Name: establishing 3d endometrial organoids from the mouse uterus
Uploaded: 2023-01-06T13:10:00
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我们感谢Stephanie Pangas博士和Martin M. Matzuk博士（M.M.M.）对我们手稿的批判性阅读和编辑。研究得到了 Eunice Kennedy Shriver 国家儿童健康与人类发展研究所拨款R00-HD096057（D.M.），R01-HD105800（D.M.），R01-HD032067（M.M.M.）和R01-HD110038（M.M.M.）以及NCI-P30癌症中心支持补助金（NCI-CA125123）的支持。Diana Monsivais博士持有Burroughs Wellcome Fund颁发的下一代怀孕奖。

小鼠处理和实验研究是根据贝勒医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的协议以及NIH实验动物护理和使用指南制定的指南进行的。
1.使用酶和机械方法从小鼠中分离子宫上皮
注意：本节描述了使用凝胶基质支架建立，传代，冷冻和解冻小鼠上皮子宫内膜类器官所需的步骤。先前的研究已经确定，小鼠子宫内膜类器官的最佳培养物是在?...

在这里，我们描述了从小鼠子宫内膜生成子宫内膜上皮类器官的方法以及常规用于其下游分析的方案。子宫内膜类器官是研究控制子宫内膜相关疾病（如子宫内膜异位症、子宫内膜癌和植入失败）的机制的有力工具。2017年发表的具有里程碑意义的研究报告了长期和可再生培养小鼠和人类上皮子宫内膜类器官的条件4，5。尽管类器官已被广泛用于研究其?...

子宫内膜 - 子宫腔的内衬粘膜组织 - 是一种独特且高度动态的组织，在女性的生殖健康中起着关键作用。在生殖寿命期间，子宫内膜有可能经历数百个增殖，分化和分解的循环，由卵巢激素 - 雌激素和孕激素的协调作用协调。对基因工程小鼠的研究揭示了支撑子宫内膜对激素反应和控制胚胎植入、基质细胞蜕膜化和怀孕的基本生物学机制1。然而，由于难以在传统的2D细胞培养物中维持未转化的原代小鼠子宫内膜组织，体外研究受到限制2，3。子宫内膜组织培养为3D器官系统或类器官的最新进展为研究控制子宫内膜细胞再生和分化的生物学途径提供了新的机会。小鼠和人子宫内膜类器官系统已由封装在各种基质中的纯子宫内膜上皮4，5开发而人子宫内膜已培养为无支架上皮/基质共培养物6，7，最近作为胶原封装的上皮/基质组合8 .上皮类器官培养物的生长和再生潜力得到了生长因子和小分子抑制剂的定义混合物的支持，这些生长因子和小分子抑制剂已被经验确定为最大化类器官的生长和再生4，5，9。此外，冷冻和解冻子宫内膜类器官的能力允许长期储存来自小鼠和人类的子宫内膜类器官，用于未来的研究。
基因工程小鼠揭示了控制早期怀孕和蜕膜化的复杂信号通路，并已被用作妊娠丢失，子宫内膜癌和子宫内膜异位症的模型。这些遗传研究主要是通过使用在女性生殖组织中特别活跃的cre重组酶对loxP侧翼等位基因（“floxed”）的细胞特异性缺失来实现的。这些小鼠模型包括广泛使用的黄体酮受体-cre10，其在子宫内膜上皮和基质组织中具有很强的重组酶活性，乳铁蛋白i-cre，诱导成年小鼠子宫内膜上皮重组11，或Wnt7a-cre，在Müllerian衍生组织中触发上皮特异性缺失12.将基因工程小鼠模型中的子宫内膜组织培养为3D类器官为研究子宫内膜生物学提供了绝佳的机会，并促进了控制子宫内膜细胞更新和分化的生长因子和信号通路的鉴定13，14。文献中描述了小鼠子宫内膜组织的分离和培养方法，并报道了使用各种酶促策略分离子宫上皮以随后培养子宫内膜上皮类器官4。虽然以前的文献为子宫内膜上皮类器官培养方案提供了关键框架4，5，6，但本文为生成，维持，处理和分析这些类器官提供了一种清晰，全面的方法。这些技术的标准化对于加速妇女生殖生物学领域的进步非常重要。在这里，我们报告了一种酶促和机械纯化小鼠子宫内膜上皮组织的详细方法，用于随后在凝胶基质支架中培养子宫内膜类器官。我们还描述了凝胶基质封装的小鼠子宫内膜上皮类器官的下游组织学和分子分析方法。

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	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Organoid Media Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from Bovine Pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1426-1G</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27&#8482; Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587010</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>1.25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030024</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Rspondin-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-38</td>
			<td>500 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human HGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT3a</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td>200 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other supplies and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td>5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DN25-100MG</td>
			<td>2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170112</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;Polystyrene Microplates (24-Well)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#08-772-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;Polystyrene Microplates (12-Well)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#0877229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainers, 40 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA MiniPrep (50 &#181;g)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>11-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6765-500ML</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Estratiol (E2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1024-1G</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15710</td>
			<td>4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1000961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>64-010-15&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof (100%)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-032-601&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoclear</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-899-90147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-277-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Nylon Biopsy Bags</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6774010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel Specimen Processing Gel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83009-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution Premium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95057-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y (yellowish) solution Premium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95057-848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS Buffer, 20X, pH 7.4</td>
			<td>GenDEPORT</td>
			<td>T8054</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST (10X), pH 7.4</td>
			<td>GenDEPORT</td>
			<td>T8056</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0759-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td>3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution (1 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Nail Polish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1849418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22037246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11755050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4364346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krt8 Antibody (TROMA-I)&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>TROMA-I&#160;</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin Antobody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5741S</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary 
			Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21209</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary 
			Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Sequence</td>
			<td>Forward (5&#39;-3&#39;)</td>
			<td>Reverse (5&#39;-3&#39;)</td>
			<td>_</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipocalin 2 (Lcn2)</td>
			<td>GCAGGTGGTACGTTGTGGG</td>
			<td>CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactoferrin (Ltf)</td>
			<td>TGAGGCCCTTGGACTCTGT</td>
			<td>ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone (Pgr)</td>
			<td>CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC</td>
			<td>TAACTTCAGACATCATTTCCGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh)</td>
			<td>CAATGTGTCCGTCGTGGATCT</td>
			<td>GCCTGCTTCACCACCTTCTT</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing 3d endometrial organoids from the mouse uterus

子宫内膜组织排列在子宫内腔，并受到雌激素和孕激素的周期性控制。它是一种由管腔和腺体上皮、基质隔室、血管网络和复杂免疫细胞群组成的组织。小鼠模型一直是研究子宫内膜的有力工具，揭示了控制植入、胎盘和癌症的关键机制。3D子宫内膜类器官培养的最新发展提供了一个最先进的模型来剖析子宫内膜生物学的信号通路。从基因工程小鼠模型中建立子宫内膜类器官，分析其转录组并以单细胞分辨率可视化其形态是研究子宫内膜疾病的关键工具。本文概述了建立小鼠子宫内膜上皮3D培养的方法，并描述了量化基因表达和分析类器官组织学的技术。目标是提供可用于建立、培养和研究子宫内膜上皮类器官的基因表达和形态特征的资源。

小鼠子宫内膜类器官的相衬图像 我们从WT小鼠子宫内膜上皮建立了类器官，如所附方案所述（见 图1中的图表）。在对小鼠子宫内膜上皮进行酶解离后，将上皮片与子宫基质细胞机械分离，并进一步与胶原酶解离以产生单细胞悬液。如果正确执行，这种上皮和基质细胞分离方法应产生污染不超过相反细胞类型10%-15%的样品（参见 图2中的免...

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Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

该协议描述了建立小鼠子宫内膜上皮类器官以进行基因表达和组织学分析的方法。

从小鼠子宫建立3D子宫内膜类器官

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

该协议意义重大，因为它显示了从小鼠子宫中分离高纯度子宫上皮以进行子宫内膜类器官培养的分步方法。该方法有效地利用酶和机械解离来分离子宫上皮。这些技术被简化为建立、治疗和分析源自分离上皮的子宫内膜上皮类器官。使用前首先在冰上解冻凝胶基质约一到两个小时。然后解剖安乐死的小鼠，用剪刀在腹部做一个中线切口，轻轻剥开皮肤，露出下面的腹膜层。通过将腹部脂肪垫轻轻移到一边来定位子宫角，并将子宫角保持在宫颈交界处，然后沿着肠系膜脂肪切割它们。解剖小鼠子宫后，用小剪刀彻底去除子宫角上的脂肪组织。完成后，将每个子宫角切成小碎片，每个碎片的尺寸约为四到五毫米。将来自一个子宫的所有子宫碎片放入含有0.5毫升1%胰蛋白酶的24孔板的一个孔中。然后将 24 孔板在 37 摄氏度的加湿组织培养箱中孵育约 1 小时，以酶促分离子宫内膜上皮与底层基质。孵育后，将子宫碎片转移到含有一毫升Dulbecco磷酸盐缓冲溶液或DPBS的35毫米组织培养板中。接下来，在解剖显微镜下将子宫上皮与子宫管分离，方法是用镊子握住子宫碎片的一端，轻轻地将移液器尖端纵向穿过碎片，将上皮挤出子宫管的另一端。然后在解剖显微镜下观察从子宫碎片分离的上皮片。接下来，使用一毫升移液管轻轻地将所有上皮片转移到同一个 1.5 毫升管中。并通过以375×g离心五分钟来沉淀解离的上皮片。小心地除去上清液而不干扰细胞沉淀，并将细胞沉淀重悬于0.5毫升2.5毫克/毫升胶原酶加上每毫升2毫克DNA溶液中。上下移液约10次或直到达到单细胞悬液。接下来，加入 0.5 毫升 DMEM F/12 加 10% 胎牛血清或 FBS 加抗生素，并以 375 x g 离心细胞五分钟。除去上清液，将细胞重悬于一毫升DMEM / F12加10%FBS加抗生素中，然后离心细胞。将凝胶基质放在冰上，直到准备好。接下来，从离心细胞中取出上清液，并使用20倍于凝胶基质体积的细胞沉淀重悬细胞沉淀，而不引入气泡。让凝胶基质细胞悬液在室温下沉降约10分钟。一旦凝胶基质细胞悬液变成半固体凝胶，使用宽孔200微升尖端的P200微量移液器，轻轻吸出25微升凝胶基质细胞悬液。在 12 孔板的每个孔中分配三个独立的 25 微升圆顶，让凝胶基质固化 15 分钟和 37 摄氏度加湿组织培养箱。凝胶基质固化后，向每个含有凝胶基质圆顶的孔中加入750微升类器官培养基，并在37摄氏度的加湿组织培养箱中培养箱。小鼠子宫内膜类器官的相差图像显示，上皮和基质细胞分离产生的样品对相反细胞类型的污染不超过10%至15%。子宫内膜上皮细胞在三到四天内组装成类器官。切片的福尔马林固定石蜡包埋子宫内膜类器官通过苏木精和伊红染色剂可视化，其显示单层上皮和空心中心，即类器官的管腔。荧光显微镜成像显示，类器官中的所有细胞均为细胞角蛋白8阳性，并含有DAPI，表明子宫内膜类器官的固定、包埋和处理与基于抗体的免疫染色相容。实时定量PCR显示，10 nmol雌二醇刺激增加了上皮类器官中脂质运载蛋白2、乳铁蛋白和孕酮受体的表达，表明子宫内膜上皮类器官可以成功用于测量雌二醇响应的基因表达变化。重要的是要确保在机械解离步骤中获得子宫内膜上皮的清晰分离。人们应该能够观察到从子宫管中出现的上皮。其他方法包括通过封装到凝胶基质中来建立上皮类器官。如果需要，可以进一步消化基质区室以创建3D上皮基质共培养物。该方法可以帮助回答有关控制子宫内膜更新的信号的问题。它可以帮助治疗女性的疾病，如子宫内膜异位症、妊娠丢失和癌症。

Research

JoVE Journal

Biology

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科研

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诱导多能干细胞来源于小鼠的生成

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

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The lack of a robust in vitro model of the human respiratory epithelium hinders the understanding of the biology and pathology of the respiratory system. ...