responser, og dermed gi ytterligere innsikt i mekanistiske legemiddelhandlinger som for tiden er uoppnåelige fra enkeltpunktsanalyse. Endelig tillater levende celleavbildning individuell organoidsporing for å oppnå enkeltorganoide legemiddelresponsmålinger for å fange respons heterogenitet og identifisere potensielle resistente subkloner.
Målet med denne metoden og tilhørende bildeanalyseprogramvare er å implementere billig automatisering i organoid legemiddelscreening for å begrense brukerintervensjon og redusere variabilitet i håndtering, bildeanalyse og dataanalyse. For å gjøre denne programvaren tilgjengelig for forskere, er den mikroskop- og plattformagnostisk, og en skybasert applikasjon blir gjort tilgjengelig. Ved å støtte konvensjonelle levende celleavbildningssystemer, tar vi også sikte på å forbedre funksjonaliteten for 3D-dyrkingsapplikasjoner og analyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel p300 (GEN 2) pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom ULA microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4588</td>
			<td>minimum volume 50 &#181;L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom ULA Phenoplate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6057802</td>
			<td>minimum volume 75 &#181;L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A8301</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADF+++</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Advanced DMEM/F12, 1% GlutaMAX, 1% HEPES, 1% penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe easy sealing membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z380059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase 3/7 Green&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Slides for TC10/TC20</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1450017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td>ATP-assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler for 25 mL reservoir</td>
			<td>VWR (Diversified Biotech)</td>
			<td>490006-908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling element 12 x 8 x 3 cm</td>
			<td>Bol.com</td>
			<td>9200000107744702</td>
			<td>For custom microplate holder OT-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Organoid Harvesting Solution</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3700-100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2&#160;</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotox Green</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotox Red</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300e</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Digital drug dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300e Control v3.3.5</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Control software D300e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ADF+++ supplemented with 0.5 nM WNT surrogate-Fc-Fusion protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium, 4% Rpso3-Fc Fusion Protein conditioned medium, 1x B27, 1 mM N-acetyl cysteine (NAC), 5 mM nicotinamide, 500 nM A83-01, 100 ng/mL FGF10, and 10 nM Gastrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemcitabine</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) patient-derived organoids</td>
			<td>Biobank@uza (Antwerp, Belgium; ID: BE71030031000; Belgian Virtual Tumorbank funded by the National Cancer Plan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentrons App v6.0.1</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>OT-2 control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentrons Protocol Designer Tool</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>https://designer.opentrons.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbits data compression tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>www.orbits-oncology.com or contact corresponding author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbits image analysis webapp</td>
			<td>University of Antwerp</td>
			<td></td>
			<td>www.orbits-oncology.com or contact corresponding author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Pipetting robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipette 230 mm&#160;</td>
			<td>Novolab</td>
			<td>A33696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peniciline-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspo3-Fc Fusion Protein conditioned medium</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spark Cyto 600</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell imaging and multi-mode platereader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SparkControl v3.1</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Spark Cyto control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 25 mL reservoir</td>
			<td>VWR (Diversified Biotech)</td>
			<td>10141-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T8 plus cassette</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>233360010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT Surrogate-Fc-Fusion protein</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis

Pasientavledede tumororganoider (PDTOer) holder stort løfte om preklinisk og translasjonell forskning og forutsier pasientbehandlingsresponsen fra ex vivo-legemiddelscreeninger . Imidlertid fanger nåværende adenosintrifosfat (ATP) -baserte legemiddelscreeningsanalyser ikke kompleksiteten til en legemiddelrespons (cytostatisk eller cytotoksisk) og intratumor heterogenitet som har vist seg å bli beholdt i PDTOer på grunn av en bulkavlesning. Live-cell imaging er et kraftig verktøy for å overvinne dette problemet og visualisere narkotikaresponser mer grundig. Imidlertid er bildeanalyseprogramvare ofte ikke tilpasset tredimensjonaliteten til PDTOer, krever fluorescerende levedyktighetsfarger, eller er ikke kompatibel med et 384-brønns mikroplateformat. Dette papiret beskriver en halvautomatisk metodikk for å så, behandle og avbilde PDTOer i et format med høy gjennomstrømning, 384 brønner ved hjelp av konvensjonelle, bredfelte, levende cellebildesystemer. I tillegg utviklet vi programvare for levedyktighetsmarkørfri bildeanalyse for å kvantifisere veksthastighetsbaserte legemiddelresponsmålinger som forbedrer reproduserbarheten og korrigerer veksthastighetsvariasjoner mellom forskjellige PDTO-linjer. Ved å bruke den normaliserte legemiddelresponsmetrikken, som scorer legemiddelrespons basert på vekstraten normalisert til en positiv og negativ kontrolltilstand, og et fluorescerende celledødsfargestoff, kan cytotoksiske og cytostatiske legemiddelresponser lett skilles, noe som forbedrer klassifiseringen av respondere og ikke-respondere dypt. I tillegg kan heterogenitet av legemiddelrespons kvantifiseres fra enkeltorganoid legemiddelresponsanalyse for å identifisere potensielle, resistente kloner. Til syvende og sist tar denne metoden sikte på å forbedre prediksjonen av klinisk terapirespons ved å fange en multiparametrisk legemiddelresponssignatur, som inkluderer kinetisk vekstarrest og celledødskvantifisering.

Den automatiserte pipetteringsprotokollen sikrer en jevn fordeling av PDAC_060 PDTO-er i alle kolonnene i mikroplaten med 384 brønner (figur 2A). Som forventet ble det observert en variasjon i antall og middelareal for PDTOer mellom brønnene (figur 2A,B). Det totale overlevelsesområdet (totalt lystfeltområde - totalt grønt område) kombinerer den etikettfrie organoidsegmenteringen med det fluorescensbaserte celledødssignalet og er etter vår erfaring den mest robuste parameteren for å studere legemiddelrespons over tid (figur 2C)8. For å ta hensyn til variasjoner i cellesåing og organoidstørrelse, bør veksthastighetsbaserte beregninger brukes for å redusere variasjoner mellom replikasjoner, som vist ved de reduserte feilfeltene i figur 2D versus figur 2C, og en høyere Z-faktor som indikerer en sterkt forbedret legemiddelskjermkvalitet (figur 2E).
NDR-dose-respons-kurven (figur 2G), normalisert til ctrl- og ctrl+, er klart bedre enn GR-dose-responskurven (figur 2F), normalisert til ctrl-, da den øker separasjonen av legemiddelresponskurvene og mer nøyaktig representerer cytotoksiske legemiddelresponser. Et eksempel på de tilknyttede bildene for ctrl-, ctrl+ og 400 nM gemcitabin/80 nM paklitakselbehandlet PDTO er vist i figur 3. En interessant observasjon er at den cytotoksiske effekten av gemcitabin var dominerende i kombinasjonsbehandlingen, da det ikke ble observert noen merverdi av paklitaksel.
Deretter ble to ekstra PDTO-linjer, PDAC_052 og PDAC_087, brukt. En klar forskjell i vekstrate mellom disse linjene ble observert (figur 4A), som støtter bruken av GR-beregninger. Igjen resulterte NDR-dose-responskurver (figur 4C) i økt dynamisk område og separasjon mellom de tre forskjellige pasientene sammenlignet med GR-kurvene (figur 4B). Videre tillater protokollen bestemmelse av NDR over tid og viser at PDAC_052 og PDAC_060 hadde en svært lik cytostatisk legemiddelrespons på en lav dose gem-pac (figur 4D), mens en klar differensiell cytostatisk versus cytotoksisk respons kunne observeres for midten (figur 4E) og høye doser (figur 4F) av gem-pac. Disse legemiddelresponsene var i samsvar med den kliniske responsen som ble observert hos pasientene (figur 4G).
Endelig er en stor fordel med tilnærmingen og programvaren at enkeltorganoide legemiddelresponser kan kvantifiseres for å studere respons heterogenitet og identifisere potensielt resistente subkloner. Figur 5 gir en klar oversikt over den klonale dynamikken til de ulike pasientene og viser at PDAC-087 hadde de mest resistente subklonene etter behandling, noe som er forenlig med den aggressive og svært resistente sykdommen observert hos pasienten. Interessant nok var denne pasienten også minst følsom overfor ctrl+ staurosporin.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig01.jpg"> Figur 1: Oversikt over arbeidsflyt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig02v2.jpg"> Figur 2: Såingsnøyaktighet og legemiddelresponsmålinger . (A) Organoidtellinger/brønner av PDAC_060 PDTOer sådd i en 384-brønns mikroplate ved hjelp av pipetteringsroboten. Hver prikk representerer tellingen i en enkelt brønn, og plottene er atskilt med 384-brønns mikroplatekolonner. (B) Gjennomsnittlig PDTO-område/brønn. (C) Totalt overlevelsesareal (totalt lystfeltområde - totalt grønt område) og (D) vekstrate (totalt overlevelsesområde normalisert til T0 = 1) for PDAC_060 PDTOer behandlet med et 5: 1-forhold mellom gemcitabin / paklitaksel. (E) Z-faktor som målestokk for analysekvalitet. (F) Vekstrate-dose-responskurve normalisert til ctrl- og (G) normalisert legemiddelresponskurve normalisert til ctrl- og ctrl+. Feilfelt indikerer gjennomsnittlig ± SD for to brønner. Forkortelser: PDAC = pankreas duktalt adenokarsinom; PDTO = pasientavledet tumororganoid; GR = vekstrate; NDR = normalisert legemiddelrespons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig02largev2.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig03.jpg"> Figur 3: Eksempelbilder. Representative bilder av PDAC_060 PDTO behandlet med vehikkel (ctrl-), 400 nM gemcitabin/80 nM paklitaksel og 2 μM staurosporin (ctrl+). Den venstre kolonnen viser brightfield-bilder, den midterste kolonnen viser Cytotox Green fluorescerende signal, og høyre kolonne viser etikettfrie kommenterte brightfield-bilder ved hjelp av organoidanalysemodulen. Skala barer = 100 μm. Forkortelser: PDAC = pankreas duktalt adenokarsinom; PDTO = pasientavledet tumororganoid; GemPac = gemcitabin/paklitaksel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig04.jpg"> Figur 4: Sammenligning av interpatient legemiddelrespons . (A) Sammenligning av vekstrate (basert på totalt overlevelsesområde) for PDAC_052, PDAC_060 og PDAC_087 PDTO-linjer. (B) Veksthastighet-dose-responskurve normalisert til ctrl- og (C) normalisert legemiddelresponskurve normalisert til ctrl- og ctrl+. Kinetisk NDR av en (D) lav, (E) midtre og (F) høy dose gemcitabin/paklitaksel (forholdet 5:1). (G) PDAC-pasienters kliniske egenskaper. Feilfelt indikerer gjennomsnittlig ± SD for to brønner. Forkortelser: PDAC = pankreas duktalt adenokarsinom; PDTO = pasientavledet tumororganoid; GR = vekstrate; NDR = normalisert legemiddelrespons; FFX = folfirinox. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig04large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig05.jpg"> Figur 5: Enkle organoide beregninger. Enkeltorganoid doserespons basert på celledød (grønt område/lysfeltområde) og areal (lysfelt) på PDAC_052, PDAC_060 og PDAC_087 PDTOer behandlet med vehikkel (ctrl-), 400 nM gemcitabin/80 nM paklitaksel og 2 μM staurosporin (ctrl+). Grønne regioner indikerer levedyktige organoider; blå regioner indikerer x-as utvalg av GemPac og ctrl + tomter. Forkortelser: PDAC = pankreas duktalt adenokarsinom; PDTO = pasientavledet tumororganoid; GemPac = gemcitabin/paklitaksel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig05large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Cell suspensjon lager</td>
			<td>Celler/slipp</td>
			<td># Dråper (20 μL)</td>
			<td>Lager (1/3)</td>
			<td>ECM (2/3)</td>
		</tr><tr><td>1,13 × 107 celler/ml</td>
			<td>75,000</td>
			<td>10</td>
			<td>75 ul</td>
			<td>150 μL</td>
		</tr><tr><td>1,13 × 107 celler/ml</td>
			<td>75,000</td>
			<td>5</td>
			<td>40 ul</td>
			<td>80 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Fortynning for plating i ECM-kupler. Forkortelse: ECM = ekstracellulær matrise.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Sammensatt</td>
			<td>Lager konsentrasjon</td>
			<td>Fortynning</td>
			<td>Arbeidskonsentrasjon</td>
			<td>Løsemiddel</td>
			<td>Brønn konsentrasjon</td>
			<td>Kommentarer</td>
		</tr><tr><td>Cytotox Grønn</td>
			<td>1 mM (DMSO)</td>
			<td>1/10</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>60 nM</td>
			<td>Markør for celledød</td>
		</tr><tr><td>Cytotox rød</td>
			<td>1 mM (DMSO)</td>
			<td>1/10</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>250 nM</td>
			<td>Markør for celledød</td>
		</tr><tr><td>Caspase 3/7 Grønn</td>
			<td>5 mM (DMSO)</td>
			<td>1/2</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>2,5 μM</td>
			<td>Apoptotisk markør</td>
		</tr><tr><td>Hoechst</td>
			<td>20 mM (T2O)</td>
			<td>1/200</td>
			<td>100 μM</td>
			<td>0,33 % Tween/PBS</td>
			<td>50 nM</td>
			<td>Nukleær markør</td>
		</tr><tr><td>Staurosporin</td>
			<td>10 mM (DMSO)</td>
			<td>/</td>
			<td>1 - 10 mM</td>
			<td>/</td>
			<td>2 – 5 mikrometer</td>
			<td>Positiv kontroll</td>
		</tr><tr><td>Gemcitabin</td>
			<td>10 mM (DMSO)</td>
			<td>/</td>
			<td>1 - 10 mM</td>
			<td>/</td>
			<td>Titrering</td>
			<td>Kjemoterapi</td>
		</tr><tr><td>Paklitaksel</td>
			<td>10 mM (DMSO)</td>
			<td>/</td>
			<td>1 - 10 mM</td>
			<td>/</td>
			<td>Titrering</td>
			<td>Kjemoterapi</td>
		</tr><tr><td>Cisplatin</td>
			<td>5 mM (0,9 % NaCl)</td>
			<td>1/2</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td>0,6% Tween/PBS</td>
			<td>Titrering</td>
			<td>Kjemoterapi</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 2: Eksempel på fortynning av ofte brukte legemidler og fluorescerende reagenser. Hver forbindelse må oppløses i enten 100% DMSO eller 0,3% Tween / PBS.
Supplerende tabell S1: Oversikt over kompatible kreftcellelinjer. Statisk: sfæroider er ikke trekkende. Slå sammen: sfæroider migrerer mot hverandre og smelter sammen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434_SuppTableS1%20(1).xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 1: Organoid såløsning beregningsverktøy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%201.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 2: STL-fil for 3D-utskrift tilpasset labware 'Microplate Holder'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%202.stl" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 3: STL-fil for 3D-utskrift tilpasset labware '2 x 25 ml reservoarholder'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%203.stl" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 4: JSON-fil for tilpasset labware pipetteringsrobot 'Microplate Holder'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%204.json" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 5: JSON-fil for tilpasset labware pipetteringsrobot '2 x 25 ml reservoar Holder_WithCooler'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%205.json" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 6: JSON-fil for pipetteringsrobotprotokoll 'Plating_ PDO_384well_Cooled_Row2-23'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%206.json" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 7: Oversikt over oppsettet av pipetteringsrobotskrivebordet. (A) Kjøleelementer og (B) reservoar og mikroplate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%207.png" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 8: TDD-fil for protokoll for den digitale legemiddeldispenseren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%208.tdd" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 9: XML-fil for protokoll av live-cell imager for brightfield og fluorescens imaging. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%209.xml" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 10: Eksempel på platekart. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2010.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 11: Eksempel på inndatafil for NDR R-skript. Forkortelse: NDR = normalisert legemiddelrespons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2011.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 12: Normalisert legemiddelrespons NDR R-skript. Forkortelse: NDR = normalisert legemiddelrespons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2012.R" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 13: Eksempel utdatafil med NDR R-skript GR-verdier. Forkortelser: GR = vekstrate; NDR = normalisert legemiddelrespons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2013.csv" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 14: Eksempel utdatafil av NDR R-skript med GR-verdier transponert. Forkortelser: GR = vekstrate; NDR = normalisert legemiddelrespons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2014.csv" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplementary File 15: Eksempel utdatafil av NDR R script NDR-verdier. Forkortelse: NDR = normalisert legemiddelrespons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2015.csv" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 16: Eksempel utdatafil av NDR R-skript med NDR-verdier transponert. Forkortelse: NDR = normalisert legemiddelrespons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2016.csv" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis at JoVE.com

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Denne protokollen beskriver en semi-automatisert metode for middels til høy gjennomstrømning organoid narkotika screenings og mikroskop-agnostisk, automatisert bildeanalyse programvare for å kvantifisere og visualisere multiparametriske, single-organoid narkotika responser for å fange intratumor heterogenitet.

Multiparametrisk tumor organoid narkotika screening ved hjelp av Widefield Live-Cell Imaging for bulk og single-organoid analyse

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Denne protokollen vil tillate forskere å ikke bare strømlinjeforme analyserørledningen, men det vil også tillate dem å trekke ut mer informasjon ut av deres organoide strøm, og dermed øke translasjonsrelevansen. Den største fordelen med denne protokollen er at den kombinerer en strømlinjeformet arbeidsflyt med en automatisert og klinisk relevant analyserørledning, slik at forskere kan få en overbevisende mengde informasjon ut av en enkelt organoidskjerm. Denne teknikken kan brukes til å forutsi klinisk terapirespons for kreftpasienter fra disse ex vivo organoid narkotika screenings med svært lovende tidlige resultater.Målet er å gjøre programvareplattformen agnostisk slik at forskerne kan bruke et levende cellebildeinstrument som er tilgjengelig for dem. Begynn med enzymatisk dissosiasjon av pasientavledede tumororganoider, eller PDTOer, i den ekstracellulære matrisen, eller ECM, kupler i seksbrønnsmikroplaten. For dette må du først aspirere mediet, og vaske ECM-kuplene en gang med PBS.Deretter legger du til to milliliter av dissosiasjonsenzymet i brønnen. Pipetter innholdet opp og ned 10 ganger ved hjelp av en milliliter pipette for å mekanisk dissosiere organoidene i kuplene før du inkuberer platen i 10 minutter ved 37 grader Celsius. Etter inkubasjon, pipetter innholdet opp og ned, og sjekk for riktig dissosiasjon av organoider til enkeltceller ved hjelp av et mikroskop.Samle cellesuspensjonen i et 15 milliliter rør, og gjør volumet opp til 10 milliliter ved å legge ADF + Sentrifuge røret ved 450 g i fem minutter ved romtemperatur, og aspirere supernatanten ved hjelp av en Pasteur pipette og sugepumpe. Resuspend pelleten i 100 til 200 mikroliter av hele bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom, eller PDAC, organoid kulturmedium avhengig av pelletens størrelse før du teller antall celler ved hjelp av en valgt metode. For å plate enkeltcellene i ECM-kupler, fortynn riktig mengde cellesuspensjon ved å legge til den nødvendige mengden tint ECM.Deretter pipetter opp til 10 20-mikroliter dråper per brønn i en seks-brønns plate forvarmet til 37 grader Celsius. Inverter platen og inkuber i 30 minutter ved 37 grader Celsius. Deretter legger du brønnene med hele mediet supplert med 10-mikromolar Y-27632, og inkuberer i to til tre dager i en inkubator.For å høste de to til tre dager gamle organoidene, aspirer først mediet og vask organoidene en gang med PBS. Deretter legger du til en til to milliliter organoidhøstingsløsning, forkjølt til fire grader Celsius, til en brønn på seksbrønnsplaten, avhengig av antall ECM-kupler. Inkuber platen som holdes på is, på en ristingsplattform i 10 minutter.Dissosierer nå ECM-kuplene ved å pipettere innholdet i brønnene opp og ned med en milliliterpipette. Inkuber organoidene igjen i 10 minutter på is før du visuelt bekrefter dissosiasjonen av ECM-kuplene under et mikroskop. Samle organoider i et 15 milliliter rør, forhåndsbelagt med 0,1% BSA i PBS, og gjør opp volumet til 10 milliliter ved å legge ADF + Sentrifuge røret ved 200 g i fem minutter ved fire grader Celsius.Deretter aspirerer supernatanten, og resuspenderer pelleten avhengig av størrelsen i opptil en milliliter fullt PDAC-organoidmedium til ønsket endelig organoidkonsentrasjon. Åpne pipetteringsrobotkontrollprogrammet, velg Protokoller, og klikk på Importer før du drar og slipper den medfølgende tilleggsfilen 6 i det angitte feltet. Velg den importerte protokollen.Og i henhold til oppsettet som vises i Deck Setup-feltet, plasser alt laboratoriet, inkludert kjøleelementer og plastvarer, i dekkene. Bruk venstre spor for 25 milliliter reservoar og kjøleelement. Deretter klikker du på Kjør protokoll og fortsetter til oppsett.Åpne kategorien Labware Setup, klikk på Run Labware Position Check, og følg instruksjonene for å kalibrere pipetteringsroboten til den nye maskinvaren. Fyll 25 milliliter reservoaret, plassert på toppen av kjøleelementet, med den avkjølte organoidsåløsningen, og klikk Start Run for å sette pipetteringsroboten i aksjon. Sentrifuger deretter mikroplaten med en hastighet på 100 g i ett minutt ved fire grader Celsius.For å lage medisindispenseringsprotokollen ved hjelp av den digitale programvaren for kontroll av legemiddeldispenser, hold musepekeren over plate 1 over plateoppsettet. Velg Rediger plateattributter, og fyll ut platetypen som 384 brønn, tilleggsvolumet som 50 mikroliter, og DMSO-grensen som 1% Legg til væsker ved å klikke på tilleggsknappen ved siden av Væsker, og dobbeltklikk på den nyopprettede væsken for å gi den navn. Velg deretter klassen som DMSO-basert eller vandig pluss Tween 20, og fyll ut konsentrasjonen.For å lage plateoppsettet for legemiddeltitrering, velg Wells og klikk på Titrering. For væske, velg stoffet av interesse, sammen med ønsket høyeste konsentrasjon og laveste konsentrasjon. For replikasjoner velger du minimum to og velger ønsket titreringsmønster.For å lage plateoppsettet for den positive kontrollen, velg tre brønner, klikk på Angi verdi og fyll ut to-mikromolar staurosporin fra en 10 millimolar bestand i DMSO for å indusere maksimal celledød. For Cytotox Green, velg alle brukte brønner, klikk på Angi verdi, og skriv inn en verdi på 60 nanomolar per brønn. For negativ kontroll og DMSO-normalisering, velg alle brønnene med ytterligere fire brønner for kjøretøykontrollen.Høyreklikk nå og velg Normalisering før du tilordner normalisert væskeklasse som DMSO-basert. Normaliser deretter til det høyeste klassevolumet for å oppnå en lik DMSO-konsentrasjon i hver brønn. Deretter klikker du på pilen under Kjør øverst til venstre, og velger Simuler alltid, etterfulgt av å klikke på Simuler for å identifisere eventuelle feil og få volumene av hvert legemiddel som skal forberedes.Fjern merket for Simuler alltid under Kjør-knappen før du klikker på Kjør for å starte legemiddeldispenseringsprotokollen, og følg instruksjonene. Påfør tetningsmembranen på mikroplaten for å forhindre fordampning. Åpne programvaren for live-cell imager-kontroll, og velg Method Editor New før du går til File for å importere XML-filen for eksempelmetoden.Alternativt kan du følge instruksjonene i manuskriptet for å opprette en ny fil. Klikk deretter på Start for å starte skanningen ved T0.To slå sammen og komprimere dataene, opprett en ny overordnet mappe for overføring av alle de individuelle eksperimentmappene som genereres for hver skanning på hvert tidspunkt av live-cell imager-kontrollprogramvaren, og navngi de respektive mappene ved å følge instruksjonene gitt i manuskriptet. Forbered et XLSX-platekart i den digitale programvaren for legemiddeldispenserkontroll ved å høyreklikke på platekartoppsettet fra legemiddeldispenserprotokollen og kopiere alle brønnene for å lime inn dataene i en XLSX-fil.Fjern Cytotox Green og staurosporin data, legg til en matrise for cellelinje, og skriv inn en negativ kontroll og positiv kontroll. Åpne datakomprimeringsverktøyet. Klikk på Søk, velg den overordnede mappen, og klikk på Komprimer for å starte komprimering av bildedata.Alle TIFF-bildefilene komprimeres til en enkelt HDF5 for hver brønn i en ny datasettmappe i foreldremappen. For å analysere bildene, gå til bildeanalysens webappplattform, logg inn og klikk på Legg til nytt prosjekt i Hjem-fanen. Skriv inn prosjektnavnet, trykk på Fortsett, og velg Legg til nytt eksperiment før du laster opp datasettmappen som inneholder HDF5-filene.Etter opplasting, gå til prosjekt- og eksperimentmappen for å klikke på Last opp platekart for flere funksjoner. Klikk deretter sekvensielt på Kjør analyse, velg Multi-Organoid Analysis, Default Parameters og til slutt Analyze for å starte bildeanalyse. Klikk på Last ned resultater for å laste ned rådatatabellene, som inneholder målingene for hver brønn og de segmenterte bildene eller videoene før du bekrefter nøyaktigheten av analysen for videre databehandling.For å ta hensyn til variasjonene i organoid såingstetthet og størrelse, ble veksthastighetsbaserte beregninger brukt til å redusere variasjoner mellom replikaene, som indikert av de reduserte feillinjene. Bildene for den negative kontrollen, den positive kontrollen og den kombinerte gemcitabin- og paklitakselbehandlede PDTO viste at terapien hovedsakelig induserte vekststans med en begrenset mengde celledød, tilsvarende normalisert legemiddelrespons, eller NDR, verdi like under null. Ved bruk av to ekstra linjer, PDAC_052 og PDAC_087, ble det observert en klar forskjell i veksthastighet mellom de tre linjene, noe som støttet bruken av GR-beregninger.NDR-dose-responskurvene resulterte i et økt dynamisk område og separasjon mellom de tre forskjellige pasientene, sammenlignet med GR-kurvene. Bestemmelse av NDR over tid viste at PDAC_052 og PDAC_060 hadde en svært lik cytostatisk legemiddelrespons på en lav dose gemcitabin-paklitaksel, mens en klar differensiell cytostatisk versus cytotoksisk respons kunne observeres for tilsvarende midtre og høye doser. Disse legemiddelresponsene var i samsvar med den kliniske responsen som ble observert hos pasientene.Den klonale dynamikken viste at PDAC_087 hadde de mest resistente subklonene etter behandling, noe som er i samsvar med sykdommens aggressive natur observert hos pasienten, som interessant nok også var minst følsom overfor den positive kontrollstaurosporin. Det viktigste aspektet ved protokollen er å holde alle løsningene som inneholder ECM avkjølt under såingen fordi feil størkning av ECM kan forstyrre nedstrøms bildeanalyse. Automatiseringen av våtlaboratoriearbeidet, bildeanalysen og nedstrøms databehandling kan være nyttig for å akselerere forskningen og identifisere nye kombinasjonsbehandlinger lettere.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Enkel og rask metode å få høy kvalitet svulst DNA fra klinisk-patologisk prøver bruker Touch forlaget cytologi

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuklidenes-fluorescens Reporter genet å spore svulst progresjon i gnager svulst modeller

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generering av høy gjennomstrømming tredimensjonale svulst Spheroids for narkotikarelaterte Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging analyser studie Glioblastoma hjerne svulst stamcelleforskningen migrasjon og invasjon

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

Analyse av kreft cellen invasjon og anti-metastatisk narkotikarelaterte Screening bruker Hydrogel mikro-kammer Array (HMCA)-baserte plater

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

En enkel overføring/invasjonen arbeidsflyt ved hjelp av en automatisert Live-celle-Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Etablering og karakterisering av små tarm Nevroendokrine tumor Spheroids

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

En roman Stromal Fibroblast-Modulert 3D Tumor Sfæroid Modell for å studere tumor-Stroma interaksjon og narkotika oppdagelse

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Narkotikascreening av primær pasient avledet tumor xenografts i sebrafisk

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...