Name: multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis
Uploaded: 2022-12-23T13:50:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis at JoVE.com

En del av denna forskning finansierades av donationer från olika givare, inklusive Dedert Schilde vzw och Willy Floren. Detta arbete finansieras delvis av den flamländska forskningsstiftelsen, 12S9221N (A.L.), G044420N (S.V., A.L., T.EX.), 1S27021N (M.L.), och av Industrial Research Fund vid Antwerpens universitet, PS ID 45151 (S.V., A.L., C.D.). Figur 1 skapades med BioRender.com.

Humant pankreasduktalt adenokarcinom (PDAC) patient-härledda organoider användes. Vävnadsresektionsfragment erhölls från patienter som genomgick botande kirurgi vid Antwerpens universitetssjukhus. Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla patienter och studien godkändes av UZA:s etiska kommitté (ref. 14/47/480). Detaljer relaterade till alla material, reagenser, utrustning och programvara som används i detta protokoll finns i materialförteckningen. En översikt över arbetsflödet visas i figur 1. Exempeldata tillhandahålls i det kompletterande materialet för att reproducera protokollet.
1. Dag 0: Beredning av 2- eller 3-dagars gamla organoider
<ol><li>Förvärm mikroplattorna vid 37 °C över natten och tina den extracellulära matrisen (ECM) vid 4 °C.</li>
	<li>Förbered fullt PDAC-organoidodlingsmedium: komplettera ADF +++ (Advanced DMEM / F12, 1% glutamintillskott, 1% HEPES och 1% penicillin / streptomycin) med 0,5 nM WNT-surrogat-Fc-Fusion-protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein konditionerat medium, 4% Rpso3-Fc Fusion Protein konditionerat medium, 1x B27, 1 mM N-acetylcystein (NAC), 5 mM nikotinamid, 500 nM A83-01, 100 ng / ml FGF10 och 10 nM Gastrin).</li>
	<li>Upprätta PDTO: erna enligt den valda metoden. OBS: Ett detaljerat protokoll tillhandahålls av Driehuis et al., som beskriver den konventionella metoden för att etablera, odla och passera PDTOs i ECM-kupoler4.</li>
	<li>Enzymatiskt dissociera organoiderna i ECM-kupoler.<ol><li>Aspirera mediet och tvätta 1x med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Tillsätt dissociationsenzym (t.ex. 2 ml i en 6-brunns mikroplatta) och pipett upp och ner 10x med en 1 ml pipett för att mekaniskt dissociera organoiderna och ECM-kupolerna.</li>
		<li>Inkubera i 10 minuter vid 37 °C, pipettera upp och ner och kontrollera om organoiderna är dissocierade till enstaka celler. Upprepa detta steg om det behövs.</li>
		<li>Samla cellsuspensionen i ett 15 ml rör, tillsätt ADF+++ till en volym av 10 ml, centrifugera i 5 min vid 450 × g vid rumstemperatur och aspirera supernatanten med en Pasteur-pipett och sugpump.</li>
		<li>Återsuspendera pelleten i 100-200 μL fullt medium beroende på pelletens storlek och räkna antalet celler med den valda metoden. Till exempel: blanda 10 μL av cellsuspensionen + 10 μL av Trypan Blue och räkna med en automatiserad cellräknare.</li>
	</ol></li>
	<li>Platta enstaka celler i ECM-kupoler.<ol><li>Späd cellsuspensionen och tillsätt 2/3 ECM enligt tabell 1. Pipettera upp till tio 20 μL droppar per brunn i en förvärmd 6-brunnsplatta. Vänd upp och ned på plattan och inkubera i 30 minuter vid 37 °C.</li>
		<li>Överlägg med fullt medium kompletterat med 10 μM Y-27632 och inkubera i 2-3 dagar i en inkubator. OBS: Tio kupoler som innehåller 75 000 celler vardera räcker vanligtvis för att fylla en 384-brunns mikroplatta i en koncentration av 200 organoider / brunn, exklusive brunnarna i kanten.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Dag 2 - 3: Skörd och frö 2- eller 3-dagars gamla organoider
<ol><li>Samla intakta organoider från ECM-kupolerna. OBS: Organoider tenderar att hålla sig till plastytor (t.ex. rör, pipettspetsar). För att undvika detta kan plastvaror försköljas med en 0,1% bovint serumalbumin (BSA) / PBS-lösning.<ol><li>Aspirera mediet och tvätta 1x med PBS. Tillsätt 1-2 ml kall (4 °C) organoid skördelösning till en 6-brunnsplatta beroende på antalet ECM-kupoler och inkubera på is på en skakplattform i 10 min.</li>
		<li>Pipettera upp och ner med en 1 ml pipett för att dissociera ECM-kupolerna, inkubera i ytterligare 10 minuter på is och visuellt kontrollera under ett mikroskop om ECM är dissocierad.</li>
		<li>Valfritt: Om en mer enhetlig storleksfördelning föredras, filtrera suspensionen genom en 70 μm cellsil före centrifugering.</li>
		<li>Samla organoiderna i ett 15 ml rör förbelagt med 0,1 % BSA/PBS, tillsätt ADF+++ upp till 10 ml och centrifugera i 5 minuter vid 200 × g vid 4 °C. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i upp till 1 000 μL fullt PDAC-organoidmedium beroende på pelletens storlek för att erhålla en koncentration av >6 000 organoider/ml.</li>
		<li>Räkna organoiderna med valfri räknemetod, helst en bildbaserad.</li>
	</ol></li>
	<li>Frö organoiderna. OBS: Se materialförteckningen för minsta volym / brunn för två olika typer av 384-brunns mikroplattor som används i detta protokoll.<ol><li>Förkyl alla plastvaror vid -20 °C eller på is i minst 20 minuter före användning för att undvika stelning av ECM.</li>
		<li>Bered såddlösningen från 1 ml organoid stamlösning (steg 2.1.6) med fullt medium till frö ~ 200 organoider per brunn i 50 μl, den minsta volym som används för att fylla en brunn. Använd tilläggsfil 1 för att beräkna mängden organoid såddlösning. Tillsätt en restvolym på 1 500 μl när du använder en 25 ml behållare och flerkanalig pipett eller pipettrobot.</li>
		<li>Frö organoiderna med hjälp av en pipetteringsrobot. OBS: Både såddlösningen och mikroplattan måste kylas vid 4 °C under pipettering för att undvika stelning av ECM. Därför 3D-printades en 25 ml behållare och mikroplatthållare för att användas i kombination med pipettroboten som kan hålla kylelement som anges i materialförteckningen. STL-filer för 3D-utskrift av anpassade labware (Supplementary File 2 och Supplementary File 3) och anpassade labware JSON-filer för pipettingroboten (Supplementary File 4 och Supplementary File 5) tillhandahålls.<ol><li>Designa dispenseringsprotokollet med hjälp av protokolldesignerverktyget online. Ett exempel på JSON-fil (tilläggsfil 6) tillhandahålls, där den anpassade labware redan har lästs in och en åttakanals p300 (Gen2) pipett med motsvarande pipettspetsar används.</li>
			<li>Öppna pipetteringsrobotkontrollappen, välj protokoll, klicka på Importera och dra och släpp kompletterande fil 6 i det angivna fältet.</li>
			<li>Välj det importerade protokollet och placera alla labbartiklar, inklusive kylelement och plastvaror, i däcken enligt layouten som visas i fältet Däckinställningar . Använd den vänstra platsen för 25 ml behållaren och kylelementet som visas i tilläggsfil 7.</li>
			<li>Klicka på Kör protokoll och fortsätt till installationen. Öppna fliken Labware Setup, klicka på Kör Labware Position Check och följ instruktionerna för att kalibrera pipetteringsroboten till den nya hårdvaran. Labware-förskjutningsdata kan lagras för senare, men vi rekommenderar att du kör labware-positionskontrollen före varje körning.</li>
			<li>Fyll 25 ml behållaren (placerad ovanpå kylelementet) med den kylda organoidsåddlösningen och klicka på Starta körning. OBS: De övre och nedre brunnarna fylls också med organoid suspensionslösning på grund av användningen av åttakanalspipetten.</li>
			<li>Centrifugera mikroplattan i 1 min vid 100 × g vid 4 °C.</li>
			<li>Inkubera vid 37 °C i minst 30 minuter.</li>
			<li>Fyll de yttre tomma brunnarna med minst 50 μLH2Oför att undvika avdunstning.</li>
			<li>Inkubera vid 37 °C över natten för att ta bort eventuella bubblor i brunnen som kan störa bildanalysen.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. Dag 4: Läkemedelsbehandling och reagensdispensering med digital läkemedelsdispenser
<ol><li>Skapa läkemedelsdispenseringsprotokollet med hjälp av den digitala läkemedelsdispenserkontrollprogramvaran.<ol><li>Håll muspekaren över platta 1 ovanför plattlayouten, välj redigera plattattribut och fyll i platttyp: 384 brunn, ytterligare volym (μL): 50 och DMSO-gräns (%): 1.</li>
		<li>Tillsätt vätskor genom att klicka på + -knappen bredvid Vätskor. Dubbelklicka på den nyskapade vätskan och namnge den; välj klass (DMSO-baserad eller vattenhaltig+Tween 20) och koncentration. OBS: Alla läkemedel och reagenser måste lösas i 100% DMSO eller 0,3% Tween-20. En 1-10 mM stamlösning kan användas, med hänsyn till en maximal DMSO-koncentration på <1%. Tabell 2 ger exempel på de utspädningar som krävs för vanliga fluorescerande reagenser och terapier.</li>
		<li>Plattans layout<ol><li>För läkemedelstitrering, välj brunnar och klicka på Titrering. För vätska, välj det intressanta läkemedlet, välj den högsta koncentrationen (t.ex. 2 000 nM) och den lägsta koncentrationen (t.ex. 10 nM); För replikat väljer du minst 2 och väljer önskat titreringsmönster. OBS: Titreringsmönstret beror på många faktorer, inklusive hur mycket förening som ska passas i en enda platta, om brunnarna ska randomiseras och antalet replikat och kontroller.</li>
			<li>För den positiva kontrollen, välj tre brunnar, klicka på Ange värde och fyll i 2 μM staurosporin från 10 mM lager i DMSO, vilket kommer att inducera maximal celldöd.</li>
			<li>För Cytotox Green, välj alla använda brunnar, klicka på Ange värde och ange 60 nM / brunn. OBS: Cytotox Green fluorescerande färgning indikerar celler som har dött och kommer därför inte att störa läkemedelsresponsövervakningen. Här krävs ingen fluorescerande markör för levande celler.</li>
			<li>För den negativa kontrollen och DMSO-normaliseringen, välj alla brunnar med ytterligare fyra brunnar för fordonskontrollen, högerklicka, välj normalisering, välj normalisera vätskeklass: DMSO-baserad och normalisera till högsta klassvolym för att få en lika DMSO-koncentration i varje brunn. OBS: DMSO-koncentrationerna bör vara <1%. Ett exempel på TDD-läkemedelstitreringsfil (tilläggsfil 8) tillhandahålls.</li>
			<li>Klicka på pilen under Kör i det övre vänstra hörnet, välj Simulera alltid och klicka på Simulera för att identifiera eventuella fel och få volymerna för varje läkemedel som ska förberedas. OBS: För att övervinna en varning när den ursprungliga doseringsvolymen är för låg, "Dispensera varningsbrunn på 30 nL eller högre rekommenderas för varje vätska på varje platta", välj två brunnar på kanten som är fyllda med vatten, välj Ange värde och ange 10 μM av läkemedlet för vilket varningen inträffar. Detta primerar läkemedelspatronen med en volym högre än 30 nL. Samma brunnar kan användas för att prima DMSO-patronen genom att ställa in en normalisering till % av det totala volymvärdet (t.ex. 0,5%).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Avmarkera Simulera alltid under knappen Kör ; klicka på Kör för att starta läkemedelsdispenseringsprotokollet och följ instruktionerna.</li>
	<li>Applicera tätningsmembranet på mikroplattan för att förhindra avdunstning.</li>
	<li>Inkubera Cytotox Green-färgämnet 1-2 timmar vid 37 °C i inkubatorn och fortsätt till steg 4.</li>
</ol>4. Skaffa bilder med live-cell imager
OBS: För tillväxthastigheten och NDR måste en skanning vid tidpunkt 0 (T0 = starta behandlingen) förvärvas 1-2 timmar efter tillsats av Cytotox Green.
<ol><li>Öppna kontrollprogramvaran för live-cell imager, välj Method Editor New, gå till filen > importera och välj exempelmetoden XML-fil (Supplementary File 9). Du kan också skapa en ny fil och välja Plåt: (CORE384fb_OpticalImaging) - Corning 384 Flat Black (Corning #4588), Inget lock och Ingen fuktighetskassett; Ansökan: Endast bilder; Mål: 4x; Mönster: Central; Kontrollera kanalerna Brightfield och Green (Led-intensitet (%) = 40; Exponeringstid (ms) = 200). OBS: De gröna kanalinställningarna fungerar bra för en koncentration av 60 nM Cytotox Green. Alternativet Live viewer kan användas för att justera fokusförskjutningen och / eller led-inställningarna i realtid.</li>
	<li>Klicka på Start för att starta skanning på T0.</li>
	<li>Upprepa skanningen var 24: e timme i upp till 5 dagar med samma metod. Alternativt, för att köra timelapse-mätningen automatiskt, justera metoden i live-cell imager Control-programvaran till ett kinetiskt experiment genom att klicka och dra fliken Kinetic Loop till metodfältet . På samma sätt måste flikarna Temperatur och Gas dras in i metodfältet för att ställa in systemet på 37 °C och 5 %CO2 för att säkerställa de korrekta förhållandena i den levande cellavbildningen under experimentet.</li>
</ol>5. Bild- och dataanalys
<ol><li>Slå samman och komprimera data<ol><li>Live-cell imager Control-programvaran genererar en mapp för varje skanning vid varje tidpunkt. Skapa en ny mapp, kopiera de enskilda experimentmapparna till den nya överordnade mappen och lägg till _0h, _24h, _48h, _72h, _96h och _120h i motsvarande experimentmappnamn.</li>
		<li>Förbered en XLSX-plattkarta från den digitala läkemedelsdispenserkontrollprogramvaran genom att högerklicka på plattkartlayouten från läkemedelsdispenseringsprotokollet och kopiera alla brunnar; klistra in data i en XLSX-fil. Ta bort Cytotox Green och staurosporin data och lägg till en matris för CelLine och Replicate. Ange ctrl- och ctrl+. Se Tilläggsfil 10 för ett exempel på plattkarta.</li>
		<li>Öppna datakomprimeringsverktyget, klicka på Bläddra, välj den överordnade mappen och klicka på Kör för att initiera bilddatakomprimering. Alla TIFF-bildfiler för de olika tidpunkterna komprimeras till en enda HDF5 för varje brunn i en ny datauppsättningsmapp i föräldramappen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bildanalys<ol><li>Gå till webbappplattformen för bildanalys, logga in och klicka på Lägg till nytt projekt på fliken Start . Ange projektnamnet, fortsätt, välj Lägg till nytt experiment och ladda upp mappen datauppsättningar som innehåller HDF5-filerna.</li>
		<li>Efter uppladdning, gå till projekt- och experimentmappen och klicka på Ladda upp plattkarta för ytterligare funktioner. Klicka på Kör analys, välj Multi-Organoid-analys, Standardparametrar och klicka på Analysera för att initiera bildanalys.</li>
		<li>Klicka på Ladda ner resultat för att ladda ner rådatatabellerna som innehåller mätningarna för varje brunn (t.ex. totalt ljusfältområde, totalt fluorescensgrönt område etc.) och de segmenterade bilderna / videorna för att bekräfta analysens noggrannhet och ytterligare databehandling.</li>
	</ol></li>
	<li>Tillväxthastighetsbaserade läkemedelsresponsmått och normaliserad läkemedelsrespons<ol><li>Välj Raw_NDR.xlsx-filen från resultatmappen (plattmappning krävs) (Tilläggsfil 11) och ladda in den i Official_NDR_7point R-skriptet (Tilläggsfil 12) för att automatiskt generera GR (normaliserad till ctrl-) och NDR (normaliserad till ctrl- och ctrl+) värdetabeller (Tilläggsfil 13, Tilläggsfil 14, Tilläggsfil 15 och Tilläggsfil 16 ). GR- och NDR-värden beräknas utifrån parametern som visas i ekvation (1) med hjälp av R-skriptet (tilläggsfil 12). Total överlevnadsyta = Totalt Brightfield-område - Totalt grönt område (1) Där 0 < NDR <1 = cytostatisk effekt (tillväxtstopp) och NDR < 0 = cytotoxiskt svar (celldöd). OBS: R-skriptet anpassades från Gupta et al.6.</li>
		<li>Från clonal_data.xlsx tabellen hämtar du svarsdata för en organoid och plottar dem som ett bubbeldiagram.</li>
		<li>Använd Z-faktor10 för att bedöma läkemedelsskärmskvaliteten för en körning (se ekvation (2)). Kassera ett experiment med en Z-faktor < 0,5. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64434/64434eq01.jpg" style="margin: auto;">(2)</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Veninga, V., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+organoids:+Opportunities+and+challenges+to+guide+precision+medicine.">Tumor organoids: Opportunities and challenges to guide precision medicine.</a> Cancer Cell. 39 (9), 1190-1201 (2021).</li><li>Le Compte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+as+individual+patient+models+for+chemoradiation+response+prediction+in+gastrointestinal+malignancies.">Patient-derived organoids as individual patient models for chemoradiation response prediction in gastrointestinal malignancies.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 157, 103190 (2021).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li><li>Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+inhibition+metrics+correct+for+confounders+in+measuring+sensitivity+to+cancer+drugs.">Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs.</a> Nature Methods. 13 (6), 521-527 (2016).</li><li>Gupta, A., Gautam, P., Wennerberg, K., Aittokallio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+normalized+drug+response+metric+improves+accuracy+and+consistency+of+anticancer+drug+sensitivity+quantification+in+cell-based+screening.">A normalized drug response metric improves accuracy and consistency of anticancer drug sensitivity quantification in cell-based screening.</a> Communications Biology. 3 (1), 42 (2020).</li><li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+organoids:+a+bright+future+ahead.">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li><li>Deben, C., Cardenas, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrBITS:+label-free+and+time-lapse+monitoring+of+patient+derived+organoids+for+advanced+drug+screening.">OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening.</a> Cellular Oncology. , (2022).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> Bioessays. 39 (8), (2017).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Engel, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+colorectal+cancer+organoids+upregulate+revival+stem+cell+marker+genes+following+chemotherapeutic+treatment.">Patient-derived colorectal cancer organoids upregulate revival stem cell marker genes following chemotherapeutic treatment.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (1), 128 (2020).</li><li>Hennig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+drug+resistance+in+pancreatic+cancer+organoids+guides+optimized+chemotherapy+treatment.">Detecting drug resistance in pancreatic cancer organoids guides optimized chemotherapy treatment.</a> The Journal of Pathology. 257 (5), 607-619 (2022).</li><li>D'Alterio, C., Scala, S., Sozzi, G., Roz, L., Bertolini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+effects+of+chemotherapy+on+tumor+relapse+and+metastasis+promotion.">Paradoxical effects of chemotherapy on tumor relapse and metastasis promotion.</a> Seminars in Cancer Biology. 60, 351-361 (2020).</li><li>Njoroge, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+model+distinct+Vitamin+E+effects+at+different+stages+of+prostate+cancer+evolution.">Organoids model distinct Vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).</li><li>Godet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate-mapping+post-hypoxic+tumor+cells+reveals+a+ROS-resistant+phenotype+that+promotes+metastasis.">Fate-mapping post-hypoxic tumor cells reveals a ROS-resistant phenotype that promotes metastasis.</a> Nature Communications. 10 (1), 4862 (2019).</li><li>Letai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+precision+cancer+medicine-moving+beyond+pure+genomics.">Functional precision cancer medicine-moving beyond pure genomics.</a> Nature Medicine. 23 (9), 1028-1035 (2017).</li></ol>

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

PDTO-läkemedelsscreening med medelhög till hög genomströmning förlitar sig ofta på avläsningar som bara extraherar en bråkdel av information som organoider potentiellt kan ge. Det har blivit allt tydligare att för att den snabbt utvecklande organoidtekniken ska kunna realisera större vetenskaplig och klinisk potential krävs mer avancerade 3D-analyser, avläsningar och analysmetoder kritiskt. Här beskrivs en avancerad screeningpipeline, som inte bara ökar reproducerbarheten utan också avsevärt förbättrar den kliniska översättningsförmågan genom att införliva en AI-driven, levande cellavbildningsavläsning. Förutom analysprogramvara som utvecklats internt implementeras användningen av det normaliserade läkemedelsresponsmåttet (NDR), vilket tydligt visar dess förmåga att definiera patientspecifika skillnader i behandlingssvar6. 
Införandet av detta normaliseringsmått kommer utan tvekan att vara av enormt värde, med tanke på att många studier syftar till att avgränsa behandlingssvar baserat på mindre skillnader i arean under kurvan (AUC) eller halv maximal hämmande koncentration (IC50) (eftersom de flesta dos-responskurvorna överlappar / ligger nära varandra)11,12 . Tillväxthastighetsmått har redan implementerats i screeningprotokoll för organoid läkemedel med hjälp av den ATP-baserade analysen men förlitar sig på normalisering av referensbrunnar som lyseras vid tidpunkt 04. Däremot möjliggör denna metod intrawell-tillväxthastighetsnormalisering, som inte bara står för interpatienta skillnader i PDTO-tillväxthastighet utan också interwell-skillnader som härrör från variationer i sådddensitet och plattplatsberoende effekter för att öka reproducerbarheten. Vidare anpassade vi NDR för att ytterligare öka separationen av interpatientt PDTO-svar genom att inkludera en positiv kontroll för normalisering 6,8.
Dessutom kan analysen, som är kompatibel med högkapacitets- och automatiseringsformat, exakt detektera enskilda organoidsvar, vilket möjliggör kvantifiering av subklonal resistens - den huvudsakliga drivkraften för tumöråterfall och progression13. Till exempel, även om PDAC052 och PDAC060 visade ett bra svar på behandlingen in vitro (baserat på NDR), kunde den ytterligare enorganoidanalysen upptäcka en liten (större population med PDAC060) population av subkloner som inte svarar på behandlingen. Intressant nog motsvarade detta starkt den kliniska observationen, med tanke på att PDAC052 och PDAC060 hade ett varaktigt svar (ingen tumöraktivitet upptäcktes) men så småningom diagnostiserades båda med lokal tumörprogression (på grund av närvaron av resistenta kloner). Jämfört med de konventionella 3D-avläsningarna (ATP-baserad analys och storlek/siffror) förväntas denna avancerade screeningpipeline öka den prediktiva prestandan genom att extrahera mer kliniskt relevant information från dessa "patienter-i-labbet". Denna hypotes testas nu genom screening av kliniska PDTO-prover i författarnas laboratorium med denna metod för att korrelera ex vivo med in vivo-svar och kliniskt resultat. 
För att få mer insikt i mekanismerna för ett läkemedelssvar är konventionella fluorescerande levande cellavbildningsreagenser, förutom cytotoxicitetsfärger, kompatibla med denna metod för att studera mekanismer för celldöd. Vi har tidigare visat kompatibiliteten hos denna metod med Sartorius Caspase 3/7 Green Reagens för att studera kaspasberoende induktion av apoptos efter cisplatinbehandling8. Kompatibiliteten med andra färgämnen för att studera oxidativ stress (CellROX-reagenser) eller hypoxi (Image-iT Hypoxia-reagenser) återstår att testa. Dessa reagenser har dock redan framgångsrikt använts i 3D in vitro-modellerna 14,15.
Bildanalysprogramvaran är också kompatibel med andra plattformat eller odlingsmetoder (t.ex. mikrokavitetsplattor, ECM-kupoler) om tydliga, fokusbilder av organoiderna kan tas. Detta är ofta utmanande för organoider odlade i kupoler eftersom de växer i olika z-plan, vilket kräver z-staplingsfunktionalitet hos mikroskopet som inte alltid är tillgängligt. Därför rekommenderar vi användning av ULA 384-brunnsmikroplattor med platt botten för att säkerställa bilder av tillräcklig kvalitet. 
Dessutom är analysen kompatibel med andra levande cellavbildningssystem, som tidigare visats för faskontrastbilder tagna med ett IncuCyte ZOOM-system8. En begränsning av Spark Cyto-avbildningssystemet för levande celler som användes i detta manuskript är kapaciteten på en platta för kinetiska mätningar. Spark Motion-expansionen ökar dock sin kapacitet till upp till 40 mikroplattor som kan screenas i bulk. Kompatibiliteten hos den egenutvecklade programvaran kommer att utökas till dessa och andra system för att erbjuda en plattformsoberoende lösning, med målet att standardisera och automatisera bild- och dataanalyspipelines. Den webbaserade applikationen kommer också att innehålla interaktiva grafverktyg och automatiserade läkemedelsmetriska beräkningar, som visas i detta dokument, för att minska manuell analystid.
Den etikettfria PDTO-segmenteringsalgoritmen tränades och testades på olika internt odlade sfäroid- och PDTO-modeller med distinkta morfologiska skillnader (fast, halvfast, cystisk) och kan följaktligen detektera dessa med hög noggrannhet8. En begränsning av modellen är att införandet av cystiska PDTO ökade den oönskade detekteringen av bubblor som finns i brunnen efter sådd. Inkubation över natten var dock tillräcklig för att avlägsna de flesta av dessa bubblor, vilket möjliggjorde en kvalitativ tidpunkt 0-skanning. Noggrannheten i den organoida bildsegmenteringen och metoden måste valideras av andra användare, och baserat på deras feedback kan programvaran tränas ytterligare för att få en robust och automatiserad bildanalysalgoritm. Dessutom strävar vi efter att erhålla fler kliniska data för att korrelera ex vivo-läkemedelssvaret kvantifierat med denna metod till det kliniska svaret hos patienten för att identifiera de bästa parametrarna för att förutsäga behandlingssvar och vidareutveckla denna metod för funktionell precisionscancermedicin16.

Under de senaste åren har upptäckt av cancerläkemedel , läkemedelsscreening och grundforskning övergått från användningen av traditionella tvådimensionella (2D) cancermodeller med förevigade cellinjer till mer fysiologiskt relevanta tredimensionella (3D) cancermodeller. Detta har stimulerat antagandet av tumörsfäroider med etablerade cancercellinjer, som återskapar mer komplexa cell-till-cell-interaktioner och strukturer som finns i solida tumörer. För närvarande är patient-härledda tumörorganoider (PDTO) den mest avancerade och fysiologiskt relevanta 3D-cancermodellen som finns tillgänglig för in vitro-cancerforskning , eftersom de ger ytterligare fördelar jämfört med tumörsfäroider, nämligen heterogeniteten som finns hos cancerpatienter1. PDTO etableras från tumörvävnad som härrör från cancerpatienter och behåller därför både tumörfenotypen och genotypen. Som sådan blir PDTO: er ovärderliga för grundläggande och translationell cancerforskning och har potential att avsevärt förbättra precisionsonkologi2. 
Trots sin lovande potential är dessa sofistikerade 3D-in vitro-cancermodeller ofta underutnyttjade på grund av brist på avancerade analysmetoder. Den vanligaste analysen bestämmer antalet livskraftiga celler i PDTO via kvantifieringen av intracellulär ATP3. Dessa analyser är normalt en enda tidpunkt, bulkanalyser, vilket förbiser kritiska tidsberoende svar och försummar klonala svar. Specifikt är förmågan att övervaka tillväxten av PDTO (tillväxthastighet) och deras svar på specifika terapier av stort intresse 4,5. Det normaliserade läkemedelssvaret (NDR), som poängsätter läkemedelssvar baserat på tillväxthastigheten normaliserad till ett positivt (ctrl+) och negativt kontrolltillstånd (ctrl-), har också nyligen rapporterats vara ett avgörande mått för att utvärdera cancerläkemedelskänslighet med cellbaserad screening, även om detta främst gjordes för 2D-cellinjer6. Därför behövs mer sofistikerade analysmetoder för att fullt ut dra nytta av dessa mer kliniskt representativa och komplexa 3D-cancermodeller. Mikroskopi anses vara ett kraftfullt tillvägagångssätt för att studera komplexiteten hos dessa organoidmodeller7.
Denna uppsats beskriver en metod för att övervaka kinetiska läkemedelssvar i 3D-cancermodeller, med hjälp av konventionella widefield-mikroskop och levande cellavbildningssystem. Anpassningar gjordes till protokollet som beskrivs av Driehuis et al.4 för att vara kompatibelt med automatisering med hjälp av en pipetteringsrobot, digital läkemedelsdispenser och levande cellavbildningssystem för att öka reproducerbarheten och minska antalet "praktiska" timmars arbete. Denna metod möjliggör läkemedelsscreening med medelhög till hög genomströmning av både tumörsfäroider med etablerade cancercellinjer (se tilläggstabell S1 för testade cellinjer), liksom PDTO: erna, i ett 384-brunns mikroplatt- och multiorganoidformat. Genom att använda en maskininlärningsprocess för faltningsnätverk kan automatiserad identifiering och spårning av enskilda tumörsfäroider eller PDTO: er utföras enbart från brightfield-avbildning och utan användning av fluorescerande levande cellmärkningsfärger8. Detta är mycket fördelaktigt, eftersom de flesta identifieringar med brightfield-avbildning kräver manuell annotering (vilket är mödosamt och tidskrävande) eller kräver tillsats av fluorescerande färgämnen, vilket kan förvirra läkemedelssvar relaterade till fotoxicitetsinducerad oxidativ stress9.
Den resulterande bildanalysprogramvaran som utvecklats internt utökar funktionaliteten hos konventionella levande cellavbildningssystem, eftersom 3D-bildanalysmoduler antingen inte är tillgängliga, plattformsbegränsade eller inte kompatibla med 384-brunns mikroplattor och helbrunnsavbildning. Dessutom är dessa moduler ofta högt prissatta och erbjuder begränsade bulkorganoidavläsningar. Därför är denna metod mycket relevant för forskare som har tillgång till allmänt tillgängliga levande cellavbildningssystem och syftar till att extrahera mer information om ett läkemedelssvar jämfört med den guldstandard men rudimentära ATP-baserade analysen. Med tillägg av specifika celldödsindikatorer kan cytostatikasvar särskiljas från cytotoxiska svar, vilket ger ytterligare insikt i mekanistiska läkemedelsåtgärder som för närvarande är ouppnåeliga från analys med en enda tidpunkt. Slutligen möjliggör levande cellavbildning individuell organoidspårning för att erhålla enstaka organoidläkemedelsresponsmått för att fånga responsheterogenitet och identifiera potentiella resistenta subkloner.
Målet med denna metod och tillhörande bildanalysprogramvara är att implementera billig automatisering i organoid läkemedelsscreening för att begränsa användarintervention och minska variationen i hantering, bildanalys och dataanalys. För att göra denna programvara tillgänglig för forskare är den mikroskop- och plattformsoberoende och en molnbaserad applikation görs tillgänglig. Genom att stödja konventionella levande cellavbildningssystem strävar vi därför också efter att förbättra deras funktionalitet för 3D-odlingsapplikationer och analys.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Channel p300 (GEN 2) pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom ULA microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4588</td>
			<td>minimum volume 50 &#181;L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom ULA Phenoplate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6057802</td>
			<td>minimum volume 75 &#181;L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A8301</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADF+++</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Advanced DMEM/F12, 1% GlutaMAX, 1% HEPES, 1% penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe easy sealing membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z380059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase 3/7 Green&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Slides for TC10/TC20</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1450017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td>ATP-assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler for 25 mL reservoir</td>
			<td>VWR (Diversified Biotech)</td>
			<td>490006-908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling element 12 x 8 x 3 cm</td>
			<td>Bol.com</td>
			<td>9200000107744702</td>
			<td>For custom microplate holder OT-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Organoid Harvesting Solution</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3700-100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2&#160;</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotox Green</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotox Red</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300e</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Digital drug dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300e Control v3.3.5</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Control software D300e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ADF+++ supplemented with 0.5 nM WNT surrogate-Fc-Fusion protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium, 4% Rpso3-Fc Fusion Protein conditioned medium, 1x B27, 1 mM N-acetyl cysteine (NAC), 5 mM nicotinamide, 500 nM A83-01, 100 ng/mL FGF10, and 10 nM Gastrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemcitabine</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) patient-derived organoids</td>
			<td>Biobank@uza (Antwerp, Belgium; ID: BE71030031000; Belgian Virtual Tumorbank funded by the National Cancer Plan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentrons App v6.0.1</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>OT-2 control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentrons Protocol Designer Tool</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>https://designer.opentrons.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbits data compression tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>www.orbits-oncology.com or contact corresponding author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbits image analysis webapp</td>
			<td>University of Antwerp</td>
			<td></td>
			<td>www.orbits-oncology.com or contact corresponding author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Pipetting robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipette 230 mm&#160;</td>
			<td>Novolab</td>
			<td>A33696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peniciline-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspo3-Fc Fusion Protein conditioned medium</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spark Cyto 600</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell imaging and multi-mode platereader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SparkControl v3.1</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Spark Cyto control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 25 mL reservoir</td>
			<td>VWR (Diversified Biotech)</td>
			<td>10141-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T8 plus cassette</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>233360010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT Surrogate-Fc-Fusion protein</td>
			<td>Immunoprecise</td>
			<td>N001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis

Patient-härledda tumörorganoider (PDTO) har ett stort löfte för preklinisk och translationell forskning och för att förutsäga patientterapisvaret från ex vivo-läkemedelsundersökningar . Nuvarande adenosintrifosfat (ATP)-baserade läkemedelsscreeningsanalyser fångar emellertid inte komplexiteten hos ett läkemedelssvar (cytostatika eller cytotoxisk) och intratumör heterogenitet som har visat sig behållas i PDTO på grund av en bulkavläsning. Live-cell imaging är ett kraftfullt verktyg för att övervinna detta problem och visualisera läkemedelssvar mer ingående. Bildanalysprogramvara är dock ofta inte anpassad till PDTO: s tredimensionalitet, kräver fluorescerande viabilitetsfärger eller är inte kompatibel med ett 384-brunns mikroplattformat. Detta dokument beskriver en halvautomatiserad metod för att fröa, behandla och avbilda PDTO: er i ett 384-brunnsformat med hög genomströmning, med hjälp av konventionella, bredfält, levande cellavbildningssystem. Dessutom utvecklade vi viabilitetsmarkörfri bildanalysprogramvara för att kvantifiera tillväxthastighetsbaserade läkemedelsresponsmått som förbättrar reproducerbarheten och korrigerar variationer i tillväxthastigheten mellan olika PDTO-linjer. Med hjälp av det normaliserade läkemedelsresponsmåttet, som poängsätter läkemedelssvar baserat på tillväxthastigheten normaliserad till ett positivt och negativt kontrolltillstånd, och ett fluorescerande celldödsfärgämne, kan cytotoxiska och cytostatiska läkemedelssvar lätt särskiljas, vilket förbättrar klassificeringen av responders och non-responders djupt. Dessutom kan läkemedelsrespons heterogenitet kvantifieras från enorganoid läkemedelsresponsanalys för att identifiera potentiella, resistenta kloner. I slutändan syftar denna metod till att förbättra förutsägelsen av kliniskt terapisvar genom att fånga en multiparametrisk läkemedelsresponssignatur, som inkluderar kinetisk tillväxtstopp och kvantifiering av celldöd.

Det automatiserade pipetteringsprotokollet säkerställer en jämn fördelning av PDAC_060 PDTO i alla kolumner på mikroplattan med 384 brunnar (figur 2A). Som förväntat observerades en variation i antal och medelarea för PDTO mellan brunnarna (figur 2A,B). Det totala överlevnadsområdet (totalt ljusfältsområde - totalt grönt område) kombinerar den etikettfria organoidsegmenteringen med den fluorescensbaserade celldödssignalen och är enligt vår erfarenhet den mest robusta parametern för att studera läkemedelssvar över tid (figur 2C)8. För att ta hänsyn till variationer i cellsådd och organoidstorlek bör tillväxthastighetsbaserade mätvärden användas för att minska variationerna mellan replikaten, vilket visas av de reducerade felstaplarna i figur 2D jämfört med figur 2C, och en högre Z-faktor som indikerar en starkt förbättrad läkemedelsskärmkvalitet (figur 2E).
NDR-dos-responskurvan (figur 2G), normaliserad till ctrl- och ctrl+, är klart överlägsen GR-dos-responskurvan (figur 2F), normaliserad till ctrl-, eftersom den ökar separationen av läkemedelsresponskurvorna och mer exakt representerar cytotoxiska läkemedelssvar. Ett exempel på associerade bilder för ctrl-, ctrl+- och 400 nM gemcitabin/80 nM paklitaxelbehandlad PDTO visas i figur 3. En intressant observation är att den cytotoxiska effekten av gemcitabin var dominerande i kombinationsbehandlingen eftersom inget mervärde av paklitaxel observerades.
Därefter användes ytterligare två PDTO-linjer, PDAC_052 och PDAC_087. En tydlig skillnad i tillväxthastighet mellan dessa linjer observerades (figur 4A), som stöder användningen av GR-mätvärden. Återigen resulterade NDR-dos-responskurvor (figur 4C) i ett ökat dynamiskt omfång och separation mellan de tre olika patienterna jämfört med GR-kurvorna (figur 4B). Dessutom möjliggör protokollet bestämning av NDR över tid och visar att PDAC_052 och PDAC_060 hade ett mycket liknande cytostatikasvar på en låg dos gem-pac (figur 4D), medan ett tydligt differentiellt cytostatika kontra cytotoxiskt svar kunde observeras för mitten (figur 4E) och höga doser (figur 4F) av gem-pac. Dessa läkemedelssvar överensstämde med de kliniska svar som observerades hos patienterna (figur 4G).
Slutligen är en stor fördel med tillvägagångssättet och programvaran att enorganoida läkemedelssvar kan kvantifieras för att studera heterogenitet och identifiera potentiellt resistenta subkloner. Figur 5 ger en tydlig översikt över klondynamiken hos de olika patienterna och visar att PDAC-087 hade de mest resistenta subklonerna efter behandlingen, vilket överensstämmer med den aggressiva och mycket resistenta sjukdom som observerats hos patienten. Intressant nog var denna patient också den minst känsliga för ctrl + staurosporin.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig01.jpg"> Bild 1: Arbetsflödesöversikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig02v2.jpg"> Figur 2: Seedningsnoggrannhet och läkemedelsresponsmått. (A) Organoidräkningar/brunn av PDAC_060 PDTO:er sådda i en 384-brunns mikroplatta med pipettroboten. Varje punkt representerar räkningen i en enda brunn och diagrammen separeras av de 384-brunns mikroplattkolumnerna. (B) Medelvärde PDTO-område/brunn. (C) Total överlevnadsareal (total ljusfältsareal - total grön areal) och (D) tillväxthastighet (total överlevnadsarea normaliserad till T0 = 1) av PDAC_060 PDTO behandlade med ett förhållande på 5:1 gemcitabin/paklitaxel. (E) Z-faktor som ett mått för analyskvalitet. (F) Tillväxthastighet-dosresponskurva normaliserad till ctrl- och (G) normaliserad läkemedelsresponskurva normaliserad till ctrl- och ctrl+. Felstaplar anger medelvärdet ± SD för två brunnar. Förkortningar: PDAC = bukspottkörtelkanal adenokarcinom; PDTO = patient-härledd tumörorganoid; GR = tillväxthastighet; NDR = normaliserat läkemedelssvar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig02largev2.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig03.jpg"> Bild 3: Exempelbilder. Representativa bilder av PDAC_060 PDTO som behandlats med vehikel (ctrl-), 400 nM gemcitabin/80 nM paklitaxel och 2 μM staurosporin (ctrl+). Den vänstra kolumnen visar ljusfältsbilder, den mellersta kolumnen visar Cytotox Green fluorescerande signal och den högra kolumnen visar de etikettfria kommenterade ljusfältbilderna med hjälp av organoidanalysmodulen. Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: PDAC = bukspottkörtelkanal adenokarcinom; PDTO = patient-härledd tumörorganoid; GemPac = gemcitabin/paklitaxel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig04.jpg"> Figur 4: Jämförelse av interpatientläkemedelssvar. (A) Jämförelse av tillväxthastighet (baserat på total överlevnadsarea) för PDAC_052, PDAC_060 och PDAC_087 PDTO-linjer. (B) Responskurva för tillväxtfrekvens-dos normaliserad till ctrl- och (C) normaliserad läkemedelsresponskurva normaliserad till ctrl- och ctrl+. Kinetisk NDR av en (D) låg, (E) mellersta och (F) hög dos av gemcitabin / paklitaxel (5: 1-förhållande). G) PDAC-patienters kliniska egenskaper. Felstaplar anger medelvärdet ± SD för två brunnar. Förkortningar: PDAC = bukspottkörtelkanal adenokarcinom; PDTO = patient-härledd tumörorganoid; GR = tillväxthastighet; NDR = normaliserat läkemedelssvar; FFX = folfirinox. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64434/64434fig05.jpg"> Figur 5: Enstaka organoidmått. Enstaka organoiddosrespons baserat på celldöd (grönt område/ljusfältsområde) och område (ljusfält) av PDAC_052, PDAC_060 och PDAC_087 PDTO:er som behandlats med vehikel (ctrl-), 400 nM gemcitabin/80 nM paklitaxel och 2 μM staurosporin (ctrl+). Gröna regioner indikerar livskraftiga organoider; blå regioner anger x-as intervall av GemPac- och ctrl+-diagram. Förkortningar: PDAC = bukspottkörtelkanal adenokarcinom; PDTO = patient-härledd tumörorganoid; GemPac = gemcitabin/paklitaxel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Cell suspension lager</td>
			<td>Celler/släpp</td>
			<td># Droppar (20 μL)</td>
			<td>Lager (1/3)</td>
			<td>ECM (2/3)</td>
		</tr><tr><td>1.13 × 107 celler/ml</td>
			<td>75,000</td>
			<td>10</td>
			<td>75 uL</td>
			<td>150 μL</td>
		</tr><tr><td>1,13 × 107 celler/ml</td>
			<td>75,000</td>
			<td>5</td>
			<td>40 uL</td>
			<td>80 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Utspädning för plätering i ECM-kupoler. Förkortning: ECM = extracellulär matris.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Förening</td>
			<td>Lagerkoncentration</td>
			<td>Utspädning</td>
			<td>Arbetskoncentration</td>
			<td>Lösningsmedel</td>
			<td>Väl koncentration</td>
			<td>Kommentarer</td>
		</tr><tr><td>Cytotox Grön</td>
			<td>1 mM (DMSO)</td>
			<td>1/10</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>60 nM</td>
			<td>Markör för celldöd</td>
		</tr><tr><td>Cytotox Röd</td>
			<td>1 mM (DMSO)</td>
			<td>1/10</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>250 nM</td>
			<td>Markör för celldöd</td>
		</tr><tr><td>Caspase 3/7 Grön</td>
			<td>5 mM (DMSO)</td>
			<td>1/2</td>
			<td>2,5 miljoner</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>2,5 μM</td>
			<td>Apoptotisk markör</td>
		</tr><tr><td>Hoechst</td>
			<td>20 mM (H2O)</td>
			<td>1/200</td>
			<td>100 μM</td>
			<td>0.33% interpolering/PBS</td>
			<td>50 nM</td>
			<td>Nukleär markör</td>
		</tr><tr><td>Staurosporin</td>
			<td>10 mM (DMSO)</td>
			<td>/</td>
			<td>1 - 10 mM</td>
			<td>/</td>
			<td>2 – 5 μM</td>
			<td>Positiv kontroll</td>
		</tr><tr><td>Gemcitabin</td>
			<td>10 mM (DMSO)</td>
			<td>/</td>
			<td>1 - 10 mM</td>
			<td>/</td>
			<td>Titrering</td>
			<td>Kemoterapi</td>
		</tr><tr><td>Paklitaxel</td>
			<td>10 mM (DMSO)</td>
			<td>/</td>
			<td>1 - 10 mM</td>
			<td>/</td>
			<td>Titrering</td>
			<td>Kemoterapi</td>
		</tr><tr><td>Cisplatin</td>
			<td>5 mM (0,9% NaCl)</td>
			<td>1/2</td>
			<td>2,5 miljoner</td>
			<td>0.6% interpolering/PBS</td>
			<td>Titrering</td>
			<td>Kemoterapi</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 2: Exempel på utspädningar av läkemedel som ofta används och fluorescerande reagenser. Varje förening måste lösas i antingen 100% DMSO eller 0.3% Tween / PBS.
Tilläggstabell S1: Översikt över kompatibla cancercellinjer. Statisk: sfäroider är inte migrerande. Slå samman: sfäroider migrerar mot varandra och smälter samman. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/64434_SuppTableS1%20(1).xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande fil 1: Beräkningsverktyg för organoid såddlösning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%201.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Tilläggsfil 2: STL-fil för 3D-utskrift av anpassad labware 'Microplate Holder'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%202.stl" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Tilläggsfil 3: STL-fil för 3D-utskrift av anpassad labware '2 x 25 ml reservoarhållare'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%203.stl" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Tilläggsfil 4: JSON-fil för anpassad labware-pipetteringsrobot 'Microplate Holder'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%204.json" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Tilläggsfil 5: JSON-fil för anpassad labware pipetting robot '2 x 25 ml Reservoir Holder_WithCooler'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%205.json" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Tilläggsfil 6: JSON-fil för pipetteringsrobotprotokoll 'Plating_ PDO_384well_Cooled_Row2-23'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%206.json" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande fil 7: Översikt över pipettingrobotens skrivbordsinställning. (A) Kylelement och (B) behållare och mikroplatta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%207.png" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Tilläggsfil 8: TDD-fil för protokoll för den digitala läkemedelsdispensern. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%208.tdd" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Tilläggsfil 9: XML-fil för protokoll för live-cell imager för brightfield och fluorescens avbildning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%209.xml" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Tilläggsfil 10: Exempel på plattkarta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2010.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Tilläggsfil 11: Exempel på indatafil för NDR R-skript. Förkortning: NDR = normaliserat läkemedelssvar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2011.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Tilläggsfil 12: Normaliserat läkemedelssvar NDR R-skript. Förkortning: NDR = normaliserat läkemedelssvar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2012.R" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Tilläggsfil 13: Exempel på utdatafil för GR-värden för NDR R-skript. Förkortningar: GR = tillväxthastighet; NDR = normaliserat läkemedelssvar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2013.csv" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Tilläggsfil 14: Exempel på utdatafil för NDR R-skript med GR-värden transponerade. Förkortningar: GR = tillväxthastighet; NDR = normaliserat läkemedelssvar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2014.csv" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Supplementary File 15: Exempel på utdatafil för NDR R-skript NDR-värden. Förkortning: NDR = normaliserat läkemedelssvar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2015.csv" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Tilläggsfil 16: Exempel på utdatafil för NDR R-skript med NDR-värden transponerade. Förkortning: NDR = normaliserat läkemedelssvar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64434/Supplementary%20File%2016.csv" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis at JoVE.com

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Detta protokoll beskriver en halvautomatisk metod för organoidläkemedelsscreeningar med medelhög till hög genomströmning och mikroskopagnostisk, automatiserad bildanalysprogramvara för att kvantifiera och visualisera multiparametriska, enorganoida läkemedelssvar för att fånga intratumor heterogenitet.

Multiparametrisk tumörorganoid läkemedelsscreening med hjälp av Widefield Live-Cell Imaging för bulk- och enorganoidanalys

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Detta protokoll gör det möjligt för forskare att inte bara effektivisera sin analyspipeline, utan det kommer också att göra det möjligt för dem att extrahera mer information ur sin organoidström, vilket förbättrar den translationella relevansen. Den största fördelen med detta protokoll är att det kombinerar ett strömlinjeformat arbetsflöde med en automatiserad och kliniskt relevant analyspipeline, vilket gör det möjligt för forskare att få en övertygande mängd information från en enda organoidskärm. Denna teknik kan användas för att förutsäga kliniskt behandlingssvar för cancerpatienter från dessa ex vivo organoidläkemedelsundersökningar med mycket lovande tidiga resultat.Målet är att göra mjukvarulösningsplattformen agnostisk så att forskare kan använda ett levande cellavbildningsinstrument som är tillgängligt för dem. Börja med att enzymatiskt dissociera de patient-härledda tumörorganoiderna, eller PDTO: erna, i den extracellulära matrisen, eller ECM, kupolerna i mikroplattan med sex brunnar. För detta, aspirera först mediet och tvätta ECM-kupolerna en gång med PBS.Tillsätt sedan två milliliter dissociationsenzym i brunnen. Pipettera innehållet upp och ner 10 gånger med en en-milliliters pipett för att mekaniskt dissociera organoiderna i kupolerna innan du inkuberar plattan i 10 minuter vid 37 grader Celsius. Efter inkubation, pipettera innehållet upp och ner och kontrollera om organoiderna är korrekt dissocierade till enskilda celler med hjälp av ett mikroskop.Samla cellsuspensionen i ett 15-millilitersrör och gör volymen upp till 10 ml genom att tillsätta ADF + Centrifugera röret vid 450 g i fem minuter vid rumstemperatur och aspirera supernatanten med en Pasteur-pipett och sugpump. Återsuspendera pelleten i 100 till 200 mikroliter av hela bukspottskörtelns duktala adenokarcinom, eller PDAC, organoidodlingsmedium beroende på pelletens storlek innan du räknar antalet celler med hjälp av en valfri metod. För att platta de enskilda cellerna i ECM-kupoler, späd lämplig mängd cellsuspension genom att tillsätta den erforderliga mängden tinad ECM.Pipettera sedan upp till 10 20-mikroliter droppar per brunn i en sexbrunnsplatta förvärmd till 37 grader Celsius. Vänd plattan och inkubera i 30 minuter vid 37 grader Celsius. Därefter överlägg brunnarna med hela mediet kompletterat med 10-mikromolar Y-27632 och inkubera i två till tre dagar i en inkubator.För att skörda de två till tre dagar gamla organoiderna, aspirera först mediet och tvätta organoiderna en gång med PBS. Tillsätt sedan en till två milliliter organoidskördlösning, förkyld till fyra grader Celsius, till en brunn på sexbrunnsplattan beroende på antalet ECM-kupoler. Inkubera plattan som hålls på is, på en skakningsplattform i 10 minuter.Dissociera nu ECM-kupolerna genom att pipettera innehållet i brunnarna upp och ner med en milliliter pipett. Återigen inkubera organoiderna i 10 minuter på is innan du visuellt bekräftar dissociationen av ECM-kupolerna under ett mikroskop. Samla organoiderna i ett 15-milliliters rör, förbelagt med 0,1% BSA i PBS, och fyll upp volymen till 10 ml genom att tillsätta ADF + Centrifugera röret vid 200 g i fem minuter vid fyra grader Celsius.Därefter aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten beroende på dess storlek i upp till en milliliter fullt PDAC-organoidmedium till önskad slutlig organoidkoncentration. Öppna pipetteringsrobotkontrollapplikationen, välj Protokoll och klicka på Importera innan du drar och släpper den medföljande tilläggsfilen 6 i det angivna fältet. Välj det importerade protokollet.Och enligt layouten som visas i fältet Däckinställning, placera alla labware, inklusive kylelement och plastvaror, i däcken. Använd den vänstra slitsen för 25-milliliter behållaren och kylelementet. Klicka sedan på Kör protokoll och fortsätt till installationen.Öppna fliken Labware Setup, klicka på Kör Labware Position Check och följ instruktionerna för att kalibrera pipetteringsroboten till den nya hårdvaran. Fyll 25-millilitersbehållaren, placerad ovanpå kylelementet, med den kylda organoidsåddlösningen och klicka på Starta körning för att sätta pipetteringsroboten i aktion. Centrifugera sedan mikroplattan med en hastighet av 100 g i en minut vid fyra grader Celsius.För att skapa läkemedelsdispenseringsprotokollet med hjälp av den digitala läkemedelsdispenserkontrollprogramvaran, håll muspekaren över platta 1 ovanför plattlayouten. Välj Redigera plattattribut och fyll i platttypen som 384 brunn, den extra volymen som 50 mikroliter och DMSO-gränsen som 1% Lägg till vätskor genom att klicka på additionsknappen bredvid Vätskor och dubbelklicka på den nyskapade vätskan för att namnge den. Välj sedan klassen som DMSO-baserad eller vattenhaltig plus Tween 20 och fyll i koncentrationen.För att skapa plattlayouten för läkemedelstitrering, välj Wells och klicka på Titrering. För vätska, välj läkemedlet av intresse, tillsammans med önskad högsta koncentration och lägsta koncentration. För repliker väljer du minst två och väljer önskat titreringsmönster.För att skapa plattlayouten för den positiva kontrollen, välj tre brunnar, klicka på Ange värde och fyll i tvåmikromolärt staurosporin från ett 10-millimolärt lager i DMSO för att inducera maximal celldöd. För Cytotox Green, välj alla använda brunnar, klicka på Ange värde och ange ett värde på 60 nanomolar per brunn. För negativ kontroll och DMSO-normalisering, välj alla brunnar med ytterligare fyra brunnar för fordonskontrollen.Högerklicka nu och välj Normalisering innan du tilldelar den normaliserade fluidklassen som DMSO-baserad. Normalisera sedan till den högsta klassvolymen för att få en lika DMSO-koncentration i varje brunn. Klicka sedan på pilen under Kör i det övre vänstra hörnet och välj Simulera alltid, följt av att klicka på Simulera för att identifiera eventuella fel och få volymerna för varje läkemedel som ska förberedas.Avmarkera nu Simulera alltid under knappen Kör innan du klickar på Kör för att starta läkemedelsdispenseringsprotokollet och följ instruktionerna. Applicera tätningsmembranet på mikroplattan för att förhindra avdunstning. Öppna programvaran för kontroll av live-cell-avbildningar och välj Metodredigerare ny innan du går till Arkiv för att importera XML-exempelmetoden.Alternativt kan du följa instruktionerna i manuskriptet för att skapa en ny fil. Klicka sedan på Start för att initiera skanningen vid T0.To slå samman och komprimera data, skapa en ny överordnad mapp för att överföra alla enskilda experimentmappar som genereras för varje skanning vid varje tidpunkt av live-cell imager-kontrollprogramvaran och namnge respektive mappar genom att följa instruktionerna i manuskriptet. Förbered en XLSX-plattkarta i den digitala läkemedelsdispenserkontrollprogramvaran genom att högerklicka på plattkartlayouten från läkemedelsdispenseringsprotokollet och kopiera alla brunnar för att klistra in data i en XLSX-fil.Ta bort Cytotox Green och staurosporindata, lägg till en matris för cellinje och ange en negativ kontroll och positiv kontroll. Öppna datakomprimeringsverktyget. Klicka på Sök, välj den överordnade mappen och klicka på Komprimera för att initiera bilddatakomprimering.Alla TIFF-bildfiler komprimeras till en enda HDF5 för varje brunn i en ny datauppsättningsmapp i föräldramappen. För att analysera bilderna, gå till webbappplattformen för bildanalys, logga in och klicka på Lägg till nytt projekt på fliken Start. Ange projektnamnet, tryck på Fortsätt och välj Lägg till nytt experiment innan du laddar upp datauppsättningsmappen som innehåller HDF5-filerna.Efter uppladdning, gå till projekt- och experimentmappen för att klicka på Ladda upp plattkarta för ytterligare funktioner. Klicka sedan sekventiellt på Kör analys, välj Multi-Organoid Analysis, Standardparametrar och slutligen Analysera för att initiera bildanalys. Klicka på Ladda ner resultat för att ladda ner rådatatabellerna, som innehåller mätningarna för varje brunn och de segmenterade bilderna eller videorna innan du bekräftar analysens noggrannhet för vidare databehandling.För att ta hänsyn till variationerna i organoid sådddensitet och storlek användes tillväxthastighetsbaserade mätvärden för att minska variationerna mellan replikaten, vilket indikeras av de reducerade felstaplarna. Bilderna för den negativa kontrollen, den positiva kontrollen och den kombinerade gemcitabin- och paklitaxelbehandlade PDTO visade att terapin främst inducerade tillväxtstopp med en begränsad mängd celldöd, motsvarande normaliserat läkemedelssvar, eller NDR, värde strax under noll. Vid användning av ytterligare två linjer, PDAC_052 och PDAC_087, observerades en tydlig skillnad i tillväxthastighet mellan de tre linjerna, vilket stödde användningen av GR-mätvärden.NDR-dos-responskurvorna resulterade i ett ökat dynamiskt omfång och separation mellan de tre olika patienterna, jämfört med GR-kurvorna. Bestämning av NDR över tid visade att PDAC_052 och PDAC_060 hade ett mycket liknande cytostatikasvar på en låg dos gemcitabin-paklitaxel, medan ett tydligt differentiellt cytostatika kontra cytotoxiskt svar kunde observeras för motsvarande mellersta och höga doser. Dessa läkemedelssvar överensstämde med de kliniska svar som observerades hos patienterna.Den klonala dynamiken avslöjade att PDAC_087 hade de mest resistenta subklonerna efter behandling, vilket överensstämmer med den aggressiva karaktären hos sjukdomen som observerats hos patienten, som intressant nog också var minst känslig för den positiva kontrollen staurosporin. Den viktigaste aspekten av protokollet är att hålla alla lösningar som innehåller ECM kylda under sådden eftersom felaktig stelning av ECM kan störa nedströms bildanalys. Automatiseringen av det våta laboratoriearbetet, bildanalysen och databehandlingen nedströms kan vara till hjälp för att påskynda forskningen och lättare identifiera nya kombinationsterapier.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Enkel och snabb metod att få hög kvalitet tumör DNA från klinisk-patologiska exemplar med Touch avtryck cytologi

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuklid-fluorescens Reporter gen Imaging för att spåra tumör Progression i gnagare tumör modeller

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generation av High-Throughput tredimensionella tumör Spheroids för drogkontroll

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-Cell Imaging analyser för studien Glioblastoma hjärnan tumören Stem cellmigration och Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

Analys av Cancer Cell Invasion och anti metastaserande Drug Screening med hjälp av Hydrogel Micro-kammare Array (HMCA)-baserade plattor

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

En enkel Migration/Invasion arbetsflöde med hjälp av en automatiserad Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Etablering och karakterisering av små tarm neuroendokrina tumör spheroids

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

En ny Stromal Fibroblast-Modulerad 3D Tumör Spheroid modell för att studera tumör-Stroma interaktion och drug discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Läkemedelsscreening av primär patient härledd tumör Xenografts i Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...